本發(fā)明屬于疫苗檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豬瘟基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
：豬瘟(slassicalswinefever，CFS)以出血和發(fā)熱為主要特征，呈急性或慢性經(jīng)過(guò)，是一種對(duì)豬危害性極大的傳染病，被國(guó)際獸疫局列為A類(lèi)動(dòng)物傳染病。目前使用的弱毒疫苗主要是中國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法國(guó)的Thireval疫苗。20世紀(jì)70年代后期，豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化。地區(qū)散發(fā)性流行及非典型豬瘟癥狀的發(fā)生，特別是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用單克隆抗體對(duì)C-株檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)有不同的反應(yīng)模式，豬瘟免疫屢屢失敗等，表明豬瘟病毒的抗原性可能存在著變異，從而有人對(duì)傳統(tǒng)弱毒疫苗提出了質(zhì)疑。隨著傳代次數(shù)的增加和對(duì)不同細(xì)胞的適應(yīng)性繁殖，疫苗毒株可能發(fā)生異質(zhì)性或抗原漂移加之?dāng)?shù)十年來(lái)CSFV在大規(guī)模免疫接種壓力下可能出現(xiàn)抗原變異。這些情況都表明，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗已不能適應(yīng)新形勢(shì)的需要，研究和開(kāi)發(fā)新型豬瘟疫苗機(jī)是大勢(shì)所趨。分子生物學(xué)技術(shù)的興起和發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)?；蛉笔醵疽呙?、亞單位疫苗和活載體疫苗是目前研究的熱點(diǎn)。豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗屬于滅活疫苗，由于采用靶動(dòng)物(豬)進(jìn)行免疫攻毒，存在檢測(cè)周期長(zhǎng)(約51天)，需要進(jìn)行強(qiáng)毒(豬瘟病毒石門(mén)系)攻擊檢驗(yàn)，急需建立一種替代動(dòng)物或其他的效力檢驗(yàn)方法用于滅活疫苗的效力檢驗(yàn)，以解決縮短檢測(cè)周期，節(jié)約檢測(cè)成本，提高生物安全等問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法，可替代用豬進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)，從而縮短檢測(cè)周期，并減少成本，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有亞單位疫苗效力檢驗(yàn)的空白。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的豬瘟基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法，包括以下步驟：1)取健康的易感家兔作為檢驗(yàn)對(duì)象，按照體重、性別隨機(jī)分為對(duì)照組和免疫組，免疫組至少設(shè)有2個(gè)平行組；2)對(duì)免疫組家兔進(jìn)行注射，注射待檢測(cè)的豬瘟基因工程亞單位疫苗，而對(duì)照組的家兔不注射任何物質(zhì)；注射疫苗的家兔和對(duì)照組的家兔按照正常飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)；3)步驟2)注射疫苗19日后，免疫組和對(duì)照組的家兔每日測(cè)溫一次；21日后，免疫組和對(duì)照組的家兔均注射脾淋源豬瘟活疫苗，注射疫苗后每6小時(shí)測(cè)溫一次，共測(cè)72小時(shí)；4)根據(jù)步驟3)注射脾淋源豬瘟活疫苗前后家兔體溫的變化，判定豬瘟基因工程亞單位疫苗是否達(dá)到保護(hù)作用，家兔體溫變化不超過(guò)1℃時(shí)判定為達(dá)到保護(hù)作用。優(yōu)選的，步驟1)中，所述的易感家兔，為豬瘟病毒ELISA抗體為陰性的家兔。優(yōu)選的，步驟1)中，所述的易感家兔，體重為1.5-3.0kg。優(yōu)選的，步驟1)中，所述的對(duì)照組不設(shè)平行組；所述的免疫組設(shè)有平行組，每個(gè)平行組設(shè)立的家兔只數(shù)與對(duì)照組相同。優(yōu)選的，步驟2)中，所述的豬瘟基因工程亞單位疫苗為293T-E2疫苗。本發(fā)明的方法在對(duì)豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行效力檢測(cè)時(shí)，可用家兔來(lái)替代豬進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)，由于檢驗(yàn)動(dòng)物家兔易獲得，節(jié)約檢驗(yàn)成本，且檢驗(yàn)周期短(約24天)，不涉及用豬瘟強(qiáng)毒攻擊，生物安全性高。具體實(shí)施方式本發(fā)明采用健康易感家兔免疫豬瘟基因工程亞單位疫苗，免疫后一定時(shí)間攻毒，通過(guò)兔體反應(yīng)熱判定疫苗的免疫效果，從而有效的節(jié)約檢驗(yàn)成本，且縮短了檢驗(yàn)周期。