羧基改性漂珠固定化漆酶及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術(shù)領域，具體涉及一種羧基改性漂珠固定化漆酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有四個銅離子的多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族。漆酶主要分布在一些高等植物如漆樹及一些真菌如白腐菌中，不同來源的漆酶結(jié)構(gòu)上也不盡相同，因此其生物特性也有差異。漆酶能夠降解多種酚類和芳胺類化合物，具有良好的底物專一性和穩(wěn)定性，因而在廢水處理、生物漂白和生物傳感器構(gòu)建等方面具有重要的應用前景。由于游離漆酶易溶于水，酶存活時間短，活性不穩(wěn)定，使用后不易回收再利用，限制了其在實際生產(chǎn)中的應用。
[0003]酶的固定化技術(shù)是實現(xiàn)酶連續(xù)使用和改善酶穩(wěn)定性的有效手段。固定化酶與游離酶相比具有很多優(yōu)點，它能夠延長酶的使用壽命，提高酶的穩(wěn)定性及其對環(huán)境的適應性，因而能夠克服直接使用游離酶的不足。
[0004]固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學的方法固定在有機或無機的載體上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。常用的載體有多孔玻璃、殼聚糖、硅藻鹽和纖維素等。固定化漆酶的制備方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵鍵合法和交聯(lián)結(jié)合法。吸附法是指將酶液與石墨、碳纖維、過渡金屬或其氧化物等活潑載體接觸，使酶通過分子間相互作用力吸附在載體上的固定化方法。物理吸附的優(yōu)點在于其操作簡單、造價低廉、固定化酶初始活性較高，但固定化酶容易因酶和載體結(jié)合力不強，脫落而失活。包埋法是將漆酶物理包埋于高聚物網(wǎng)格內(nèi)或微囊內(nèi)的方法，一般反應條件溫和，對酶自身的結(jié)構(gòu)改變很少，因此酶活性損失較小，但包埋法處理的固定化酶僅適合于底物和產(chǎn)物均為小分子的催化反應，對有大分子參與的催化反應過程較差。交聯(lián)法就是借助雙功能團或多功能團試劑，使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定化酶的方法，由于交聯(lián)法反應條件劇烈，單獨使用交聯(lián)法固定化漆酶的效果不佳。共價鍵鍵合法是指酶分子上的非活性官能團與載體上的活化基團反應，形成穩(wěn)定的化學共價鍵的方法，使酶與載體形成牢固結(jié)合，不易發(fā)生酶的脫落，但共價鍵鍵和法存在反應條件較為苛刻，加工工藝較長，固定化效率較低的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有方法的缺點，提供一種操作簡單，條件溫和的固定化漆酶及其制備方法，該固定化漆酶可以方便、高效率的去除水中的染料等有機污染物。
[0006]本發(fā)明的一種羧基改性漂珠固定化漆酶的制備方法，其特征按如下步驟實施:
[0007](I)胺基改性漂珠的制備:
[0008]粉煤灰漂珠經(jīng)200目和250目的不銹鋼篩子篩分，取粒徑為200-250目之間的顆粒。放入2mol/L的鹽酸溶液中浸泡洗滌60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，備用。取經(jīng)過酸洗的漂珠放入異丙醇與去離子水的混合溶液中，攪拌形成懸浮液，在室溫條件下滴加胺基硅烷的醇水溶液，滴加完畢后，繼續(xù)反應12-24h。反應結(jié)束后，過濾分離得到的固體，用醇水混合溶液洗滌顆粒表面，去掉未反應的胺基硅烷，得到的固體即為胺基改性漂珠。
[0009](2)羧基改性漂珠的制備:
[0010]在燒瓶中加入N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)、胺基改性漂珠，向其中滴加馬來酸酐的DMF溶液，滴加結(jié)束后，在室溫下24-48h。反應結(jié)束后，過濾分離得到的固體，用DMF洗滌顆粒表面，去掉未反應的馬來酸酐，得到的固體即為羧基改性漂珠。
[0011](3)羧基改性漂珠固定化漆酶的制備:
[0012]在燒瓶中加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)，羧基改性漂珠和漆酶溶液，在室溫條件下攪拌吸附固化24-48h，反應結(jié)束后過濾分離，用緩沖液反復洗滌，直至上清液中檢測不到蛋白質(zhì)。得到的固體顆粒即為羧基改性漂珠固定化漆酶，保存于4°C的冰箱中備用。
[0013]上述所述(I)中胺基硅烷可以是γ-胺丙基三乙氧基硅烷、γ-胺丙基三甲氧基硅烷、Ν-(β-氨乙基)-γ-胺丙基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三乙氧基硅烷、苯胺基甲基三甲氧基硅烷中的一種或二種混合物。
[0014]上述所述⑴中漂珠與胺基硅烷的質(zhì)量比為(8-2): I。
[0015]上述所述(2)中胺基改性漂珠與馬來酸酐的質(zhì)量比為1: (5-12)。
[0016]上述所述(3)中漆酶溶液為將漆酶溶解于0.lmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)，質(zhì)量濃度為20g/L。
[0017]上述所述(3)中羧基改性漂珠與漆酶溶液的質(zhì)量比為1: (2-10)。
[0018]本發(fā)明的羧基改性漂珠中含有大量游離的羧基官能團，羧基官能團能夠與漆酶分子結(jié)構(gòu)中的胺基形成靜電結(jié)合，形成固定化漆酶，提高漆酶的穩(wěn)定性和重復利用率，羧基改性漂珠固定化漆酶可以直接用于含有染料等有機廢水中。由于漂珠具有良好的機械性能和漂浮性能，使用過程中適當?shù)臋C械攪拌作用可形成懸浮體系，催化反應結(jié)束后，撤掉機械攪拌作用，固定化漆酶即可漂浮在溶液表層，極易進行機械分離。
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]粉煤灰漂珠經(jīng)200目和250目的不銹鋼篩子篩分，取粒徑為200-250目之間的顆粒。將20g漂珠放入2mol/L的鹽酸溶液10mL中浸泡洗滌60min，水洗去除酸液后，放入烘箱烘干，備用。取酸洗漂珠5g放入50mL異丙醇與去離子水的混合溶液(9: I)中，開啟磁力攪拌，使之形成懸浮液。在室溫條件下滴加1g質(zhì)量濃度為10%的γ-胺丙基三乙基硅烷醇水溶液(異丙醇:去離子水=9: 1)，滴加完畢后，繼續(xù)反應12h。反應結(jié)束后，過濾分離得到的固體，用醇水混合溶液洗滌顆粒表面3-5次，去掉未反應的胺基硅烷，得到的固體即為胺基改性漂珠。
[0022]在燒瓶中加入10mL DMF、5g胺基改性漂珠，向其中滴加28g馬來酸酐的DMF溶液(5mol/L)，滴加結(jié)束后，在室溫下24h。反應結(jié)束后，過濾分離得到的固體，用DMF洗滌顆粒表面，去掉未反應的馬來酸酐，得到的固體即為羧基改性漂珠。
[0023]在燒瓶中加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6.0)50mL，羧基改性漂珠5g、漆酶溶液25mL，在室溫條件下攪拌反應24h，反應結(jié)束后過濾