本發(fā)明涉及顯微觀察植物樣品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物組織石蠟切片方法，具體涉及一種有效觀測(cè)油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的石蠟切片方法。

背景技術(shù)：

油棕(Elaeis guineensis Jacq.)屬于棕櫚科油棕屬的多年生木本油料作物，是世界上生產(chǎn)效率最高的產(chǎn)油植物，有“世界油王”之稱。油棕用途廣泛，主要產(chǎn)品為棕櫚油和棕櫚仁油，在食品、化工及生物能源等方面都有使用。

油棕在自然界的生殖方式為有性生殖方式，花是其重要的生殖器官。油棕的花為雌雄同株異序，雌蕊包括柱頭、花柱和子房，子房受精后發(fā)育成為果實(shí)，而子房中的胚珠發(fā)育成為種子。雌蕊解剖結(jié)構(gòu)研究作為鑒定種質(zhì)資源的重要依據(jù)之一，常作為評(píng)價(jià)植物結(jié)果情況和適應(yīng)性強(qiáng)弱的重要手段，主要是通過(guò)利用植物組織切片在顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)的特征而得以實(shí)現(xiàn)。因此，探索有效獲得切片的方法在鑒定評(píng)價(jià)大量油棕種質(zhì)時(shí)有重要的應(yīng)用價(jià)值，有利于縮短油棕種質(zhì)資源的鑒定周期。

作為植物組織切片的主要方式，冷凍切片雖然制作周期短，但由于油棕雌蕊本身組織結(jié)構(gòu)易褐化、組織結(jié)構(gòu)密實(shí)，冷凍切片切出的片子結(jié)構(gòu)不易完整，切出片子無(wú)法長(zhǎng)久保存，而且在冷凍切片過(guò)程每次都需取新鮮樣品進(jìn)行固定和切片，很受取樣的限制，不夠靈活，不適宜于油棕雌蕊的觀察。

探索適合的石蠟切片技術(shù)應(yīng)用于油棕組織解剖結(jié)構(gòu)及細(xì)胞學(xué)研究中是一個(gè)重要問(wèn)題，以前雖有其它植物組織石蠟切片的報(bào)道，但是，不同種類的植物組織有不同的特性，相關(guān)結(jié)果雖然有借鑒意義，卻不能完全應(yīng)用于油棕組織切片研究。

目前，尚未見(jiàn)將石蠟切片技術(shù)應(yīng)用于油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種有效觀測(cè)油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的石蠟切片方法，采用石蠟切片技術(shù)可有效獲得結(jié)構(gòu)清晰、完整的石蠟切片，有利于根據(jù)雌蕊的解剖結(jié)構(gòu)開(kāi)展油棕種質(zhì)資源的鑒定和評(píng)價(jià)工作，對(duì)于培育或篩選適合我國(guó)栽培的油棕品種或種質(zhì)資源具有重要意義。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種有效觀察油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的石蠟切片方法，包括以下步驟：

(1)取樣固定：首先摘取所要觀察油棕整個(gè)的雌花序，帶回實(shí)驗(yàn)室立刻進(jìn)行選擇分割，選擇需要觀察的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來(lái)，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開(kāi)，立刻將柱頭與子房一塊放入盛有卡諾固定液的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數(shù)目為4～6個(gè)，當(dāng)所需的樣品選取完后，用橡皮筋將牙簽扎有8～12個(gè)洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1～1.5個(gè)小時(shí)；其中：樣品與卡諾固定液的質(zhì)量體積比為1：16～1：20(g/ml)，卡諾固定液是按體積比3：1將乙醇與乙酸均勻混合構(gòu)成；后面所述步驟中的材料與浸泡液的質(zhì)量體積比范圍均為1：16～1：20(g/ml)；針對(duì)油棕雌蕊中胚珠非常接近花托部位的特點(diǎn)，本發(fā)明該步驟的取樣操作能夠有效觀察到油棕雌蕊中的胚珠結(jié)構(gòu)；

(2)保存：樣品經(jīng)抽真空固定后，經(jīng)濃度95％乙醇、85％乙醇，每級(jí)浸泡20～25min，之后轉(zhuǎn)入濃度70％乙醇中浸泡2～3d保存?zhèn)溆?，保存溫度?6～18℃。保存溫度為16～18℃有利于降低油棕組織的生命代謝過(guò)程，而又不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生凍害作用，可以保存較長(zhǎng)時(shí)間。

