專利名稱：一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及一種建立動(dòng)物乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，建立的動(dòng)物乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型可應(yīng)用于抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物的篩選，也可應(yīng)用于消化性潰瘍復(fù)發(fā)機(jī)理的研究。
背景技術(shù)：
消化性潰瘍是指消化道內(nèi)受胃液、胃酸和胃蛋白酶浸浴范圍內(nèi)黏膜層、黏膜下層，甚至肌層和漿膜在多種因素影響下發(fā)生的局限性組織缺損性疾病，是一種常見病、多發(fā)病。該疾病多發(fā)生在胃和十二指腸，其特點(diǎn)是容易復(fù)發(fā)，而且難于防止。因此，建立消化性胃潰瘍復(fù)發(fā)的動(dòng)物模型，可用于篩選高效的抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物，研究消化性潰瘍復(fù)發(fā)機(jī)理，達(dá)到徹底治愈消化性潰瘍的目的。
大鼠胃潰瘍模型在病理形態(tài)和潰瘍愈合過(guò)程等方面都與人類的消化性胃潰瘍極其相似。文獻(xiàn)報(bào)道腹膜內(nèi)注射IL-1β和腹腔內(nèi)注射TNF-α能夠誘導(dǎo)已愈合的乙酸潰瘍復(fù)發(fā)。本專利用100％的乙酸復(fù)制大鼠乙酸胃潰瘍模型，在潰瘍制作后的第25天，所有大鼠潰瘍?nèi)孔匀挥?。由此，在潰瘍制作后的?5天～54天，用灌胃法給予阿司匹林。至潰瘍制作后的第55天，成功誘導(dǎo)了自然愈合后的潰瘍復(fù)發(fā)，建立了大鼠胃潰瘍復(fù)發(fā)新模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)(1)建立大鼠乙酸胃潰瘍及潰瘍自然愈合模型，(2)采用阿司匹林誘導(dǎo)已自然愈合的潰瘍復(fù)發(fā)，(3)測(cè)定大鼠潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程中的生理生化指標(biāo)變化。具體步驟如下(1)建立大鼠乙酸胃潰瘍及潰瘍自然愈合模型用乙醚麻醉大鼠，剖腹后用內(nèi)徑6mm的塑料管置于胃體與幽門交界處，向管內(nèi)注入100％(VN)的乙酸75μl，25秒后用棉簽拭去塑料管內(nèi)的乙酸，依次縫合腹壁各層，關(guān)閉腹腔，由此制作出大鼠乙酸潰瘍。然后在潰瘍制作后，定期處死大鼠，于肉眼及顯微鏡下觀察潰瘍形態(tài)及潰瘍自然愈合過(guò)程。
本發(fā)明用乙酸涂布大鼠胃體與幽門交界處前壁，第一步行大鼠乙酸胃潰瘍模型制備。
本發(fā)明在制備大鼠胃潰瘍后第3、15、25天用乙醚麻醉分批處死大鼠，以胃壁涂乙酸的部位為中心，沿胃長(zhǎng)軸進(jìn)行取材，切下涂乙酸的部位，固定在4％多聚甲醛緩沖液中4小時(shí)。將固定好的組織經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟等過(guò)程制成蠟塊后，用Leica切片機(jī)進(jìn)行4μm厚度的連續(xù)切片、粘片、烘片和染色，第二步行Olympus光學(xué)顯微鏡下乙酸涂布處組織學(xué)及病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。
(2)用阿司匹林誘導(dǎo)已自然愈合的潰瘍復(fù)發(fā)在所有大鼠乙酸潰瘍?nèi)孔匀挥系漠?dāng)天(潰瘍制作后第25天)開始，每天大鼠禁食4小時(shí)后，用灌胃的方法給予大鼠阿司匹林(40mg/公斤體重/天)，然后再禁食1小時(shí)，直至在第35天、45天和55天后分批處死大鼠，檢測(cè)自然愈合后潰瘍的復(fù)發(fā)。
本發(fā)明將腺腔內(nèi)徑大于8μm(約為正常腺腔內(nèi)徑的3倍)作為判斷腺體囊狀擴(kuò)張的標(biāo)準(zhǔn)，于400倍光學(xué)顯微鏡下測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜內(nèi)呈囊狀擴(kuò)張的腺體數(shù)(個(gè)/視野)，第一步行擴(kuò)張腺體數(shù)量測(cè)定。
本發(fā)明于100倍光學(xué)顯微鏡下測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜上皮細(xì)胞表面到黏膜肌層之間的距離(微米)，第二步行再生黏膜厚度測(cè)定。
本發(fā)明于低倍光學(xué)顯微鏡下找到H-E染色切片黏膜下組織的血管高密度區(qū)后，在200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)已形成血管腔結(jié)構(gòu)的毛細(xì)血管(個(gè)/視野)，第三步行黏膜下組織中的微血管數(shù)量測(cè)定。
本發(fā)明于400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)H-E染色切片黏膜下組織中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量(個(gè)/視野)，第四步行黏膜下組織中的炎細(xì)胞數(shù)量測(cè)定。
本發(fā)明造成大鼠胃潰瘍復(fù)發(fā)所用的藥物是阿司匹林，獲得了大鼠乙酸潰瘍復(fù)發(fā)新模型。
