本發(fā)明涉及一種金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑的制備方法及應(yīng)用，屬于中藥炮制領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初開(kāi)的花，其性寒、味甘；歸肺、胃經(jīng)；具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效。作為藥食兩用的大宗中藥，金銀花具有很高的醫(yī)療保健作用和極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。金銀花采摘期為每年5至9月份，新鮮的金銀花顏色綠白、花蕾飽滿、含水量高、貯藏困難。金銀花主要保藏方法是采摘后立即脫水干制，目前我國(guó)金銀花的干燥方法主要采用熱風(fēng)干燥法。但金銀花經(jīng)熱風(fēng)干燥處理會(huì)產(chǎn)生酶促褐變并伴隨著綠原酸、木犀草苷等有效成分含量的降低，從而導(dǎo)致其藥用價(jià)值的降低，直接影響其品質(zhì)、外觀和商業(yè)價(jià)值。此外，金銀花花期長(zhǎng),開(kāi)花次數(shù)多(可達(dá)4-6茬)，傳統(tǒng)干燥工藝干燥后，僅1、2茬可達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，因此減緩、抑制金銀花的酶促褐變受到越來(lái)越多的關(guān)注。

目前防止金銀花褐變的主要措施有:熱風(fēng)干燥、真空干燥、微波真空聯(lián)合干燥、熱泵遠(yuǎn)紅外聯(lián)合干燥等干燥方法，近年也有人采用抗壞血酸、4-己基間苯二酚、l-半胱氨酸、檸檬酸、丙酮等單一抑制劑對(duì)提取的多酚氧化酶進(jìn)行體外抑制研究。

真空干燥、微波真空聯(lián)合干燥、熱泵遠(yuǎn)紅外聯(lián)合干燥等干燥方法存在設(shè)備投資大，且對(duì)金銀花中指標(biāo)性成分木犀草苷含量提高不明顯等問(wèn)題。

本發(fā)明利用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑，對(duì)新鮮金銀花褐變進(jìn)行控制，提高金銀花中指標(biāo)性成分木犀草苷含量，不僅可增加1-2茬金銀花的品質(zhì)，還可使3-4茬金銀花有可能達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，提高藥用金銀花的產(chǎn)量和質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)方多酚氧化酶抑制劑,所述抑制劑綠色環(huán)保，各組分協(xié)同效應(yīng)好,防褐變能力強(qiáng),能夠?qū)π迈r金銀花在干燥過(guò)程中的褐變進(jìn)行有效控制，對(duì)其指標(biāo)性成分木犀草苷的含量有明顯提高,對(duì)另一指標(biāo)性成分綠原酸的含量也有一定程度的提高。

所述金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑，其特征在于，含有曲酸、維生素c、β-環(huán)糊精、氯化鈉，為水溶液。

所述金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑水溶液中含有0.1～0.4％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的曲酸、0.005～0.015％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的維生素c、0.05～0.15％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的β-環(huán)糊精、0.5～1.5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉。優(yōu)選維生素c、β-環(huán)糊精、曲酸、氯化鈉質(zhì)量百分含量分別為0.01％、0.10％、0.40％、0.50％。

所述金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑以水為溶劑。

制備方法：將曲酸、維生素c、β-環(huán)糊精、氯化鈉溶于蒸餾水中即可。

本發(fā)明的金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑用于控制新鮮金銀花褐變，提高金銀花中指標(biāo)性成分木犀草苷含量。

進(jìn)一步將待處理的新鮮金銀花浸泡在配制好的金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制劑水溶液中120分鐘，瀝干水分后，風(fēng)干干燥；優(yōu)選，金銀花與復(fù)方多酚氧化酶抑制劑水溶液的質(zhì)量比為1:8。

采用本發(fā)明金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制處理金銀花后木犀草苷含量的測(cè)定方法，其特征在于，采用高效液相色譜法，具體操作如下：

①對(duì)照品溶液的制備

精密稱定1.06mg木犀草苷對(duì)照品，10.02mg綠原酸對(duì)照品，置25ml棕色量瓶中，加入70％乙醇溶解并定容，配制成每1ml含42.40μg的木犀草苷，含400.80μg的綠原酸的混合對(duì)照品溶液，冰箱冷藏保存；

②供試品溶液的制備

精密稱取金銀花粉末(過(guò)四號(hào)篩)約2g，置200ml具塞錐形瓶中，精密入70％乙醇50ml，稱定重量，超聲(功率250w,頻率35khz)60min，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補(bǔ)足減失量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10ml，揮干溶劑，殘?jiān)?0％乙醇溶解，置5ml棕色量瓶中，加70％乙醇定容，搖勻，即得；上述70％乙醇指的是質(zhì)量百分含量為70％的乙醇水溶液；