(3)整染：將保存后的樣品轉(zhuǎn)入濃度50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5～6h后，轉(zhuǎn)入愛(ài)氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將扎有8～12個(gè)洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1個(gè)小時(shí)后，繼續(xù)放置在真空干燥器中，時(shí)間為20～24h，之后從真空干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續(xù)放置48～52h；其中乙醇-乙二醇混合溶液是按體積比4：1將乙醇與乙二醇混合構(gòu)成。乙醇-乙二醇混合溶液對(duì)樣品的脫水較為溫和，并且減少引起樣品脫水過(guò)程中嚴(yán)重收縮和變硬的現(xiàn)象。針對(duì)油棕雌蕊結(jié)構(gòu)密實(shí)的特點(diǎn)，將油棕雌蕊放入愛(ài)氏蘇木精稀釋液中進(jìn)行真空抽氣，不僅能夠縮短染色時(shí)間，提高切片效率，而且能夠使愛(ài)氏蘇木精稀釋液盡快滲透到油棕雌蕊內(nèi)部，使油棕雌蕊內(nèi)部組織染上顏色，提高染色質(zhì)量。

(4)水洗、返藍(lán)：樣品經(jīng)愛(ài)氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗3～4次，中間每次浸泡1～2h，最后一次浸泡12～15h，之后用自來(lái)水返藍(lán)，換水4～6次，每次2～3min，最后蒸餾水過(guò)一遍，浸泡5～7h。

(5)脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡5～7h后，經(jīng)過(guò)脫水劑逐級(jí)脫水后，再經(jīng)氯仿逐級(jí)透明后，先加入純氯仿40～50％體積的碎蠟?zāi)?，?6℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟?zāi)≡诼确轮?，?6℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液、無(wú)水乙醇；上述各種濃度的乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液中，無(wú)水乙醇與乙二醇的體積比為4：1；依次經(jīng)七種脫水劑脫水時(shí)間依次為14～15h、3h、3h、3h、14～15h、3h、3h。

(6)透蠟、包埋：加碎蠟?zāi)蟮臉悠方?jīng)濃度50％石蠟，濃度70％石蠟各浸泡3h，再經(jīng)純蠟A、純蠟B、純蠟C三杯，每杯浸泡50min，包埋時(shí)樣品橫臥，樣品與石蠟的體積比為1：60～1：80；

(7)修蠟塊、切片：將包埋樣品后的蠟塊分割，修整，修整好的蠟塊固定在底板后，進(jìn)一步修成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，油棕雌蕊縱切，切片厚度為11～15μm；

(8)展片、粘片、烘干：選取所需蠟帶進(jìn)行粘片，于溫度為35℃的電熱展片臺(tái)展片后，將材料平放在鋪有白色A4紙的托盤(pán)上，放置在溫度為36℃鼓風(fēng)干燥箱中，直至烘干；其中粘片時(shí)所選的高品質(zhì)載玻片需用新醫(yī)用脫脂棉擦干凈，肉眼觀察透亮無(wú)雜物，所選的蠟帶長(zhǎng)度小于封片時(shí)所用蓋玻片長(zhǎng)度。采用新醫(yī)用脫脂棉擦高品質(zhì)載玻片，觀察的效果更加清晰，不會(huì)受到載玻片上雜物的影響，并且清洗載玻片速度快，節(jié)省時(shí)間。

(9)脫蠟、透明：烘片結(jié)束后，在二甲苯溶液中脫蠟、透明各一次，每次浸泡28～35min，此流程在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，其中在操作過(guò)程中，脫蠟缸與透明缸隨手蓋蓋子。

(10)封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴2～3滴封片劑，封片后放置在溫度為36℃烘箱中烘烤10～15d，待樹(shù)膠烤干后，進(jìn)行觀察；其中封片劑是按體積比5：1將中性樹(shù)膠與二甲苯混合構(gòu)成。本發(fā)明采用的封片劑，封片過(guò)程中中性樹(shù)膠稀稠度適宜，易操作，而且在封片烘干后不會(huì)因?yàn)槎妆降拇罅繐]發(fā)導(dǎo)致油棕雌蕊組織結(jié)構(gòu)萎縮，影響觀片效果，脫蠟后立即滴加該封片劑能夠獲得較好的觀測(cè)視野和清晰的顯微結(jié)構(gòu)。