(3)通過(guò)測(cè)定大鼠潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程中的生理生化指標(biāo)變化，證實(shí)胃潰瘍的復(fù)發(fā)，研究復(fù)發(fā)機(jī)理用過(guò)量的乙醚麻醉處死大鼠，打開腹腔，收集胃粘膜、胃粘液、血清和血漿，測(cè)定胃黏膜前列腺素E2(PGE2)、胃粘液量、胃黏膜血流、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量。
本發(fā)明用載玻片刮取胃粘膜，第一步行胃黏膜前列腺素E2含量測(cè)定。
本發(fā)明通過(guò)結(jié)扎幽門，4小時(shí)后結(jié)扎賁門，收集胃內(nèi)容于試管中，第二步行胃液量測(cè)定。
本發(fā)明收集胃內(nèi)容于試管中，第三步行pH計(jì)測(cè)定胃液的pH值。
本發(fā)明沿胃小彎剪開并外翻，浸入阿利斯藍(lán)染液中，孵育2小時(shí)后將胃取出，吸取孵育液，用722型分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，第四步行胃粘液含量測(cè)定。
本發(fā)明采用局部血流儀，第五步行氫氣清除法測(cè)量潰瘍邊緣的胃黏膜血流量。
本發(fā)明用載玻片刮取潰瘍部位的胃黏膜，并通過(guò)離心制備上清液，再通過(guò)ELISA方法，第六步行表皮生長(zhǎng)因子(EGF)含量測(cè)定。
本發(fā)明刮取潰瘍部位的胃粘膜，采用ELISA方法，第七步行轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)測(cè)定。
本發(fā)明采用摘取大鼠眼球的方法取血，分離出血清，用ELISA方法，第八步行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)(VEGF)因子含量和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量測(cè)定。
本發(fā)明采用摘取大鼠眼球的方法取血，并制備血漿，用ELISA方法，第九步行白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)含量測(cè)定。
本發(fā)明提供的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型方法可在篩選治療消化性潰瘍藥物中應(yīng)用，也可在篩選抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物中應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有胃潰瘍復(fù)發(fā)制作技術(shù)相比，采用阿司匹林及其灌胃方法進(jìn)行誘導(dǎo)，更真實(shí)地模擬了臨床口服非甾體抗炎性藥物引起的胃潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程，由此制作的胃潰瘍復(fù)發(fā)動(dòng)物模型不但可應(yīng)用于臨床消化性潰瘍復(fù)發(fā)機(jī)理的研究，還可針對(duì)性地用于臨床抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物的篩選，即在潰瘍制作后的第3-25天用某種待篩選的抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物對(duì)胃潰瘍復(fù)發(fā)模型動(dòng)物進(jìn)行抗復(fù)發(fā)治療，并在第25-54天給予阿司匹林后觀察潰瘍復(fù)發(fā)是否出現(xiàn)或復(fù)發(fā)例數(shù)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減少，最后通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)的抗?jié)兯?如奧美拉唑)來(lái)確定該藥物抗?jié)儚?fù)發(fā)的效果。


圖1.潰瘍制作后的第3天肉眼所見潰瘍形態(tài)。
圖2.潰瘍制作后的第3天顯微鏡下的潰瘍結(jié)構(gòu)。
圖3.潰瘍制作后的第15天肉眼所見潰瘍形態(tài)。
圖4.潰瘍制作后的第15天顯微鏡下的潰瘍結(jié)構(gòu)。
圖5.潰瘍制作后的第25天肉眼所見潰瘍形態(tài)。
圖6.潰瘍制作后的第25天顯微鏡下的潰瘍結(jié)構(gòu)。
圖7.潰瘍制作后第55天阿司匹林組肉眼所見的復(fù)發(fā)潰瘍形態(tài)。
圖8.潰瘍制作后第55天阿司匹林組顯微鏡下所見的復(fù)發(fā)潰瘍形態(tài)。
圖9.潰瘍制作后第55天禁食對(duì)照組的大體形態(tài)。
圖10.潰瘍制作后第55天禁食對(duì)照組顯微鏡下所見。
圖11.潰瘍制作后第55天鹽水對(duì)照組的大體形態(tài)。
圖12.潰瘍制作后第55天鹽水對(duì)照組顯微鏡下所見。
圖13.潰瘍制作后第55天3組擴(kuò)張腺體數(shù)量的比較。
圖14.潰瘍制作后第55天3組再生黏膜厚度的比較。
圖15.潰瘍制作后第55天3炎細(xì)胞數(shù)量的比較。
圖16.潰瘍制作后第55天3組胃黏膜PGE2的含量的比較。
圖17.潰瘍制作后第55天3組的胃液量的比較。
圖18.潰瘍制作后第55天3組胃液的pH的比較。
圖19.潰瘍制作后第55天3組的胃黏液量的比較。
