專利名稱：檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的單抗及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能識(shí)別孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的單克隆抗體及一種用于檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。
背景技術(shù)：
孔雀石綠、結(jié)晶紫屬于三苯甲烷類染料，可用作殺菌、驅(qū)蟲劑，是藥用染料中抗菌效力較強(qiáng)的一類。由于孔雀石綠和結(jié)晶紫具有潛在的致癌性，已被許多國(guó)家禁用，但是目前還存在非法使用的現(xiàn)象，因此很有必要加強(qiáng)對(duì)于該藥的檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)?？兹甘G和結(jié)晶紫可分別代謝為無色孔雀石綠及無色結(jié)晶紫，目前，對(duì)于孔雀綠、 結(jié)晶紫及其代謝物殘留檢測(cè)的方法主要是高效液相色譜法，該方法雖然靈敏、準(zhǔn)確，但樣品前處理繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、耗資大、技術(shù)性要求高，且要有昂貴的儀器，不適合大量樣品的高通量檢測(cè)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(ELISA)是利用免疫反應(yīng)(即抗原-抗體結(jié)合反應(yīng))的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性對(duì)藥物進(jìn)行定性和定量分析的一種綜合性檢測(cè)技術(shù)，它具有操作簡(jiǎn)便、高通量、高靈敏度、低費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，能克服儀器檢測(cè)方法的不足之處。申請(qǐng)?zhí)枮?00810202733. 8的中國(guó)專利公開了一種檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑及方法，該發(fā)明采用活潑酯法將孔雀石綠半抗原分別與鑰孔槭血藍(lán)蛋白和牛丙種球蛋白偶聯(lián)得到免疫原和包被原，所得到的酶聯(lián)免疫試劑及方法僅能檢測(cè)孔雀石綠，無法檢測(cè)其代謝產(chǎn)物及結(jié)晶紫的代謝產(chǎn)物。申請(qǐng)?zhí)枮?00910058317. X的另一篇中國(guó)專利公開了測(cè)定水樣及水產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特點(diǎn)是合成氨基無色孔雀石綠作為半抗原，分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián)得到免疫原和包被原，通過免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體，該發(fā)明所采用的半抗原合成方法復(fù)雜，涉及到加氫等比較危險(xiǎn)的反應(yīng)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是對(duì)孔雀石綠半抗原進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成對(duì)_[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠作為半抗原，進(jìn)而提供出一種能識(shí)別孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用所述該單克隆抗體，建立一種能用于孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供包含所述單克隆抗體的試劑盒在動(dòng)物源性食品中孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種能識(shí)別孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10所分泌的。上述雜交瘤細(xì)胞4B10，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NO C201143o所用的免疫原是由半抗原對(duì)-[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠與人血清白蛋白偶聯(lián)制備的。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種用于孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法，包括以下步驟(I)將半抗原對(duì)_[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠(LMG-HEO)與人血清白蛋白 (HSA)偶聯(lián)得到免疫原(LMG-HE0-HSA)；(2)將半抗原對(duì)-[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠(LMG-HEO)與卵清蛋白(OVA) 偶聯(lián)得到包被原(LMG-HE0-0VA)；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCC NO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCC NO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標(biāo)板)；(6)取均質(zhì)好的組織樣品，用乙腈超聲提取、離心，取乙腈層用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)煤?O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待測(cè)物； (7)取待測(cè)物進(jìn)行ELISA檢測(cè)。步驟(6)含O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法為準(zhǔn)確稱取三羥甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水?dāng)嚢枞芙馔耆?50mL，攪拌條件下用濃鹽酸調(diào)pH值至7. 