(11)觀片：將完成的切片在顯微鏡上觀測(cè)，獲得所需圖像。

本發(fā)明一種有效觀察油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的石蠟切片方法，采用石蠟切片技術(shù)可有效獲得油棕雌蕊結(jié)構(gòu)完整的石蠟切片，切片平整、無(wú)皺褶、厚度均勻，顯微結(jié)果清晰，具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、易操作、結(jié)果清晰、可長(zhǎng)期保存、不受取樣時(shí)間限制、并可一次固定多份樣品等優(yōu)點(diǎn)，有利于開(kāi)展油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的觀察和研究，在培育適合我國(guó)栽培的品種或篩選優(yōu)良種質(zhì)資源類型的工作中具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1是不同厚度的石蠟切片結(jié)果比較。

圖2是不同條件下顯微圖像結(jié)果比較。A、脫蠟后立即滴加中性樹(shù)膠(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)并用蓋玻片封片；B、脫蠟后延遲滴加中性樹(shù)膠(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)，并用蓋玻片封片；C、脫蠟后立即滴加中性樹(shù)膠(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)并用蓋玻片封片；D、脫蠟后延遲滴加中性樹(shù)膠(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)，并用蓋玻片封片。

圖3是油棕雌蕊的冷凍切片與本發(fā)明石蠟切片效果比較。A、厚度為14μm的冷凍切片的顯微圖像；B、本發(fā)明厚度為14μm的石蠟切片的顯微圖像。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

1、取樣固定：首先摘取所要觀察油棕的整個(gè)雌花序，帶回實(shí)驗(yàn)室立刻進(jìn)行選擇分割，選擇新鮮、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來(lái)，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開(kāi)，立刻放入盛有卡諾固定液(純乙醇：乙酸＝3:1)的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數(shù)目6個(gè)，材料與固定液的質(zhì)量體積比為1：17(g/ml)，之后用牙簽扎有10個(gè)洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型號(hào)DP-01)中，抽氣1.2個(gè)小時(shí)。后面所述步驟中的材料與浸泡液的質(zhì)量體積比范圍均為1：17(g/ml)。

2、保存整染：真空抽氣后的樣品依次經(jīng)濃度95％乙醇，85％乙醇各浸泡20min，之后轉(zhuǎn)入濃度70％乙醇中浸泡3d，保存溫度為17℃。

3、整染：將保存后的樣品從濃度70％乙醇中轉(zhuǎn)入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5h，轉(zhuǎn)入愛(ài)氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將牙簽扎有10個(gè)洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽氣1個(gè)小時(shí)后，繼續(xù)放置在真空干燥器中，時(shí)間為23h，之后從干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續(xù)放置50h。

4、水洗、返藍(lán)：樣品經(jīng)愛(ài)氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗4次，中間每次浸泡1h，最后一次浸泡14h，之后用自來(lái)水返藍(lán)，換水5次，每次2min，最后蒸餾水過(guò)一遍，浸泡6h。

5、脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡6h后，經(jīng)過(guò)脫水劑逐級(jí)脫水后，再經(jīng)氯仿逐級(jí)透明后，先加入純氯仿40％體積的碎蠟?zāi)?，?6℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟?zāi)≡诼确轮?，?6℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液、無(wú)水乙醇；上述各種濃度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液中，無(wú)水乙醇與乙二醇的體積比為4：1。

具體為：依次經(jīng)七種脫水劑脫水時(shí)間依次為14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次無(wú)水乙醇浸泡3h后，吸出20％無(wú)水乙醇后，加入相同體積的純氯仿，浸泡2.5h后，依次進(jìn)行3次吸出20％溶液，加入相同體積的純氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次經(jīng)100％純氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿過(guò)程全部在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。第二次浸泡氯仿后，將提前刮好的碎蠟?zāi)尤肼确轮校尤胨橄災(zāi)c氯仿的體積比在40％，至于36℃溫箱中保溫1h后，再次加入提前刮好的碎蠟?zāi)?，以有少量碎蠟?zāi)≡诼确轮袨楹?，?6℃溫箱中保溫24h以上。

