本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器的方法。
背景技術(shù)：
甘油是一種重要的微生物碳源，在發(fā)酵生產(chǎn)中，甘油作為碳源廣泛應(yīng)用于基因工程菌培養(yǎng)及生物活性大分子表達(dá)，其濃度過高將延遲外源蛋白表達(dá)，而濃度過低則造成細(xì)胞生長不良或生長緩慢，延長高密度發(fā)酵時間。所以發(fā)酵液中甘油含量的監(jiān)控是保證高發(fā)酵單位的關(guān)鍵。而且甘油作為一種重要的生物化工產(chǎn)品及平臺化合物，其來源及應(yīng)用均極其廣泛，無論是傳統(tǒng)皂化廢液蒸餾法，還是作為生物柴油副產(chǎn)物，甘油的生產(chǎn)及質(zhì)量控制均離不開甘油含量的精準(zhǔn)而快速的檢測。另外，甘油濃度測定在食品和酒精飲料質(zhì)量和鑒別真?zhèn)畏矫嬉簿哂兄匾獞?yīng)用，所以甘油濃度的測定受到法律的嚴(yán)格監(jiān)管，亦是各種飲料基質(zhì)質(zhì)量監(jiān)控的常規(guī)手段。
目前，國內(nèi)有關(guān)甘油的分析方法，主要有甘油激酶法、分光光度法原子吸收法，氣相色譜法、高效液相色譜法和甘油檢測試劑盒測定法。然而，甘油激酶法，則不適于顏色樣品、以及成分復(fù)雜，干擾物較多的樣品；分光光度法原子吸收法操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)精度低，耗時長，誤差大；氣相色譜法、高效液相色譜法，雖然精度高，但所需儀器昂貴，需要專業(yè)人員操作；甘油檢測試劑盒測定準(zhǔn)確而快速，但其價格昂貴，成本較高，不適于國內(nèi)實(shí)際生產(chǎn)中對甘油含量的監(jiān)控。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的一種基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器的方法。
基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器的方法，包括以下步驟；
S1：研制雙酶固定化技術(shù)及工藝，包括酶及固定化載體的篩選和雙酶固定化技術(shù)及方法的研究，研究甘油生物傳感器相關(guān)的酶的性質(zhì)，篩選出適于快速催化甘油傳感器的酶，并在確定酶的基礎(chǔ)上，研究不同的酶固定載體及固定化模式，篩選出適宜的固定化載體，再研究能夠反復(fù)使用，并保持高穩(wěn)定性、高壽命的固定化技術(shù)和配方，制造出節(jié)省酶使用量且具有高壽命、高穩(wěn)定性的能夠安裝于過氧化氫電極上的酶膜，研究出最有效的雙酶固定化方法；
S2：研制最適宜的電極系統(tǒng)和最完善的配套試劑，選取最優(yōu)的電極和電極修飾材料，進(jìn)行雙酶電極的自組裝，設(shè)計電極與酶膜的組裝模式，并研究保持電極壽命及酶膜高活性、高穩(wěn)定性及高壽命的配套試劑；
S3：研究出最有效的生物反應(yīng)系統(tǒng)和流動注射系統(tǒng)，按照雙酶固定化方法，將過氧化氫雙酶電極固定于反應(yīng)池一側(cè)，構(gòu)建生物反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)樣品與過氧化氫雙酶電極的接觸，甘油在雙酶的作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，響應(yīng)電流作為儀器分析的原始信號，再設(shè)計蠕動泵、進(jìn)樣閥、管道組成流動注射系統(tǒng)，并由程序統(tǒng)一控制，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)池溶液的自動攝入和排出，為雙酶電極的生化反應(yīng)提供適宜的液體環(huán)境和管路系統(tǒng)，生物反應(yīng)系統(tǒng)和流動注射系統(tǒng)協(xié)調(diào)工作，完成甘油傳感器的生物反應(yīng)及信號輸出；
S4：進(jìn)行軟件開發(fā)和硬件設(shè)計將酶電極系統(tǒng)和流動注射分析系統(tǒng)組裝在一起，并結(jié)合配套的軟件和硬件，即研制出基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器。