4，再加O. 5mL吐溫20溶解， 定容至1000mL。本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其他試劑組合，制成了能檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物可食性組織中孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是I.本發(fā)明制備的單克隆抗體能同時(shí)檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫， 識(shí)別范圍廣，靈敏度高。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的半抗原合成工藝簡(jiǎn)便、效率高，所用的主要有機(jī)試劑避免了高毒性，對(duì)操作者身體健康危害小。3.本發(fā)明所使用的人工抗原載體為人血清白蛋白，在現(xiàn)有專利和文獻(xiàn)中未見報(bào)道和使用，免疫效果優(yōu)于牛血清白蛋白做載體的免疫原。4.本發(fā)明涉及的ELISA檢測(cè)方法以含O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的 Tris-HCl溶液為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和樣品稀釋液，對(duì)待測(cè)物的溶解性好，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好， 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度好。


圖I為本發(fā)明免疫原LMG-HE0-HSA的MALDI-T0F/T0F圖譜。圖2為本發(fā)明載體蛋白HSA的MALDI-T0F/T0F圖譜。圖3為本發(fā)明的單克隆抗體與無色結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)曲線，X軸為孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫三種標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為孔雀石綠、無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫三種標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以“O”孔光密度值(B/Bd。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I半抗原的制備I. I合成對(duì)-[3_(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛干燥處理取一瓶N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 500ml加無水硫酸鈉60g，震蕩，靜置過夜，減壓過濾，收集干燥后的DMF于一干燥的IOOOml單口瓶,密封,置干燥陰涼處備用。藥品稱量準(zhǔn)確稱取4-羥基-苯甲醛34g，碳酸鉀28g，4_溴丁酸乙酯68g。羥基烷基化反應(yīng)將以上稱取的三種藥品一起加入到200ml干燥DMF中，110°C回流反應(yīng)過夜。靜置至室溫，過濾，濾液用乙酸乙酯提取，抽真空干燥。獲得具有水果清香味的無色油狀液體，即為對(duì)-[3_(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛。I. 2合成對(duì)-[3_(乙基羧基)丙氧基]無色孔雀石綠稱量準(zhǔn)確稱(量)取步驟I所獲的對(duì)_[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛Sg，N， N 二甲苯胺30ml，對(duì)甲苯磺酸15g。傅克反應(yīng)將以上稱量的三種物質(zhì)混合，120°C攪拌反應(yīng)過夜。靜置至室溫，加 13g固體碳酸鉀中和反應(yīng)體系。乙酸乙酯提取后，抽真空干燥。得到橙色油狀物，即為對(duì)-[3-(乙基羧基)丙氧基]無色孔雀石綠。柱色譜純化采用濕法填柱進(jìn)樣，以乙酸乙酯正己烷=I 6為流動(dòng)相純化上述得到的對(duì)-[3_(乙基羧基)丙氧基]無色孔雀石綠。I. 3合成對(duì)-[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠稱量準(zhǔn)確稱(量)取步驟2所獲的對(duì)-[3_(乙基羧基)丙氧基]無色孔雀石綠 6g，甲醇四氫呋喃=3 2混合溶液300ml，4N NaOH溶液50ml。皂化反應(yīng)將以上稱量的物質(zhì)混合，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜(16小時(shí))。真空除掉有機(jī)溶劑部分，吸出水層底部的少量油滴，用乙酸乙酯正己烷=I 4萃洗，棄正己烷層，靜置于4°C，待溶液中出現(xiàn)大量亮色薄片狀物質(zhì)時(shí)，過濾，得到肉黃色粘土狀粗品。將其均勻鋪開，靜置干燥。用研缽磨細(xì)，得到藍(lán)綠色固體，即為對(duì)-[3_(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠 (LMG-HEO)。實(shí)施例2免疫原和包被原的制備2. I藥物羧基端的活化藥品稱量準(zhǔn)確稱取LMG-HEO 80mg, I，3_ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 20mg，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 11. 5mg。藥物羧基端的活化將以上稱取的三種藥品置于IOmL反應(yīng)瓶中，加入DMF3mL和磁力攪拌子，室溫避光攪拌反應(yīng)16小時(shí)，過濾，取濾液(此為A液)備用。