6、透蠟、包埋：先將放置好自制活動(dòng)鋁盒(長(zhǎng)×寬×高為7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提籃浸泡在50％石蠟杯中，之后將樣品等共同轉(zhuǎn)入活動(dòng)鋁盒內(nèi)，并將頂部用鉛筆標(biāo)寫(xiě)名稱序號(hào)白色A4紙條(長(zhǎng)×寬＝8.0cm×0.7cm)豎放在鋁盒內(nèi)，并將放有樣品的50％石蠟杯在42℃溫箱中保溫3h。隨后將放有樣品的提籃轉(zhuǎn)入到75％石蠟蠟中浸泡，并在50℃溫箱中保溫3h。之后放有樣品提籃分別經(jīng)純蠟A杯、純蠟B杯、純蠟C杯浸泡，都在58℃溫箱中保溫50min。選用光滑、有一定硬度的白紙，紙的大小為(10.5cm×12cm)，折疊好后，用紅色特種鉛筆在紙盒底部或者側(cè)面寫(xiě)上材料編號(hào)。先將電磁爐調(diào)節(jié)到100℃，溶解提前熬制和過(guò)濾好的石蠟3-5min；再將電磁爐調(diào)節(jié)到70℃，將石蠟完全溶解后，用電磁爐上的余熱保溫。將自來(lái)水浸濕吸水紙放置在大小為(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折疊好的紙盒，用蠟勺盛蠟于紙盒中后平放，再將純蠟C杯中的鋁盒取出放入紙盒中，將鋁盒拆開(kāi)，將材料落入盒中，將4-6個(gè)樣品平均分布到紙盒中(樣品與石蠟的體積比為1：60)，樣品橫臥。靜置到蠟塊表面結(jié)膜后可連同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此類推。

7、修蠟塊、切片：首先在桌上墊一張A4紙，紙上放一塊小木板，之后將包埋好的蠟塊的紙剝掉，正面放在小木板上，先用單面刀片在所要切取的材料四周蠟塊上劃數(shù)條直線，四周相接與直線之間也劃線，之后輕輕的加深刀口，然后用兩手的大拇指和食指夾住蠟塊輕輕用力折斷。用單面刀將分割的蠟塊修成小塊。將修好的蠟塊按組裝入自封袋中，自封袋上寫(xiě)好編號(hào)。將所要切片的材料的蠟塊牢固粘在底板上，當(dāng)?shù)装迳系南瀴K冷卻后，再進(jìn)一步修整成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，并將切面表面的石蠟仔細(xì)削去，只剩下薄薄一層覆蓋在材料上。將已固著和修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，油棕雌蕊的高與刀的方向平行，并固定好。將切片刀裝在切片機(jī)(型號(hào)LEICA RM 2235)的刀架上，調(diào)節(jié)切片刀的角度為15°左右，并固定好。調(diào)節(jié)切片的厚度：轉(zhuǎn)動(dòng)厚度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至所需的切片厚度，一般在11μm。打開(kāi)停刀扎，進(jìn)行切片，將切好，連成帶的片子放在白色A4紙上，用剪剖刀切斷蠟帶，蠟帶的長(zhǎng)度小于封片時(shí)蓋玻片長(zhǎng)度。在粘片前，將電熱展片臺(tái)溫度調(diào)至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用鉛筆在載玻片左側(cè)磨砂處標(biāo)好編號(hào)和粘片順序號(hào)碼，然后用新醫(yī)用脫脂棉將載玻片擦干凈，肉眼觀察無(wú)雜物。選擇所需的蠟帶進(jìn)行粘片，粘貼劑(蛋清甘油配制)，將蘸有蛋清甘油的細(xì)竹簽的一小滴涂2張載玻片，用洗干凈的小手指涂抹均勻，之后在載玻片上滴3-4滴純水，將提前切割好的蠟帶用小鑷子轉(zhuǎn)移載玻片上的蒸餾水中，然后平移到提前預(yù)熱好的電熱展片臺(tái)上(金華益迪/YD-AB)，用鑷子輕輕促動(dòng)蠟帶邊緣，使材料擺放整齊和蠟帶展開(kāi)，放置2.5小時(shí)以上。之后平移到鋪有白色A4紙的托盤(pán)上，放置在鼓風(fēng)干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脫蠟、透明：取10片玻璃脫蠟缸4個(gè)，在缸的外壁的一側(cè)貼上脫蠟、透明字樣的標(biāo)簽，用玻璃膠布覆蓋，之后放在通風(fēng)廚里面，在蠟缸里面加入脫蠟劑二甲苯，二甲苯的量與齒槽高度平齊。將待脫蠟的載玻片放在脫蠟缸里面，有材料的一面朝向標(biāo)簽和人，每個(gè)卡槽放至一張載玻片，注意勿粘貼住，之后蓋上蓋子，放置30min后轉(zhuǎn)入透明缸中。

