本發(fā)明涉及顯微鏡載物片的制備領(lǐng)域，具體涉及一種精子電鏡標本的制片方法。

背景技術(shù)：

由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，必須把標本切成厚度小于0.1μm以下的薄片才適用，這樣的薄片稱為超薄切片，常用的超薄切片厚度是50-70nm。而超薄切片技術(shù)是制備超薄切片最常用、最基本的制備技術(shù)。其制作過程基本需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片和染色等步驟。

實驗室實驗時，為了降低不可控因素的干擾，通常是針對性的對觀察目標進行處理，避免夾雜其它干擾因素。例如，在雄性生殖能力的實驗研究中，經(jīng)常需要制作精子的電鏡標本，也需要使用超薄切片技術(shù)，目前常規(guī)的制作方法是將精子從附睪中取出，然后用PBS液沖洗，離心，棄掉上清液，然后將離心后的精子用戊二醛固定，最后于電鏡室制作標本，用于超微機構(gòu)的觀察。但是該法存在較大缺陷，因為實驗將觀察目標精子直接從附睪中取出，精子暴露在外，且電鏡標本制作過程中需要多種液體對固定好的樣本進行沖洗，這必然導致精子樣本被沖散，則會使得精子樣本量不足夠多，最后將不能成功制作電鏡標本，這樣的情況出現(xiàn)時，需要重新制片，加大了工作量，還導致制片過程中使用到的原料的浪費。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種精子電鏡標本的制片方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)制備精子標本過程中，精子暴露在外容易被試劑沖散，導致制片失敗的技術(shù)問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下基礎(chǔ)技術(shù)方案：一種精子電鏡標本的制片方法，包括以下步驟：

a、從經(jīng)過滅菌處理的實驗鼠中分離附睪，并將附睪從實驗鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡；

b、將步驟c處理后的附睪尾置于3～5℃的環(huán)境下放置20～26h后，制作電鏡標本即可。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明突破現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)操作方法，直接采用附睪組織來觀察精子，這樣一來省去了使用離心將精子從附睪中取出的步驟，最終制備的標本是附睪尾和精子的結(jié)合，精子不直接暴露在附睪外，附睪尾對精子的移動進行限制，在使用PBS液清洗時，PBS液更多的是接觸到附睪，最終經(jīng)過戊二醛浸泡固定，這樣避免精子直接接觸到制片過程中使用的試劑，進而大大降低了精子被試劑沖散的可能，提高了制片的成功率，避免制片過程中使用到的各種原料的浪費，還提高了工作效率。本方案和現(xiàn)有技術(shù)相比，還無需將精子從附睪中取出，進而也就不需要離心操作，減少了工作環(huán)節(jié)，操作簡單易行。

進一步，作為對基礎(chǔ)方案的優(yōu)化方案一：步驟a中附睪尾在戊二醛中浸泡的時間為1～2h。使用戊二醛浸泡附睪尾的目的是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們原來所在的位置上，有助于電鏡觀察。而為了達到更好的固定效果，本方案通過實踐證明將附睪尾浸泡1～2h的固定效果最佳，基本無細胞離散和失活的現(xiàn)象發(fā)生。

進一步，作為對基礎(chǔ)方案和優(yōu)化方案一的優(yōu)化：步驟b中將保留下的附睪尾修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為戊二醛的滲透能力較弱，如果修整后的附睪尾太大，則附睪尾的內(nèi)部將不能得到良好的浸泡固定。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件和步驟的實驗方法，按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法和條件操作。

實施例1：

一種精子電鏡標本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過實驗手段使實驗鼠窒息，將實驗鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實驗鼠的腹部剪開一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實驗鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡2h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于5℃的環(huán)境下放置26h后，修成1mm×1mm×2mm大小長條形電鏡標本即可進行電鏡觀察。

實施例2：

一種精子電鏡標本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過實驗手段使實驗鼠窒息，將實驗鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實驗鼠的腹部剪開一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實驗鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡1.5h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于4℃的環(huán)境下放置24h后，修成1mm×1mm×2mm大小長條形電鏡標本即可進行電鏡觀察。

實施例3：

一種精子電鏡標本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過實驗手段使實驗鼠窒息，將實驗鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實驗鼠的腹部剪開一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實驗鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡1h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于3℃的環(huán)境下放置20h后，修成1mm×1mm×2mm大小長條形電鏡標本即可進行電鏡觀察。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。