2. 2載體蛋白溶液配制稱量準(zhǔn)確稱(量)取O. IM pH 8. 5的碳酸氫鈉溶液16mL，人血清白蛋白 (HSA) IOOmg 或者卵清蛋白(OVA) 100. mg。制備B液將HSA IOOmg溶解到O. IM pH8. 5的碳酸氫鈉溶液16mL中，加入磁力攪拌子，此為B液。制備C液將OVA 100. mg溶解到O. IM ρΗ8· 5的碳酸氫鈉溶液16mL中，加入磁力攪拌子，此為C液。2.3人工抗原制備免疫原的制備將實(shí)施例2. I制備的A液逐滴加到實(shí)施例2. 2配制的B液中，攪拌反應(yīng)過夜。然后將此混合溶液裝入透析袋中，對(duì)PH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液透析，將透析充分的抗原從透析袋取出，加入到IOml離心管5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。吸取上清，I. 5ml/ 青霉素小瓶分裝，在_70°C預(yù)凍過夜，冷凍干燥24小時(shí)，封口處理，_70°C低溫保存。此即為免疫原LMG-HE0-HSA。分別稱取Img LMG-HE0-HSA和HSA于I. 5mL EP管中，超純水溶解到 lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL 三個(gè)濃度，過 O. 22 μ L 微孔濾膜后進(jìn)樣，經(jīng) MALDI-T0F/T0F 進(jìn)樣掃描，見附圖1、2。根據(jù)分子離子峰吸收值計(jì)算為結(jié)合率(69252.06-66492.53)/446 =
6.18。包被原的制備將實(shí)施例2. I制備的A液逐滴加到實(shí)施例2. 2配制的C液中，攪拌反應(yīng)過夜。然后將此混合溶液裝入透析袋中，對(duì)PH7. 2的磷酸鹽緩沖溶液透析，將透析充分的抗原從透析袋取出，加入到IOml離心管5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。吸取上清，I. 5ml/ 青霉素小瓶分裝，在_70°C預(yù)凍過夜，冷凍干燥24小時(shí)，封口處理，_70°C低溫保存，此即為包被原 LMG-HE0-0VA。實(shí)施例3單克隆抗體的制備雜交瘤細(xì)胞的制備參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》科學(xué)出版社2001年版中的方法以實(shí)施例2制備的免疫原LMG-HE0-HSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序?yàn)榛A(chǔ)免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，首免與二免間隔3 周，以后每間隔2周加強(qiáng)免疫一次，換用不完全佐劑乳化，最后于融合前三天腹腔注射，強(qiáng)化免疫，抗原量加倍，不加佐劑。融合時(shí)，取經(jīng)最后強(qiáng)化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5分鐘消毒。將3-5X 107SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾臟細(xì)胞懸液加入到50mL離心管中，混勻，1500r/分鐘離心5分鐘。棄上清，并用滅菌的濾紙吸干。輕輕敲擊管底，使管底細(xì)胞松動(dòng)。將離心管置于37°C水浴中，緩慢加入預(yù)溫至37°C的50% PEGO. 85mL，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌，加完后繼續(xù)攪拌，總用時(shí)維持在90秒內(nèi)。緩慢加入37°C預(yù)溫的RPMI-1640基礎(chǔ)液10mL。具體方法為第I分鐘逐滴加lmL， 第2分鐘加2mL，之后緩慢加入剩余的RPMI-1640基礎(chǔ)液，邊加邊輕搖離心管。緩慢加入 40mL RPMI-1640基礎(chǔ)液，加完后，緩慢上下顛倒混勻，1500r/分鐘離心5分鐘。棄上清，IOmL 滴管吸取含飼養(yǎng)細(xì)胞HAT培養(yǎng)基，沿管壁緩慢滴加，用滴管緩慢機(jī)械攪拌，緩慢吸取融合細(xì)胞，接近飼養(yǎng)細(xì)胞液面滴加，機(jī)械攪拌混勻。接種于6塊96孔培養(yǎng)板中，約150 μ L/孔，置于37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當(dāng)天起計(jì)為O天，3天后每個(gè)培養(yǎng)孔滴加I滴HAT培養(yǎng)基，5天后有規(guī)律地每隔2天吸去1/2體積的培養(yǎng)基，換入等量HT培養(yǎng)基。在融合后4天，開始對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行跟蹤觀察，標(biāo)記和記錄有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，并計(jì)算融合率。在融合后6-7天，待孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/10-1/5時(shí)，取培養(yǎng)上清，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選陽性細(xì)胞孔。包被原濃度為10mg/L。每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔設(shè)置O孔和200 μ g/L藥物孔，每孔中加入50 μ L培養(yǎng)上清進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。選擇4-6個(gè)上清檢測(cè)呈強(qiáng)陽性且只有1-2個(gè)形態(tài)良好集落生長(zhǎng)的孔，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過3 4次克隆，最終篩選出分泌針對(duì)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的特異性抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞。申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞命名為4Β10，并于2011年 6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為 CCTCC NO C201143o腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射 O. 5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮由保藏號(hào)為CCTCC NO: C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)采集腹水。