10、封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴2滴封片劑(封片劑是按體積比5：1將中性樹(shù)膠與二甲苯混合構(gòu)成)；之后將蓋玻片從右側(cè)蓋住，平放在鋪有白色A4紙的托盤(pán)上。裝滿一盤(pán)后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待樹(shù)膠烤干后，進(jìn)行觀察。

11、觀片：將完成的切片至于顯微鏡(型號(hào)：Leica DM 2500)上觀察油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)，拍照獲取所需圖像。

實(shí)施例二

1、取樣固定：首先摘取所要觀察油棕的整個(gè)雌花序，帶回實(shí)驗(yàn)室立刻進(jìn)行選擇分割，選擇新鮮、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來(lái)，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開(kāi)，立刻放入盛有卡諾固定液(純乙醇：乙酸＝3:1)的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數(shù)目6個(gè)，材料與固定液的質(zhì)量體積比為1：20(g/ml)，之后用牙簽扎有12個(gè)洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型號(hào)DP-01)中，抽氣1.2個(gè)小時(shí)。后面所述步驟中的材料與浸泡液的質(zhì)量體積比范圍均為1：20(g/ml)。

2、保存整染：真空抽氣后的樣品依次經(jīng)濃度95％乙醇，85％乙醇各25min，之后轉(zhuǎn)入濃度70％乙醇中浸泡2d，保存溫度為18℃。

3、整染：將保存后的樣品從濃度70％乙醇中轉(zhuǎn)入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡6h，轉(zhuǎn)入愛(ài)氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將牙簽扎有12個(gè)洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽氣1個(gè)小時(shí)后，繼續(xù)放置在真空干燥器中，時(shí)間為20h，之后從干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續(xù)放置52h。

4、水洗、返藍(lán)：樣品經(jīng)愛(ài)氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗4次，中間每次浸泡2h，最后一次浸泡13h，之后用自來(lái)水返藍(lán)，換水5次，每次2min，最后蒸餾水過(guò)一遍，浸泡6h。

5、脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡5h后，經(jīng)過(guò)脫水劑逐級(jí)脫水后，再經(jīng)氯仿逐級(jí)透明后，先加入純氯仿50％體積的碎蠟?zāi)?，?6℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟?zāi)≡诼确轮校?6℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液、無(wú)水乙醇；上述各種濃度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無(wú)水乙醇-乙二醇混合溶液中，無(wú)水乙醇與乙二醇的體積比為4：1。

具體為：依次經(jīng)七種脫水劑脫水時(shí)間依次為14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次無(wú)水乙醇浸泡3h后，吸出20％無(wú)水乙醇后，加入相同體積的純氯仿，浸泡2.5h后，依次進(jìn)行3次吸出20％溶液，加入相同體積的純氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次經(jīng)100％純氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿過(guò)程全部在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。第二次浸泡氯仿后，將提前刮好的碎蠟?zāi)尤肼确轮?，加入碎蠟?zāi)c氯仿的體積比在50％，至于36℃溫箱中保溫1h后，再次加入提前刮好的碎蠟?zāi)?，以有少量碎蠟?zāi)≡诼确轮袨楹?，?6℃溫箱中保溫24h以上。