圖20.潰瘍制作后第55天3組的胃粘膜血流量的比較。
圖21.潰瘍制作后第55天3組的表皮生長(zhǎng)因子含量的比較。
圖22.潰瘍制作后第55天3組的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α含量的比較。
圖23.潰瘍制作后第55天3組的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量的比較。
圖24.潰瘍制作后第55天3組的腫瘤壞死因子-α含量的比較。
圖25.潰瘍制作后第55天3組的白細(xì)胞介素-1β含量的比較。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明之目的，而不限于本發(fā)明范圍。
實(shí)例一 建立大鼠乙酸胃潰瘍的模型與潰瘍自然愈合實(shí)驗(yàn)采用雄性Wistar大鼠，用乙醚麻醉后，仰臥固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上，腹部消毒，劍突下腹正中切口1.5cm左右，開腹后將胃拉出，用內(nèi)徑6mm的塑料管，緊貼于胃體與幽門交界處，向塑料管內(nèi)注入100％(VN)的乙酸75微升，25秒后立即用棉簽拭去塑料管內(nèi)的乙酸，然后用生理鹽水沖洗乙酸涂布處，依次縫合腹壁各層，關(guān)閉腹腔，既復(fù)制出大鼠乙酸潰瘍模型。
乙酸潰瘍制作后便進(jìn)行自然愈合，潰瘍制作后第3天肉眼所見的潰瘍面積大約是27mm2(見圖1)，圖中箭頭指向潰瘍；鏡下出現(xiàn)了典型的潰瘍結(jié)構(gòu)(見圖2)。第15天肉眼所見的潰瘍面積是3mm2(見圖3)，圖中箭頭指向潰瘍；鏡下顯示潰瘍正在進(jìn)行愈合(見圖4)。潰瘍制作后的第25天，肉眼及鏡下顯示所有大鼠的潰瘍?nèi)孔匀挥?見圖5和圖6)，圖中箭頭指向自然愈合的潰瘍。
實(shí)例二 潰瘍自然愈合后用阿司匹林誘導(dǎo)復(fù)發(fā)1.阿司匹林組在乙酸潰瘍制作后的第25-54天，大鼠每天被禁食4小時(shí)后，用灌胃的方法給予大鼠阿司匹林(40mg/公斤體重/天)，然后再禁食1小時(shí)。
2.禁食對(duì)照組在乙酸潰瘍制作后的第25-54天，大鼠每天被禁食5小時(shí)。
3.鹽水對(duì)照組在乙酸潰瘍制作后的第25-54天，大鼠每天被禁食4小時(shí)后，用灌胃的方法給予大鼠生理鹽水(4ml/公斤體重/天)，然后再禁食1小時(shí)。
在潰瘍制作后的第35、45、55天，用過(guò)量的乙醚每組隨機(jī)處死8只大鼠，測(cè)量復(fù)發(fā)潰瘍面積(見表1)，表1中的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8，**表示阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組比較具有級(jí)顯著差異(P＜0.01)。在阿司匹林組，在潰瘍制作后的第35天，未出現(xiàn)復(fù)發(fā)潰瘍；在潰瘍制作后的第45天，8只大鼠的2只出現(xiàn)復(fù)發(fā)潰瘍；在潰瘍制作后的第55天，肉眼所見8只大鼠的5只出現(xiàn)復(fù)發(fā)潰瘍(見圖7)，圖7中復(fù)發(fā)潰瘍面積大約4mm2，箭頭指向復(fù)發(fā)潰瘍；其顯微鏡下的復(fù)發(fā)潰瘍形態(tài)見圖8。禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組未出現(xiàn)復(fù)發(fā)潰瘍(見圖9、圖10、圖11和圖12)。
表1.在不同時(shí)間禁食對(duì)照組組、鹽水對(duì)照組、阿司匹林組的潰瘍面積。

實(shí)例三 擴(kuò)張腺體數(shù)量測(cè)定將腺腔內(nèi)徑大于8μm(約為正常腺腔內(nèi)徑的3倍)作為判斷腺體囊狀擴(kuò)張的標(biāo)準(zhǔn)。在光學(xué)顯微鏡下放大400倍，測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜內(nèi)呈囊狀擴(kuò)張的腺體數(shù)。在潰瘍制作后的第55天，在阿司匹林組，擴(kuò)張腺體數(shù)量多于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(圖13，P＜0.01)。
實(shí)例四 再生黏膜厚度測(cè)定在光學(xué)顯微鏡下放大100倍，測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜上皮細(xì)胞表面到黏膜肌層之間的距離。在潰瘍制作后的第55天，在阿司匹林組，再生黏膜厚度低于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖14)，圖14中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8張切片。**表示為與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)。
實(shí)例五 黏膜下組織中的微血管數(shù)量測(cè)定在低倍光學(xué)顯微鏡下，找到H-E染色切片黏膜下組織的血管高密度區(qū)，然后在光學(xué)顯微鏡下放大200倍，計(jì)數(shù)已形成血管腔結(jié)構(gòu)的毛細(xì)血管，已形成明顯肌層的血管不參與計(jì)數(shù)。在潰瘍制作后的第55天，在阿司匹林組，粘膜下組織微血管數(shù)量少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組，與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)。
