專(zhuān)利名稱：孔雀石綠快速檢測(cè)方法及快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種孔雀石綠快速檢測(cè)方法及快速檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前孔雀石綠的檢測(cè)多采用高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜法。液相方法處理方法繁瑣、花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，相對(duì)而言，氣相色譜方法處理方法比較簡(jiǎn)單，但兩者所用設(shè)備均比較昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求很高，不適宜現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且所用試劑(乙腈)毒性很大。
現(xiàn)在市場(chǎng)上所采用的快速檢測(cè)方法分為兩種孔雀石綠固相萃取柱和酶聯(lián)免疫試劑盒、試紙。就前者而言，多數(shù)廠家只在生產(chǎn)和銷(xiāo)售用于水體中檢測(cè)孔雀石綠的固相萃取柱，而水產(chǎn)品由于其基體成分非常復(fù)雜，前處理過(guò)程要求較高，而成為制約研發(fā)的難點(diǎn)。目前針對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行孔雀石綠檢測(cè)的廠家很少，并且操作步驟繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單，分離效果好的孔雀石綠快速檢測(cè)方法及快速檢測(cè)試劑盒。
一種孔雀石綠快速檢測(cè)方法，將待測(cè)樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；所述的提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，優(yōu)選1∶20。
所述的待測(cè)樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)；待測(cè)樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。
所述的層析柱在使用前用乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
所述的層析柱設(shè)有4塊篩板，4塊篩板間自下而上分別填充硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁，所述的衍生化劑為質(zhì)量比1∶1的二氧化鉛和硅藻土，硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁的質(zhì)量比為5∶3∶3。
一種孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒，包括提取劑1，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁；洗滌液，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測(cè)管1；檢測(cè)管2；根據(jù)通常使用要求，所述的孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒包括提取劑130mL，提取劑2，酸性氧化鋁5g；洗滌液5mL，檢測(cè)管150mL；檢測(cè)管250mL；孔雀石綠層析柱。所述的孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒還可以包括試劑盒類(lèi)產(chǎn)品常配的吸耳球、1ml吸管、取樣勺等。
所述的試劑盒的使用方法如下(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，準(zhǔn)確稱取10.0g于50mL檢測(cè)管1中，加入提取劑1、2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測(cè)管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測(cè)管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過(guò)柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可初步判斷樣品中含有孔雀石綠。
本發(fā)明采用乙腈-乙酸乙酯溶液提取，顯著降低了所用試劑的毒性。如果只用乙酸乙酯，則所需的提取時(shí)間較長(zhǎng)，而且乙酸乙酯極性較小，對(duì)隱色孔雀石綠的溶解性好，但對(duì)孔雀石綠的溶解性差；而添加少量的乙腈一方面可以穿透細(xì)胞膜，加快提取速度，另一方面，它對(duì)孔雀石綠的溶解性比乙酸乙酯要好，可以使水產(chǎn)品中的孔雀石綠提取更完全。
由于水產(chǎn)品中基體非常復(fù)雜，采用乙腈-乙酸乙酯溶液作為提取液，與乙腈作為提取液相比，可以減少極性較大的物質(zhì)被提取出來(lái)，但它對(duì)脂肪的提取較多，為消除或降低脂肪的干擾，另外，本發(fā)明檢測(cè)方法中使用了兩次氧化鋁，一次在提取過(guò)程中添加酸性氧化鋁，可以抑制脂肪溶出，另一次在過(guò)層析柱時(shí)首先經(jīng)過(guò)中性氧化鋁柱，也可將脂肪吸附，所以本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)脂肪含量較高的產(chǎn)品也具有較強(qiáng)的適用性。
另外，采用硅膠作為吸附劑，不但降低了成本，而且不必?fù)?dān)心水產(chǎn)品本身的色素成分干擾顯色，因?yàn)樗鼈兙哂兄苄?，在硅膠上不能吸附，隨樣液可以隨下，用洗滌液可將其洗滌下，不影響對(duì)柱體顏色的觀察。


圖1為本發(fā)明檢測(cè)試劑盒中層析柱的結(jié)構(gòu)示意圖；具體實(shí)施方式
層析柱的制作柱體直徑與5mL移液槍頭直徑等同，可制作針筒形狀，長(zhǎng)度不可太短，可與5mL移液槍頭長(zhǎng)度差不多，有刻度。最下層安裝一個(gè)篩板(篩板1)，防止所填吸附劑流下。篩板1上添加柱層析用硅膠0.5g，填入后用吸耳球輕輕敲實(shí)。加入篩板2，該篩板與柱體的密封性要求要好，防止其上的衍生化劑粉末隨樣液流入吸附劑層，對(duì)最終的觀察顯色造成干擾。篩板2上添加衍生化劑(二氧化鉛∶硅藻土＝1∶1)0.3g，輕輕敲實(shí)。然后，加入篩板3，并在其上添加0.3g中型氧化鋁，最后加篩板4，防止在運(yùn)輸和放置過(guò)程中，柱中填料撒落丟失，影響使用效果(如下圖)。要求篩板材料對(duì)孔雀石綠的吸附性要小，另外，填料的用量隨柱體直徑的改變需適當(dāng)調(diào)整。方便添加各填料和添加樣液檢測(cè)限可以達(dá)到4ug/kg，此限量時(shí)可觀察比較明顯的綠色環(huán)帶。