按照文獻(xiàn)方法(朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京人民軍醫(yī)出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。 采用購自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgG2a亞型。實(shí)施例4無色結(jié)晶紫、孔雀石綠、無色孔雀石綠間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立4. I ELISA相關(guān)試劑配制碳酸鹽緩沖液(pH 9. 6):準(zhǔn)確稱取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解，定容至1000mL。洗滌液(pH7.4):準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g，KH2PO4 0. 20g，Na2HPO4 · 12H20 2.90g，KCl
0.20g,少量超純水溶解，加入吐溫20 0. 50mL,定容至1000mL。磷酸鹽緩沖液(PBS)(ρΗ7· 4):準(zhǔn)確稱取 NaC18. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KC10. 20g，少量超純水溶解，定容至1000mL。封閉液準(zhǔn)確稱取卵清蛋白10. OOg,加入IOOOmL磷酸鹽緩沖液，攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。含0. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的Tris_HCl溶液的配制準(zhǔn)確稱取 Tris I. 211g，加入少量水?dāng)嚢枞芙馔耆?，?50mL，攪拌條件下用濃鹽酸調(diào)pH值至7. 4，再加0. 5mL吐溫20溶解，定容至IOOOmL0底物液購自武漢飛遠(yuǎn)科技有限公司。終止液2mol/L硫酸。4. 2包被原濃度和抗體工作濃度的確定包被原濃度和抗體工作濃度的初步確定采用方陣滴定初步確定包被原濃度和抗體工作濃度，抗原濃度設(shè)置4、2、1、0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0. 3125mg/L?？贵w濃度為2、4、
8、16、32、64、128，256X 103。酶標(biāo)板每孔加入50 μ L PBS和50 μ L抗體，選擇OD值接近2. 0， 且相鄰孔OD值出現(xiàn)較大變化的包被濃度和抗體濃度做為最佳抗原、抗體組合。由表I方陣結(jié)果可以確定包被原濃度為lmg/L，初步確定抗體工作濃度為I : 20000。表I抗體方陣測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種能識(shí)別孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞4B10，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為 CCTCC NO C201143o
3.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是用于檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫試劑盒。
5.一種用于檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫方法，包括免疫原、 包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)，其步驟如下(1)將半抗原對(duì)-[3_(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠與人血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原對(duì)-[3-(羧基)丙氧基]無色孔雀石綠與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCCNO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCCNO C201143的雜交瘤細(xì)胞4B10制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)取均質(zhì)后的組織樣品，用乙腈超聲提取、離心，取乙腈層用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)煤?O. 05體積％吐溫20的IOmM PH為7. 4的三羥甲基胺基甲烷-HCl溶液溶解，得到待測(cè)物；(7)取待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在動(dòng)物源性食品中孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能識(shí)別孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)孔雀石綠、無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法與試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞4B10所分泌的，該雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC201143。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)等步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別無色結(jié)晶紫、孔雀石綠、無色孔雀石綠，本發(fā)明的檢測(cè)方法和試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102608320SQ20121004521
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉振利, 彭大鵬, 戴夢(mèng)紅, 潘源虎, 王玉蓮, 翟長(zhǎng)友, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)