6、透蠟、包埋：先將放置好自制活動(dòng)鋁盒(長(zhǎng)×寬×高為7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提籃浸泡在50％石蠟杯中，之后將樣品等共同轉(zhuǎn)入活動(dòng)鋁盒內(nèi)，并將頂部用鉛筆標(biāo)寫(xiě)名稱序號(hào)白色A4紙條(長(zhǎng)×寬＝8.0cm×0.7cm)豎放在鋁盒內(nèi)，并將放有樣品的50％石蠟杯在42℃溫箱中保溫3h。隨后將放有樣品的提籃轉(zhuǎn)入到75％石蠟蠟中浸泡，并在50℃溫箱中保溫3h。之后放有樣品提籃分別經(jīng)純蠟A杯、純蠟B杯、純蠟C杯浸泡，都在58℃溫箱中保溫50min。選用光滑、有一定硬度的白紙，紙的大小為(10.5cm×12cm)，折疊好后，用紅色特種鉛筆在紙盒底部或者側(cè)面寫(xiě)上材料編號(hào)。先將電磁爐調(diào)節(jié)到100℃，溶解提前熬制和過(guò)濾好的石蠟3-5min；再將電磁爐調(diào)節(jié)到70℃，將石蠟完全溶解后，用電磁爐上的余熱保溫。將自來(lái)水浸濕吸水紙放置在大小為(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折疊好的紙盒，用蠟勺盛蠟于紙盒中后平放，再將純蠟C杯中的鋁盒取出放入紙盒中，將鋁盒拆開(kāi)，將材料落入盒中，將4-6個(gè)樣品平均分布到紙盒中(樣品與石蠟的體積比為1：80)，樣品橫臥。靜置到蠟塊表面結(jié)膜后可連同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此類推。

7、修蠟塊、切片：首先在桌上墊一張A4紙，紙上放一塊小木板，之后將包埋好的蠟塊的紙剝掉，正面放在小木板上，先用單面刀片在所要切取的材料四周蠟塊上劃數(shù)條直線，四周相接與直線之間也劃線，之后輕輕的加深刀口，然后用兩手的大拇指和食指夾住蠟塊輕輕用力折斷。用單面刀將分割的蠟塊修成小塊。將修好的蠟塊按組裝入自封袋中，自封袋上寫(xiě)好編號(hào)。將所要切片的材料的蠟塊牢固粘在底板上，當(dāng)?shù)装迳系南瀴K冷卻后，再進(jìn)一步修整成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，并將切面表面的石蠟仔細(xì)削去，只剩下薄薄一層覆蓋在材料上。將已固著和修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，油棕雌蕊的高與刀的方向平行，并固定好。將切片刀裝在切片機(jī)(型號(hào)LEICA RM 2235)的刀架上，調(diào)節(jié)切片刀的角度為15°左右，并固定好。調(diào)節(jié)切片的厚度：轉(zhuǎn)動(dòng)厚度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至所需的切片厚度，一般在14μm。打開(kāi)停刀扎，進(jìn)行切片，將切好，連成帶的片子放在白色A4紙上，用剪剖刀切斷蠟帶，蠟帶的長(zhǎng)度小于封片時(shí)蓋玻片長(zhǎng)度。在粘片前，將電熱展片臺(tái)溫度調(diào)至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用鉛筆在載玻片左側(cè)磨砂處標(biāo)好編號(hào)和粘片順序號(hào)碼，然后用新醫(yī)用脫脂棉將載玻片擦干凈，肉眼觀察無(wú)雜物。選擇所需的蠟帶進(jìn)行粘片，粘貼劑(蛋清甘油配制)，將蘸有蛋清甘油的細(xì)竹簽的一小滴涂2張載玻片，用洗干凈的小手指涂抹均勻，之后在載玻片上滴3-4滴純水，將提前切割好的蠟帶用小鑷子轉(zhuǎn)移載玻片上的蒸餾水中，然后平移到提前預(yù)熱好的電熱展片臺(tái)上(金華益迪/YD-AB)，用鑷子輕輕促動(dòng)蠟帶邊緣，使材料擺放整齊和蠟帶展開(kāi)，放置2.5小時(shí)以上。之后平移到鋪有白色A4紙的托盤(pán)上，放置在鼓風(fēng)干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脫蠟、透明：取10片玻璃脫蠟缸4個(gè)，在缸的外壁的一側(cè)貼上脫蠟、透明字樣的標(biāo)簽，用玻璃膠布覆蓋，之后放在通風(fēng)廚里面，在蠟缸里面加入脫蠟劑二甲苯，二甲苯的量與齒槽高度平齊。將待脫蠟的載玻片放在脫蠟缸里面，有材料的一面朝向標(biāo)簽和人，每個(gè)卡槽放至一張載玻片，注意勿粘貼住，之后蓋上蓋子，放置30min后轉(zhuǎn)入透明缸中。

