本發(fā)明涉及孔雀石綠檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種利用離子遷移譜技術(shù)快速檢測水產(chǎn)品/水體中的孔雀石綠殘留混合物的方法。
背景技術(shù)：
：離子遷移譜技術(shù)（ims，ionmobilityspectrometer）是在20世紀(jì)70年代初出現(xiàn)的一種新的氣相分離和檢測技術(shù)。離子遷移譜技術(shù)借助色譜保留時(shí)間的概念，以離子漂移時(shí)間的差別來進(jìn)行離子的分離定性。在早期的研究工作中，ims裝置結(jié)構(gòu)簡單和靈敏度高，檢出限達(dá)ng甚至pg級(jí)，引起了人們極大的興趣。ims探測極限一般在10-10g左右，探測的時(shí)間一般不會(huì)超過20s，好的儀器可在10s之內(nèi)。除此之外，ims還被用來進(jìn)行大氣污染以及化學(xué)工廠中的有毒氣體監(jiān)測，火災(zāi)監(jiān)測，水污染監(jiān)測等環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。在食品安全方面，已有文獻(xiàn)報(bào)道將ims應(yīng)用于食品安全方面，如食品儲(chǔ)存、檢測分析等。但目前尚未應(yīng)用于孔雀石綠的檢測?？兹甘G（malachitegreen）又名堿性綠、嚴(yán)基塊綠，是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，屬于三苯甲烷類化合物，易溶于水，溶液呈藍(lán)綠色，溶于甲醇、乙醇和戊醇。過去常被用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品染色劑和細(xì)胞化學(xué)染色劑。可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，曾在很多國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中被廣泛使用。在運(yùn)輸過程中和存放池內(nèi)，為了使磷片受損的魚延長生命，也常使用孔雀石綠?？兹甘G具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用，當(dāng)其進(jìn)入生物體內(nèi)，就會(huì)加速代謝生產(chǎn)具有更強(qiáng)危害的隱性孔雀石綠。鑒于此，許多國家均將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。我國于2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》（農(nóng)業(yè)部公告193號(hào)）中。國家農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局把孔雀石綠監(jiān)測列入每年水產(chǎn)品的監(jiān)控計(jì)劃，明確嚴(yán)令禁止在所有食用動(dòng)物中使用。但因其價(jià)格低廉，在水霉病防治方面尚無很好的替代品，因此目前仍有單位在繼續(xù)違規(guī)使用。雖國家明令禁止孔雀石綠在水產(chǎn)品中的使用，但對(duì)于流通速度較快的生鮮水產(chǎn)品中的孔雀石綠的監(jiān)管仍缺乏有效的手段，特別是現(xiàn)場快速檢測技術(shù)的不完善，也是導(dǎo)致孔雀石綠殘留情況是目前屢禁不止的原因之一。據(jù)文獻(xiàn)可知，深圳的水產(chǎn)品有約6%的孔雀石綠的檢出率，其中如黃骨魚、鱸魚、大頭魚、鯽魚等魚類產(chǎn)品是發(fā)現(xiàn)孔雀石綠違法添加概率較高的品種。目前孔雀石綠檢測方法大致分為精確定量檢測和快速定性篩查兩大類。定量檢測方法主要包括高效液相色譜-紫外可見光檢測法（hplc-uv）、高效液相色譜-（串聯(lián)）質(zhì)譜法（hplc-ms/ms）、高效液相色譜-熒光檢測法（hplc-fld）等。已有的檢測水產(chǎn)品孔雀石綠的國家標(biāo)準(zhǔn)gb/t19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》和農(nóng)業(yè)部發(fā)布的sc/t3021-2004《水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定——液相色譜法》。定量檢測方法檢測靈敏度高、準(zhǔn)確度高，但其繁瑣的前處理、冗長的檢測周期及高額的檢測費(fèi)用明顯不適用于鮮活水產(chǎn)品的日常食品安全監(jiān)管。目前市售的檢測孔雀石綠快速檢測方法相對(duì)比較成熟，但仍然存在不足之處?？