③含量測(cè)定色譜條件

色譜柱：色譜柱：zorbaxsb-phenyl柱，4.6mm×250mm，3.5μm，柱溫：20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm，流速：1ml/min，流動(dòng)相：乙腈-質(zhì)量百分含量為5％冰醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，0～15min，10％乙腈→20％乙腈；15～32min，20％乙腈；32～38min，20％乙腈→35％乙腈；38～40min，35％乙腈→10％乙腈；40～50min，10％乙腈，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm，柱溫：20℃，進(jìn)樣量：10μl，理論板數(shù)按木犀草苷計(jì)算不低于20000，上述乙腈的百分含量為乙腈在流動(dòng)相的體積百分含量；

采用本發(fā)明的抑制劑能明顯提高木犀草苷的含量,對(duì)另一指標(biāo)性成分綠原酸的含量也有一定程度的提高。采用本發(fā)明的木犀草苷含量的測(cè)定方法，是對(duì)藥典的改進(jìn)，能準(zhǔn)確測(cè)得木犀草苷含量。

附圖說(shuō)明

圖1為木犀草苷含量測(cè)定線性關(guān)系圖；

圖2為木犀草苷+綠原酸混合對(duì)照品hplc圖；

圖3為直接干燥的金銀花中木犀草苷hplc圖；

圖4為采用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑處理后的金銀花中木犀草苷hplc圖；

圖5為綠原酸含量測(cè)定線性關(guān)系圖；

圖6為綠原酸對(duì)照品hplc圖；

圖7為直接干燥的金銀花中綠原酸hplc圖；

圖8為采用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑處理后的金銀花中綠原酸hplc圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

采用本發(fā)明金銀花多酚氧化酶復(fù)合抑制處理金銀花后木犀草苷含量的測(cè)定方法，采用高效液相色譜法，具體操作如下：

④對(duì)照品溶液的制備

精密稱定1.06mg木犀草苷對(duì)照品，10.02mg綠原酸對(duì)照品，置25ml棕色量瓶中，加入70％乙醇溶解并定容，配制成每1ml含42.40μg的木犀草苷，含400.80μg的綠原酸的混合對(duì)照品溶液，冰箱冷藏保存；

⑤供試品溶液的制備

精密稱取金銀花粉末(過(guò)四號(hào)篩)約2g，置200ml具塞錐形瓶中，精密入70％乙醇50ml，稱定重量，超聲(功率250w,頻率35khz)60min，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補(bǔ)足減失量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10ml，揮干溶劑，殘?jiān)?0％乙醇溶解，置5ml棕色量瓶中，加70％乙醇定容，搖勻，即得；上述70％乙醇指的是質(zhì)量百分含量為70％的乙醇水溶液；

⑥含量測(cè)定色譜條件

色譜柱：色譜柱：zorbaxsb-phenyl柱，4.6mm×250mm，3.5μm，柱溫：20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm，流速：1ml/min，流動(dòng)相：乙腈-質(zhì)量百分含量為5％冰醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，0～15min，10％乙腈→20％乙腈；15～32min，20％乙腈；32～38min，20％乙腈→35％乙腈；38～40min，35％乙腈→10％乙腈；40～50min，10％乙腈，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm，柱溫：20℃，進(jìn)樣量：10μl，理論板數(shù)按木犀草苷計(jì)算不低于20000，上述乙腈的百分含量為乙腈在流動(dòng)相的體積百分含量。

所述綠原酸的含量的測(cè)定方法按《中國(guó)藥典》2015版綠原酸的測(cè)定方法進(jìn)行，具體操作如下：

①綠原酸對(duì)照品溶液的制備精密稱定10.02mg綠原酸對(duì)照品，置25ml棕色量瓶中，加入50％甲醇溶解并定容；再精密量取1ml，置10ml棕色量瓶中，加入50％甲醇定容，配制成每1ml含40.08μg的綠原酸對(duì)照品溶液，冰箱冷藏保存。

②綠原酸供試品溶液的制備精密稱取金銀花粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.5g，置200ml具塞錐形瓶中，精密加入50％甲醉50ml，稱定重量。超聲處理(功率250w，頻率35khz)30min，放冷，再稱定重量，用50％甲醇補(bǔ)足減失量，搖勻，濾過(guò)。精密移取續(xù)濾液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

③綠原酸含量測(cè)定色譜條件色譜柱：inertsilods-3c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.4％磷酸溶液(13:87)，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10μl，理論板數(shù)按綠原酸計(jì)算不低于1000。

實(shí)施例1

1、新鮮金銀花的褐變抑制

(1)原料金銀花的選擇:選擇新鮮、無(wú)病害、表皮無(wú)明顯損傷、無(wú)發(fā)黃的新鮮的金銀花花蕾。

本實(shí)施例中金銀花于2016年7月28日采自河北省邢臺(tái)市巨鹿(第三茬金銀花)。

(2)復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方一的配置：將維生素c、β-環(huán)糊精、曲酸、氯化鈉分別按照質(zhì)量百分比0.01％、0.10％、0.40％、0.50％進(jìn)行稱量并溶解在100ml水中。