優(yōu)選的，所述雙酶是指甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
優(yōu)選的，所述雙酶固定化技術(shù)及方法的研究包括比較牛血清蛋白-戊二醛膜固定化、尼龍網(wǎng)共價固定化、以及牛血清蛋白-戊二醛、尼龍網(wǎng)共價混合固定化三種固定化膜的生物活性、穩(wěn)定性。
優(yōu)選的，所述最適宜的電極為過氧化氫電極和鉑金電極的組合。
優(yōu)選的，所述甘油含量檢測的原理為甘油在甘油激酶作用下，被ATP(Mg2+)氧化成甘油三磷酸，甘油三磷酸經(jīng)甘油磷酸氧化酶氧化生成甘油酮三磷酸，反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化氫電極上產(chǎn)生電流，電流大小與甘油濃度成正比，根據(jù)電流大小確定甘油含量，反應(yīng)方程式如下：
優(yōu)選的，所述配套試劑的研究內(nèi)容包括甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的電化學(xué)響應(yīng)與溫度、pH、離子強(qiáng)度、流動速度、底物混合、擴(kuò)散、傳遞、停留時間的相關(guān)性，依據(jù)這些條件研制保護(hù)酶膜并創(chuàng)造酶反應(yīng)最適條件的專用輔助材料，并確定試劑的儲存條件及有效期。
優(yōu)選的，所述生物反應(yīng)系統(tǒng)包括有機(jī)玻璃流動反應(yīng)池、過氧化氫電極、蠕動泵、進(jìn)樣閥和管道。
優(yōu)選的，所述硬件設(shè)計是以32位ARM芯片LPC1788為處理核心，通過RS232-USB通訊接口來實(shí)現(xiàn)與上位機(jī)PC的交互式監(jiān)控，并對電路板的設(shè)計、布局、布線進(jìn)行研究。
本發(fā)明的研制過程詳細(xì)，研究方法多樣化，研究數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，所研制的生物傳感器選擇高性能載體，建立穩(wěn)定高效的雙酶固定化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)同一酶膜上兩種酶分層分布，在開發(fā)高性能雙酶固定酶電極基礎(chǔ)上建立新型智能化、簡易化甘油生物傳感器，其檢測靈敏度高，檢測周期短，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵同步化實(shí)時監(jiān)控，適于方便快捷的進(jìn)行現(xiàn)場定量檢測；操作過程簡單，檢測時無需繁瑣的樣品凈化和富集等前處理，使用成本低，需要樣品量低，樣品顏色及顏色變化、分子結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)對樣品測定結(jié)果無影響，人力消耗少，檢測效率高，適用范圍廣。
附圖說明
圖1為本發(fā)明提出的基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器的方法的路線圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解說。
本發(fā)明提出的基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器的方法，包括以下步驟；
S1：研制雙酶固定化技術(shù)及工藝，包括酶及固定化載體的篩選和雙酶固定化技術(shù)及方法的研究，研究甘油生物傳感器相關(guān)的酶的性質(zhì)，篩選出適于快速催化甘油傳感器的酶，并在確定酶的基礎(chǔ)上，研究不同的酶固定載體及固定化模式，篩選出適宜的固定化載體，再研究能夠反復(fù)使用，并保持高穩(wěn)定性、高壽命的固定化技術(shù)和配方，制造出節(jié)省酶使用量且具有高壽命、高穩(wěn)定性的能夠安裝于過氧化氫電極上的酶膜，研究出最有效的雙酶固定化方法；
S2：研制最適宜的電極系統(tǒng)和最完善的配套試劑，選取最優(yōu)的電極和電極修飾材料，進(jìn)行雙酶電極的自組裝，設(shè)計電極與酶膜的組裝模式，并研究保持電極壽命及酶膜高活性、高穩(wěn)定性及高壽命的配套試劑；