實(shí)例六 黏膜下組織中的炎細(xì)胞數(shù)量測(cè)定在光學(xué)顯微鏡下放大400倍，計(jì)數(shù)H-E染色切片黏膜下組織中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。在潰瘍制作后的第55天，在阿司匹林組，炎細(xì)胞數(shù)量多于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖15)，圖15中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8張切片。**表示為與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)。
實(shí)例七 胃黏膜前列腺素E2(PGE2)測(cè)定用過(guò)量的乙醚麻醉處死大鼠，打開腹腔，取出胃，沿胃大彎剪開，用載玻片刮取胃粘膜，迅速放入液氮中冷凍，然后取出凍存的胃粘膜組織50mg，放入離心管中，加入0.1M的吲哚美辛(Indomethacin)和100％乙醇進(jìn)行勻漿，4℃離心1,2000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，分離出上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)方法按試劑盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)說(shuō)明書進(jìn)行胃黏膜PGE2的測(cè)定。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的PGE2少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖16)，圖16中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是抑制PGE2的生成，從而引起潰瘍復(fù)發(fā)。
實(shí)例八 胃液量和胃液pH值測(cè)定將大鼠禁食24小時(shí)，用乙醚麻醉，上腹部正中切口，拉出胃，結(jié)扎幽門，禁食禁止水。4小時(shí)后，再結(jié)扎賁門，分別剪斷賁門上端及幽門下端，收集胃內(nèi)容于容器內(nèi)，3,500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取出上清液測(cè)量其體積并用酸度計(jì)測(cè)量其pH。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的胃液量多于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖17)，圖17中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)；胃液的pH值則低于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖18)，圖18中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是增加胃酸分泌，從而引起潰瘍復(fù)發(fā)。
實(shí)例九 胃黏液的測(cè)定用過(guò)量的乙醚麻醉處死動(dòng)物后，剖腹取出胃，沿胃小彎剪開并外翻，浸入20ml阿利斯藍(lán)染液(阿利斯藍(lán)染液濃度8mg/100ml，緩沖液0.2M Na2HPO4，0.1M citric acid，pH＝5.8))中，孵育2小時(shí)后將胃取出，取6ml孵育液放入離心管中離心(3,000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)，取上清液，用722型分光光度計(jì)于615nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，并計(jì)算出胃黏液含量。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的胃黏液少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖19)，圖19中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是抑制胃黏液的生成。
實(shí)例十 胃黏膜血流的測(cè)定采用氫氣清除(H2gas clearance technique)法用局部血流儀(Biotechnical Science Co Ltd，Japan)測(cè)量潰瘍邊緣的胃黏膜血流。簡(jiǎn)述如下用乙醚輕度麻醉大鼠，打開腹腔，將胃拉出并固定在大鼠手術(shù)臺(tái)上，血流儀的雙針電極通過(guò)漿膜插入到潰瘍邊緣的胃黏膜，局部產(chǎn)生的H2被血流帶走，檢測(cè)儀給出了氫氣清除曲線。用組織氫氣清除曲線計(jì)算出血流量。