水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)(1)將待測(cè)樣品與提取劑混合后靜置；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20，待測(cè)樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)，待測(cè)樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。取實(shí)施例1中制備的層析柱，用2mL乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；
水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)(2)將待測(cè)樣品與提取劑混合后靜置；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15，待測(cè)樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)，待測(cè)樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。取實(shí)施例1中制備的層析柱，用2mL乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；試劑盒的使用試劑盒的組成為提取劑1 30mL，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁5g；洗滌液5mL，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測(cè)管150mL；檢測(cè)管250mL；孔雀石綠層析柱；吸耳球。
操作步驟如下(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，準(zhǔn)確稱取10.0g于50mL檢測(cè)管1中，加入提取劑1和提取劑2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測(cè)管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測(cè)管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL，用吸耳球從上口加壓，加快流速，3mL樣液通過(guò)柱子的時(shí)間為0.5分鐘；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過(guò)柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠。
權(quán)利要求
1.一種孔雀石綠快速檢測(cè)方法，其特征在于將待測(cè)樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；所述的提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，所述的待測(cè)樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3；待測(cè)樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。
2.如權(quán)利要求1所述的孔雀石綠快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的提取劑中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
3.如權(quán)利要求1或2所述的孔雀石綠快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的層析柱在使用前用乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
4.如權(quán)利要求1所述的孔雀石綠快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的層析柱設(shè)有4塊篩板，4塊篩板間自下而上分別填充硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁，所述的衍生化劑為質(zhì)量比1∶1的二氧化鉛和硅藻土，硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁的質(zhì)量比為5∶3∶3。
5.一種孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括提取劑1，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁；洗滌液，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測(cè)管1；檢測(cè)管2；孔雀石綠層析柱。
6.如權(quán)利要求5所述的孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于還包括吸耳球、吸管、取樣勺。
7.如權(quán)利要求5或6所述的孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒的使用方法(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，稱取10.0g于50mL檢測(cè)管1中，加入提取劑1、2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測(cè)管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測(cè)管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過(guò)柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可初步判斷樣品中含有孔雀石綠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種孔雀石綠快速檢測(cè)方法，將待測(cè)樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，所述的待測(cè)樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3；待測(cè)樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。本發(fā)明采用乙腈－乙酸乙酯溶液提取，使水產(chǎn)品中的孔雀石綠提取更完全并且顯著降低了所用試劑的毒性，對(duì)脂肪含量較高的產(chǎn)品也具有較強(qiáng)的適用性。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101067619SQ200710068348
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者沈建福, 張?jiān)? 李蕾蕾, 陳秋平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 杭州安達(dá)生物科技有限公司