S3：研究出最有效的生物反應(yīng)系統(tǒng)和流動注射系統(tǒng)，按照雙酶固定化方法，將過氧化氫雙酶電極固定于反應(yīng)池一側(cè)，構(gòu)建生物反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)樣品與過氧化氫雙酶電極的接觸，甘油在雙酶的作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，響應(yīng)電流作為儀器分析的原始信號，再設(shè)計蠕動泵、進(jìn)樣閥、管道組成流動注射系統(tǒng)，并由程序統(tǒng)一控制，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)池溶液的自動攝入和排出，為雙酶電極的生化反應(yīng)提供適宜的液體環(huán)境和管路系統(tǒng)，生物反應(yīng)系統(tǒng)和流動注射系統(tǒng)協(xié)調(diào)工作，完成甘油傳感器的生物反應(yīng)及信號輸出；
S4：進(jìn)行軟件開發(fā)和硬件設(shè)計將酶電極系統(tǒng)和流動注射分析系統(tǒng)組裝在一起，并結(jié)合配套的軟件和硬件，即研制出基于雙酶固定化技術(shù)的甘油快速測定生物傳感器。
本發(fā)明中，所述雙酶是指甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
本發(fā)明中，所述雙酶固定化技術(shù)及方法的研究包括比較牛血清蛋白-戊二醛膜固定化、尼龍網(wǎng)共價固定化、以及牛血清蛋白-戊二醛、尼龍網(wǎng)共價混合固定化三種固定化膜的生物活性、穩(wěn)定性。
本發(fā)明中，所述最適宜的電極為過氧化氫電極和鉑金電極的組合。
本發(fā)明中，所述甘油含量檢測的原理為甘油在甘油激酶作用下，被ATP(Mg2+)氧化成甘油三磷酸，甘油三磷酸經(jīng)甘油磷酸氧化酶氧化生成甘油酮三磷酸，反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化氫電極上產(chǎn)生電流，電流大小與甘油濃度成正比，根據(jù)電流大小確定甘油含量，反應(yīng)方程式如下：
本發(fā)明中，所述配套試劑的研究內(nèi)容包括甘油激酶和甘油磷酸氧化酶的電化學(xué)響應(yīng)與溫度、pH、離子強(qiáng)度、流動速度、底物混合、擴(kuò)散、傳遞、停留時間的相關(guān)性，依據(jù)這些條件研制保護(hù)酶膜并創(chuàng)造酶反應(yīng)最適條件的專用輔助材料，并確定試劑的儲存條件及有效期。
本發(fā)明中，所述生物反應(yīng)系統(tǒng)包括有機(jī)玻璃流動反應(yīng)池、過氧化氫電極、蠕動泵、進(jìn)樣閥和管道。
本發(fā)明中，所述硬件設(shè)計是以32位ARM芯片LPC1788為處理核心，通過RS232-USB通訊接口來實(shí)現(xiàn)與上位機(jī)PC的交互式監(jiān)控，并對電路板的設(shè)計、布局、布線進(jìn)行研究。
本發(fā)明的研制過程詳細(xì)，研究方法多樣化，研究數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，所研制的生物傳感器選擇高性能載體，建立穩(wěn)定高效的雙酶固定化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)同一酶膜上兩種酶分層分布，在開發(fā)高性能雙酶固定酶電極基礎(chǔ)上建立新型智能化、簡易化甘油生物傳感器，其檢測靈敏度高，檢測周期短，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵同步化實(shí)時監(jiān)控，適于方便快捷的進(jìn)行現(xiàn)場定量檢測；操作過程簡單，檢測時無需繁瑣的樣品凈化和富集等前處理，使用成本低，需要樣品量低，樣品顏色及顏色變化、分子結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)對樣品測定結(jié)果無影響，人力消耗少，檢測效率高，適用范圍廣。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。