(3)防褐變處理:將挑選好的金銀花按1:8(質(zhì)量比)的料液比浸泡在配制好的復(fù)方多酚氧化酶抑制劑水溶液中120分鐘后取出瀝干。

(4)干燥處理，將用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方一處理的金銀花樣品和未處理的金銀花同時(shí)用熱風(fēng)干燥法干燥處理。

2、褐變抑制效果評(píng)價(jià)：藥典規(guī)定金銀花按干燥品計(jì)算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色譜法測(cè)定，直接進(jìn)行熱風(fēng)干燥的金銀花中木犀草苷含量為0.04356％，采用配方一處理的金銀花中木犀草苷含量為0.06706％，經(jīng)配方一處理的第三茬金銀花中木犀草苷含量比直接熱風(fēng)干燥的提高了53.95％，并達(dá)到了藥典要求，綠原酸含量提高了11.34％。

實(shí)施例2

1、新鮮金銀花的褐變抑制

(1)原料金銀花的選擇:選擇新鮮、無(wú)病害、表皮無(wú)明顯損傷、無(wú)發(fā)黃的新鮮的金銀花花蕾。

本實(shí)施例中金銀花于2016年7月28日采自河北省邢臺(tái)市巨鹿(第三茬金銀花)。

(2)復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方二的配置：將維生素c、β-環(huán)糊精、曲酸、氯化鈉分別按照質(zhì)量百分比0.015％、0.10％、0.40％、1.00％進(jìn)行稱量并溶解在100ml水中。

(3)防褐變處理:將挑選好的金銀花按1:8(質(zhì)量比)的料液比浸泡在配制好的復(fù)方多酚氧化酶抑制劑水溶液中120分鐘后取出瀝干。

(4)干燥處理，將用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方二處理的金銀花樣品和未處理的金銀花同時(shí)用熱風(fēng)干燥法干燥處理。

2、褐變抑制效果評(píng)價(jià)：藥典規(guī)定金銀花按干燥品計(jì)算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色譜法測(cè)定，直接進(jìn)行熱風(fēng)干燥的金銀花中木犀草苷含量為0.04356％，采用配方二處理的金銀花中木犀草苷含量為0.06588％，經(jīng)配方二處理的第三茬金銀花中木犀草苷含量比直接熱風(fēng)干燥的提高了51.24％，并達(dá)到了藥典要求，綠原酸含量提高了13.56％。

實(shí)施例3

1、新鮮金銀花的褐變抑制

(1)原料金銀花的選擇:選擇新鮮、無(wú)病害、表皮無(wú)明顯損傷、無(wú)發(fā)黃的新鮮的金銀花花蕾。

本實(shí)施例中金銀花于2016年7月28日采自河北省邢臺(tái)市巨鹿(第三茬金銀花)。

(2)復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方三的配置：將維生素c、β-環(huán)糊精、曲酸、氯化鈉分別按照質(zhì)量百分比0.015％、0.10％、0.25％、0.50％進(jìn)行稱量并溶解在100ml水中。

(3)防褐變處理:將挑選好的金銀花按1:8(質(zhì)量比)的料液比浸泡在配制好的復(fù)方多酚氧化酶抑制劑水溶液中120分鐘后取出瀝干。

(4)干燥處理，將用復(fù)方多酚氧化酶抑制劑配方三處理的金銀花樣品和未處理的金銀花同時(shí)用熱風(fēng)干燥法干燥處理。

2、褐變抑制效果評(píng)價(jià)：藥典規(guī)定金銀花按干燥品計(jì)算，含木犀草苷不得少于0.050％。采用高效液相色譜法測(cè)定，直接進(jìn)行熱風(fēng)干燥的金銀花中木犀草苷含量為0.04356％，采用配方三處理的金銀花中木犀草苷含量為0.06350％，經(jīng)配方三處理的第三茬金銀花中木犀草苷含量比直接熱風(fēng)干燥的提高了45.77％，并達(dá)到了藥典要求，綠原酸含量提高了10.74％。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,以上三種復(fù)方多酚氧化酶抑制劑對(duì)于金銀花中木犀草苷含量均有明顯提高，并且均使試驗(yàn)所用的第三茬金銀花中木犀草苷含量達(dá)到藥典要求，其中配方一效果最好。由此可見(jiàn)復(fù)方多酚氧化酶抑制劑能夠?qū)π迈r金銀花的褐變進(jìn)行有效控制，顯著提高其指標(biāo)性成分木犀草苷的含量，另一指標(biāo)性成分綠原酸的含量也有所提高，使3茬金銀花可做藥用，增加了金銀花的產(chǎn)量和質(zhì)量，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。