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的胃黏膜血流少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖20)，圖20中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝6只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是減少了胃粘膜血流，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例十一 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的測(cè)定大鼠處死后，取出胃，用載玻片刮取潰瘍部位的胃黏膜100mg，放入0.5ml 0.01M的PBS(pH 7.0)緩沖液中，在0℃條件下勻漿20秒，在4℃條件下離心2,0000轉(zhuǎn)/分，20分鐘。用ELISA方法按試劑盒(Rapidbio，USA進(jìn)口分裝)說(shuō)明書測(cè)定上清液中的EGF的含量，結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的EGF少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖21)，圖21中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝6只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是減少了胃粘膜EGF，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例十二 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(TGF-α)的測(cè)定刮取100mg潰瘍部位的胃粘膜組織，加入1ml生理鹽水，置于微型勻漿器中勻漿，于4℃離心15,000轉(zhuǎn)/分15分鐘，取上清液用ELISA方法按試劑盒(Rapidbio，USA進(jìn)口分裝)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的TGF-α少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖22)，圖22中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有住差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是減少了胃粘膜TGF-α，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例十三 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的測(cè)定用摘取大鼠眼球的方法取血，室溫自然凝血2小時(shí)，分離出血清，在4℃的條件下離心3,000轉(zhuǎn)/分15分鐘，保存在-20℃的冰箱中。測(cè)定時(shí)從冰箱取出在室溫復(fù)融，并再次離心，用ELISA方法按試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)說(shuō)明書測(cè)定上清液中的VEGF的含量。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的VEGF少于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖23)，圖23中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是減少VEGF的生成，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例十四 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的測(cè)定用ELISA方法按試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)說(shuō)明書測(cè)定血清中的TNF-α的含量。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的TNF-α多于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖24)，圖24中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是增加了TNF-α的生成，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例十五 白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的測(cè)定方法從冰箱取出凍存的血漿，在室溫復(fù)溶，在4℃的條件下離心3,000轉(zhuǎn)/分15分鐘，用ELISA方法按試劑盒(Rapidbio，USA(進(jìn)口分裝)說(shuō)明書測(cè)定血漿中的白細(xì)胞介素-1β的含量。結(jié)果顯示，在潰瘍制作后的第55天，阿司匹林組的IL-1β多于禁食對(duì)照組和鹽水對(duì)照組(見圖25)，圖25中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝8只大鼠，**表示為阿司匹林組與禁食對(duì)照組、鹽水對(duì)照組相比具有極顯著差異(P＜0.01)，表明阿司匹林引起潰瘍復(fù)發(fā)的機(jī)制是增加了IL-1β的生成，從而引起潰瘍的復(fù)發(fā)。
實(shí)例總結(jié)1.乙酸胃潰瘍制作后到第25天所有大鼠的潰瘍?nèi)孔匀挥稀?br> 2.從潰瘍制作后到第25～54天，用灌胃法給予阿司匹林，誘導(dǎo)了潰瘍復(fù)發(fā)。