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1：一種豬瘟基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法，包括以下步驟：(1)取健康的易感(瘟病毒ELISA抗體均為陰性)家兔(體重為1.5-3.0kg)作為檢驗(yàn)對(duì)象，按照體重、性別，將20只家兔隨機(jī)分為4組，每組5只，3組作為免疫組，分別免疫201401、201402、201403批豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)，1組作為對(duì)照組；(2)對(duì)免疫組家兔的頸部進(jìn)行皮下靜脈注射，注射豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)(0.2ml/只)，而對(duì)照組的家兔不注射任何物質(zhì)；注射疫苗的家兔和對(duì)照組的家兔按照正常飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)；(3)步驟(2)注射疫苗19日后，免疫組和對(duì)照組的家兔每日測(cè)溫一次；21日后，免疫組和對(duì)照組的家兔均兔耳靜脈注射脾淋源豬瘟活疫苗(1.0ml/只)，注射疫苗后每6小時(shí)測(cè)溫一次，共測(cè)72小時(shí)；(4)根據(jù)步驟(3)注射脾淋源豬瘟活疫苗前后家兔體溫的變化，判定豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)是否達(dá)到保護(hù)作用，家兔體溫變化不超過(guò)1℃時(shí)判定為達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表1所示：表2：豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)對(duì)家兔的保護(hù)作用分組動(dòng)物種類(lèi)動(dòng)物數(shù)量保護(hù)率不保護(hù)率201401批免疫組家兔5只100％0％201402批免疫組家兔5只100％0％201403批免疫組家兔5只100％0％對(duì)照組家兔5只0％100％由表1、表2可知，家兔注射豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)免疫后21日，再次被病毒攻擊后，3批疫苗免疫家兔均無(wú)體溫反應(yīng)，保護(hù)率達(dá)到100％，而對(duì)照組5只家兔在攻毒后30小時(shí)，體溫開(kāi)始升高1.0℃以上，稽留12小時(shí)以上，保護(hù)率為0。實(shí)施例2：實(shí)施例1中所述的豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)效力檢驗(yàn)方法，以豬進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)時(shí)：取健康易感(瘟病毒PCR檢測(cè)陰性，ELISA抗體為陰性)的35-60日齡豬20頭，隨機(jī)分成4組，每組5頭；1-3組為免疫組，各頭頸部肌肉注射201401、201402、201403批豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)1.0ml/頭；第4組為對(duì)照組。免后35日，所有豬注射豬瘟病毒石門(mén)系強(qiáng)毒1.0ml/頭；攻毒前2日每日測(cè)量豬體溫兩次，攻毒后日測(cè)溫兩次，共測(cè)16日，觀察攻毒豬的臨床表現(xiàn)(眼結(jié)膜炎、食欲下降或食欲廢絕、便秘和腹瀉交替出現(xiàn)、精神沉郁)。根據(jù)攻毒前2日及攻毒后測(cè)溫和臨床觀察綜合判定，體溫變化不超過(guò)1℃時(shí)且無(wú)臨床表現(xiàn)判定為達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表表3、表4、表5所示：表3：攻毒豬臨床觀察和剖檢統(tǒng)計(jì)表注：“√”表示出現(xiàn)此癥狀或有體溫反應(yīng)；“-”表示無(wú)此癥狀或無(wú)體溫反應(yīng)。表5：豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)對(duì)30-60日齡豬保護(hù)作用分組動(dòng)物種類(lèi)動(dòng)物數(shù)量保護(hù)率不保護(hù)率201401批免疫組30-60日齡豬5頭100％0％201402批免疫組30-60日齡豬5頭100％0％201403批免疫組30-60日齡豬5頭100％0％對(duì)照組30-60日齡豬5頭0％100％上述的結(jié)果表明，3批疫苗免疫豬后，用強(qiáng)毒攻擊，測(cè)溫16日體溫未見(jiàn)明顯變化，臨床未見(jiàn)眼結(jié)膜炎、精神沉郁等癥狀，均健活，保護(hù)率均為100％，對(duì)照組攻毒后5/5發(fā)病，5/5死亡。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，用家兔進(jìn)行免疫攻毒和用豬進(jìn)行免疫攻毒結(jié)果是一致的。上述實(shí)例只是為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3