兹甘G快速定性檢測法主要為膠體金試劑盒，因其反應(yīng)原理極易受基質(zhì)干擾，這些快檢試劑盒仍存在前處理復(fù)雜、假陽性率偏高、檢測靈敏度低等問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有的技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種快速檢測水產(chǎn)品/水體中的孔雀石綠殘留混合物的方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下所述：基于離子遷移技術(shù)快速檢測孔雀石綠殘留混合物的方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1、基于孔雀石綠有證標(biāo)物制備孔雀石綠檢測用標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其放入到離子遷移譜中，獲得孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子遷移譜譜圖；步驟2、制備待測樣品，將已勻漿的待測樣品至于離心管中，進(jìn)行快速樣品前處理，將其濃縮液放入到離子遷移譜進(jìn)樣器中，獲得該待測樣品溶液的離子遷移譜圖；步驟3、將待測樣品溶液的離子遷移譜譜圖和標(biāo)準(zhǔn)使用液的離子遷移譜圖進(jìn)行比較，定性待測樣品是否含有孔雀石綠殘留物。根據(jù)上述方案的本發(fā)明，其特征在于，所述步驟1中制備預(yù)置孔雀石綠檢測用標(biāo)準(zhǔn)溶液包括：稱取預(yù)置量的孔雀石綠固體標(biāo)準(zhǔn)用品，用有機(jī)溶劑乙腈稀釋并儲(chǔ)存；使用時(shí)將儲(chǔ)存的孔雀石綠稀釋液用水/乙腈稀釋成孔雀石綠檢測用標(biāo)準(zhǔn)溶液備用上機(jī)檢測；以其標(biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)離子遷移率作為參照定性待測樣品中孔雀石綠殘留物。根據(jù)上述方案的本發(fā)明，其特征在于，所述孔雀石綠包括顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠。根據(jù)上述方案的本發(fā)明，其特征在于，所述步驟2中制備水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣待測樣品前處理包括：取上清水樣置于離心管中進(jìn)行乙腈和二氯甲烷液液萃取后，濃縮后的濃縮液過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液；取上清水樣直接過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液，分別作為待測樣品溶液。根據(jù)上述方案的本發(fā)明，其特征在于，所述步驟2中制備水產(chǎn)品樣品待測樣品前處理包括：利用快速樣品前處理技術(shù)凈化樣品提純，濃縮后濃縮液過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液作為待測樣品溶液。更進(jìn)一步的，所述濃縮法為氮吹法。更進(jìn)一步的，所述凈化法為quechers法。更進(jìn)一步的，將酸性氧化鋁：丙磺酸以2:1比例配比去除芳香族和脂肪族化合物雜質(zhì)，加入25ml洗脫液，震蕩混勻10min，并進(jìn)行9500r/min離心分離5min。更進(jìn)一步的，所述洗脫液的制備過程為：在13.5ml的乙酸乙酯中加入1.5ml氨水，再加入10ml的甲醇，震蕩混勻。根據(jù)上述方案的本發(fā)明，其有益效果在于，本發(fā)明采用農(nóng)產(chǎn)品快速樣品前處理技術(shù)，相比于同等作用的固相萃取柱技術(shù)，更節(jié)約成本，節(jié)省時(shí)間，30min即可完成樣品前處理技術(shù)，通過使用離子遷移譜技術(shù)的檢測方法，簡單、方便快速的定性孔雀石綠殘留物，具有快速，高效、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)本發(fā)明前處理過程，引進(jìn)固液萃取、液液萃取等簡單、低成本、易操作、易推廣的凈化方法，屬于高效環(huán)保型高通量快速定性篩查方法，極大的提高孔雀石綠的快速檢測效率，填補(bǔ)了水產(chǎn)品孔雀石綠檢測試劑盒的空白。附圖說明圖1為本發(fā)明0.1ug/ml的顯性孔雀石綠(mg)離子遷移譜圖。圖2為本發(fā)明0.1ug/ml的隱色孔雀石綠(lmg)離子遷移譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖以及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述：如圖1-2所示，一種利用離子遷移譜技術(shù)檢測水產(chǎn)品/水體中孔雀石綠殘留混合物的方法，該方法包括：1、基于孔雀石綠有證標(biāo)物制備孔雀石綠檢測用標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其放入到離子遷移譜中，獲得孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子遷移譜譜圖。步驟1、分別準(zhǔn)確稱取一定量的顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋至容量瓶中，配制顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并貯存在密閉的棕色標(biāo)準(zhǔn)品瓶中，在使用時(shí)分別用乙腈/水稀釋成1.0ug/ml的顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)使用液，并配置成0.1ug/ml顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液。