3.應(yīng)用潰瘍復(fù)發(fā)模型研究了潰瘍復(fù)發(fā)的部分機(jī)理。
權(quán)利要求
1.一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)建立大鼠乙酸胃潰瘍及潰瘍自然愈合模型用乙醚麻醉大鼠，剖腹后用內(nèi)徑6mm的塑料管置于胃體與幽門交界處，向管內(nèi)注入100％的乙酸75μl，25秒后用棉簽拭去塑料管內(nèi)的乙酸，依次縫合腹壁各層，關(guān)閉腹腔，建立大鼠乙酸潰瘍模型，然后定期處死大鼠，于肉眼及顯微鏡下觀察潰瘍形態(tài)及潰瘍自然愈合過(guò)程；(2)用阿司匹林誘導(dǎo)已自然愈合的潰瘍復(fù)發(fā)在所有大鼠乙酸潰瘍制作后第25天開始，每天大鼠禁食4小時(shí)后，用灌胃的方法給予大鼠40mg/公斤體重/天的阿司匹林，然后再禁食1小時(shí)，直至在第35天、45天和55天后分批處死大鼠，檢測(cè)自然愈合后潰瘍的復(fù)發(fā)；(3)通過(guò)測(cè)定大鼠潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程中的生理生化指標(biāo)變化，證實(shí)胃潰瘍的復(fù)發(fā)用過(guò)量的乙醚麻醉處死大鼠，打開腹腔，收集胃粘膜、胃粘液、血清和血漿，測(cè)定胃黏膜前列腺素E2、胃粘液量、胃黏膜血流、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β含量，確定胃潰瘍的復(fù)發(fā)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是步驟(1)所述的定期處死大鼠，是在制備大鼠胃潰瘍后第3、15、25天用乙醚麻醉分批處死大鼠，以胃壁涂乙酸的部位為中心，沿胃長(zhǎng)軸進(jìn)行取材，切下涂乙酸的部位，固定在4％多聚甲醛緩沖液中4小時(shí)，將固定好的組織經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟等過(guò)程制成蠟塊后，用Leica切片機(jī)進(jìn)行4μm厚度的連續(xù)切片、粘片、烘片和染色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是步驟(2)所述的檢測(cè)包括擴(kuò)張腺體數(shù)量測(cè)定將腺腔內(nèi)徑大于8μm作為判斷腺體囊狀擴(kuò)張的標(biāo)準(zhǔn)，于400倍光學(xué)顯微鏡下測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜內(nèi)呈囊狀擴(kuò)張的腺體數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是步驟(2)所述的檢測(cè)包括再生黏膜厚度測(cè)定于100倍光學(xué)顯微鏡下測(cè)量H-E染色切片中再生黏膜上皮細(xì)胞表面到黏膜肌層之間的距離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是步驟(2)所述的檢測(cè)包括黏膜下組織中的微血管數(shù)量測(cè)定于低倍光學(xué)顯微鏡下找到H-E染色切片黏膜下組織的血管高密度區(qū)后，在200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)已形成血管腔結(jié)構(gòu)的毛細(xì)血管。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，其特征是步驟(2)所述的檢測(cè)包括黏膜下組織中的炎細(xì)胞數(shù)量測(cè)定于400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)H-E染色切片黏膜下組織中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法在篩選治療消化性潰瘍藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法在篩選抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種建立大鼠乙酸胃潰瘍疾病復(fù)發(fā)模型的方法，建立大鼠乙酸胃潰瘍及潰瘍自然愈合模型，并用阿司匹林誘導(dǎo)已自然愈合的潰瘍復(fù)發(fā)，通過(guò)測(cè)定大鼠潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程中的生理生化指標(biāo)變化，證實(shí)胃潰瘍的復(fù)發(fā)模型的建立。本發(fā)明用阿司匹林及其灌胃方法進(jìn)行誘導(dǎo)，更真實(shí)地模擬了臨床口服非甾體抗炎性藥物引起的胃潰瘍復(fù)發(fā)過(guò)程，由此建立的胃潰瘍復(fù)發(fā)動(dòng)物模型不但可應(yīng)用于臨床消化性潰瘍復(fù)發(fā)機(jī)理的研究，還可針對(duì)性地用于篩選臨床治療消化性潰瘍藥物和抗?jié)儚?fù)發(fā)藥物。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101069747SQ20071006826
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者王金福, 王國(guó)忠 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)