10、封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴3滴封片劑(封片劑是按體積比5：1將中性樹(shù)膠與二甲苯混合構(gòu)成)；之后將蓋玻片從右側(cè)蓋住，平放在鋪有白色A4紙的托盤(pán)上。裝滿一盤(pán)后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待樹(shù)膠烤干后，進(jìn)行觀察。

11、觀片：將完成的切片至于顯微鏡(型號(hào)：Leica DM 2500)上觀察油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)，拍照獲取所需圖像。

試驗(yàn)過(guò)程：

重復(fù)上述步驟，將實(shí)施例一所得的修整好的蠟塊分別在厚度8μm、9μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm下進(jìn)行切片，之后按照實(shí)施例一方法進(jìn)行下面的步驟，然后將完成的切片置于顯微鏡(型號(hào)：Leica DM2500)下拍照獲取所需顯微圖像，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明在相同放大倍數(shù)條件下，切片厚度小于10μm時(shí)，蠟帶薄，切片過(guò)程中蠟帶褶皺，放置在展片機(jī)上也無(wú)法展平，但獲得視野清晰，而觀察結(jié)果有重疊褶皺情況。切片厚度在11～15μm時(shí)，切片過(guò)程中，蠟帶平滑，不彎曲，材料不破碎，觀察結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)疊褶皺情況。切片厚度大于16μm時(shí)，切片過(guò)程中，蠟帶不相連，無(wú)疊褶皺情況，切片結(jié)果清晰，但厚度厚，透光性差。

將實(shí)施例一所得切片采用不同的封片劑進(jìn)行封片：1、脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)并用蓋玻片封片；2、脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)，并用蓋玻片封片；3、脫蠟立即滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1:1)并用蓋玻片封片；4、脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)，并用蓋玻片封片。所獲得的顯微圖像結(jié)果見(jiàn)圖2，脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)獲得較好的觀測(cè)視野和清晰的雌蕊解剖結(jié)構(gòu)(圖2A)；脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)易導(dǎo)致油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)萎縮，使其結(jié)構(gòu)失去真實(shí)結(jié)構(gòu)，而無(wú)法達(dá)到觀察效果(圖2B)；脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)，溫箱中烘干后，其觀察結(jié)果較延遲滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝1：1)獲得觀察結(jié)果清晰，但由于中性樹(shù)膠太少，溫箱中烘干過(guò)程中，二甲苯揮發(fā)，導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)萎縮，無(wú)法達(dá)到所需觀察效果(圖2C)；脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹(shù)膠：二甲苯＝5：1)獲得觀察效果(圖2D)中有細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，無(wú)法獲得清晰的顯微結(jié)構(gòu)圖片，其原因是由于在延遲的過(guò)程中，二甲苯揮發(fā)所致細(xì)胞結(jié)構(gòu)萎縮。其中所涉及到的延遲過(guò)程均指從透明缸中拿出載玻片后延遲30s～60s滴加封片劑。

對(duì)照：采用冷凍切片法制備油棕雌蕊厚度為14μm的切片樣品，在Leica DMIL LED倒置生物顯微鏡下觀察拍照。結(jié)果如圖3A。

由圖3B可以看出，本發(fā)明所采用的石蠟切片技術(shù)得到的油棕雌蕊切片平整、無(wú)皺褶、厚度均勻，其顯微結(jié)果結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，清晰，蘇木精對(duì)細(xì)胞核的染色效果好，與冷凍切片技術(shù)相比，具有易操作、不受取樣時(shí)間限制、結(jié)果清晰等優(yōu)點(diǎn)，有利于開(kāi)展油棕雌蕊解剖結(jié)構(gòu)的觀察和研究，在培育適合我國(guó)栽培的品種或篩選優(yōu)良種質(zhì)資源類型的工作中具有重要的意義。

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。