步驟2、用20μl微量移液器吸取孔雀石綠混合實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液5μl，注入離子遷移譜儀中，以相對(duì)離子遷移率k0，即圖2中的k0定性，繪制顯性孔雀石綠、隱色孔雀石綠特征峰。使用的離子遷移譜儀測試參數(shù)為：離子源：非放射性電離源工作電壓：220v/50hz氣源（獨(dú)立氣源）：干燥空氣遷移電場強(qiáng)度：（200-500）v/cm遷移管溫度：200℃進(jìn)樣量：5μl進(jìn)樣溫度：（170-250）℃測試時(shí)間：70s2、制備待測樣品，將已勻漿的待測樣品至于離心管中，通過快速樣品前處理技術(shù)凈化（quechers法）、濃縮（氮吹）等前處理方法，將其濃縮液放入到離子遷移譜進(jìn)樣器中，獲得該待測樣品溶液的離子遷移譜圖。在檢測水產(chǎn)品/水體中孔雀石綠（包括顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠）的含量時(shí)，包含以下步驟：（1）當(dāng)制備水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣時(shí)，步驟1，獲取水產(chǎn)養(yǎng)殖水樣：取50ml樣品上清液至250ml分液漏斗中，與乙腈和二氯甲烷進(jìn)行液液萃取后，取下層萃取液氮吹至干。步驟2，濃縮液過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液；也可取上清水樣直接過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液，分別作為待測樣品溶液。步驟3，取5μl待測樣品溶液放入離子遷移譜儀中進(jìn)行測試，測試時(shí)間70s。（2）當(dāng)制備水產(chǎn)品樣品時(shí)：步驟1、取5.00g均質(zhì)置于50ml離心管中，加入1.5ml20%鹽酸羥胺溶液、2.5ml對(duì)甲苯磺酸溶液、5.0ml乙酸鹽緩沖溶液、10ml乙腈震蕩混勻，8000r/min離心10min，取上清液；步驟2、上述上清液利用quechers法快速樣品前處理技術(shù)進(jìn)行凈化提純（酸性氧化鋁：丙磺酸以2:1比例配比用于去除芳香族和脂肪族化合物等雜質(zhì)，25ml洗脫液（13.5ml的乙酸乙酯中加入1.5ml氨水，再加入10ml的甲醇，震蕩混勻10min，9500r/min離心5min），氮吹濃縮液過0.22μm水相微孔濾膜，收集濾液作為待測樣品溶液。步驟3、取5μl待測樣品溶液放入離子遷移譜儀中進(jìn)行測試，測試時(shí)間70s。3、將待測樣品溶液的離子遷移譜譜圖和標(biāo)準(zhǔn)使用液的離子遷移譜圖進(jìn)行比較，定性其是否含有孔雀石綠殘留物。將測試得到的水產(chǎn)品/水樣離子遷移譜譜圖與孔雀石綠（包括顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠）標(biāo)準(zhǔn)特征峰譜圖比較，分別以顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠相對(duì)離子遷移率k0快速定性篩查待測樣品中的孔雀石綠殘留程度。在本實(shí)施例中，離子遷移譜儀為非放射性離子源，工作電壓為220v/50hz，氣源為獨(dú)立氣源，為干燥空氣，遷移電場強(qiáng)度為200v/cm至500v/cm，遷移管溫度為40℃至200℃，進(jìn)樣溫度為170℃至250℃，進(jìn)樣量為1μl至10μl。圖1、圖2分別為濃度0.10ug/ml顯性孔雀石綠、隱色孔雀石綠溶液標(biāo)準(zhǔn)特征峰譜圖，孔雀石綠的相對(duì)離子遷移率k0為1.14cm2v-1s-1和1.19cm2v-1s-1，隱色孔雀石綠的相對(duì)離子遷移率k0為1.13cm2v-1s-1。表一：孔雀石綠特離子遷移譜征峰值樣品特征峰（ko）溶劑檢出限（ug/ml)孔雀石綠(mg)1.14和1.19（ref）水/乙腈0.1隱色孔雀石綠（lmg)1.13水/乙腈0.1結(jié)合上表可知，本實(shí)施例中在樣品處理時(shí)，簡單可行，無需復(fù)雜的前處理過程，不需要消耗其他化學(xué)試劑，耗時(shí)小于2h。在離子遷移譜儀測試時(shí)，取樣量小，一般為5μl，測試耗時(shí)短，70s即可得到分析結(jié)果。測試方法操作簡便，儀器性能穩(wěn)定，自動(dòng)化程度高。測試人員經(jīng)過簡單的培訓(xùn)即可上崗，既可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，也可在農(nóng)批市場、商超食品安全管理人員以及執(zhí)法相關(guān)人員進(jìn)行快速篩查測試。綜上所述，本實(shí)施例所述用離子遷移譜儀檢測水產(chǎn)品/水體中孔雀石綠（包括顯性孔雀石綠和隱色孔雀石綠）的方法，通過使用離子遷移譜儀的檢測方法，簡單、方便的定性檢測孔雀石綠，耗時(shí)小，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明專利進(jìn)行了示例性的描述，顯然本發(fā)明專利的實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明專利的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明專利的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12