本發(fā)明涉及一種測定方法，尤其涉及一種活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)棕櫚?；实淖兓实臏y定方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代生命科學(xué)研究的熱點和前沿領(lǐng)域，是在整體水平上研究生物體蛋白質(zhì)組成、變化規(guī)律及蛋白質(zhì)相互作用的科學(xué)。其主要研究內(nèi)容包括分離和分析細(xì)胞或組織中的全部蛋白質(zhì)，探索其表達(dá)與細(xì)胞功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)具有診斷價值的疾病標(biāo)志物和可作為藥物靶標(biāo)的功能蛋白質(zhì)，并為全面揭示重大疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和生物體復(fù)雜生理生化功能的分子基礎(chǔ)提供全新的思路和策略。蛋白質(zhì)組是高度動態(tài)的，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動態(tài)變化對各種生命過程有著重要影響。定量分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化，對于研究蛋白質(zhì)功能、揭示細(xì)胞生物機(jī)理、尋找疾病蛋白標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)具有重要的指導(dǎo)意義。因此，以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分析技術(shù)也從蛋白質(zhì)組的鑒定發(fā)展到定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

蛋白質(zhì)是執(zhí)行生命體功能的基本分子。蛋白質(zhì)在具有生物活性功能之前要經(jīng)過磷酸化、糖基化、泛素化和脂質(zhì)化等一系列復(fù)雜的修飾過程。應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以批量觀察正常與疾病細(xì)胞(組織)在蛋白質(zhì)表達(dá)譜上的差異，從整體水平上規(guī)?；睾Y選和發(fā)掘潛在的藥物靶標(biāo)，以及適用于早期診斷、介入和治療的疾病蛋白標(biāo)志物。但是蛋白質(zhì)的功能僅僅從量的變化上分析往往會限制我們的研究視野，許多至關(guān)重要的生命進(jìn)程不僅由蛋白質(zhì)的相對豐度控制，更為重要的是被那些時空特異分布的可逆翻譯后修飾所控制，有時蛋白質(zhì)水平上雖無明顯差異、其翻譯后修飾水平卻已發(fā)生顯著變化，揭示翻譯后修飾發(fā)生規(guī)律是理解蛋白質(zhì)功能復(fù)雜多樣性的一個重要前提。因此，以翻譯后修飾蛋白質(zhì)組為研究對象的定性和定量分析已成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要組成部分。

蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾是生物體中廣泛存在的一類重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式。其化學(xué)本質(zhì)是長鏈脂肪酸(常見于飽和十六碳棕櫚酸)與半胱氨酸殘基(Cys)的共價結(jié)合，形成不穩(wěn)定的硫酯鍵。長鏈脂肪酸的引入，增加了蛋白質(zhì)的疏水性和親脂性，協(xié)助蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的結(jié)合，從而影響細(xì)胞內(nèi)各種信號傳導(dǎo)及受體蛋白在細(xì)胞膜和胞內(nèi)各細(xì)胞器上的準(zhǔn)確定位和聚集從而精確表達(dá)其功能。與磷酸化類似，棕櫚?；强赡娴?。在蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶和棕櫚酰蛋白硫酯酶的調(diào)節(jié)下，蛋白質(zhì)處于棕櫚?；腿プ貦磅；膭討B(tài)平衡中，以此調(diào)控被修飾蛋白質(zhì)在各亞細(xì)胞單位間的轉(zhuǎn)運和功能活性的實現(xiàn)。近年來，隨著以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)和分離技術(shù)的飛速發(fā)展，一系列棕櫚?；鞍踪|(zhì)相繼被鑒定出，使得蛋白質(zhì)棕櫚?；揎棾蔀檠芯康鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的新熱點。相對于磷酸化和糖基化修飾，蛋白質(zhì)的棕櫚酰化修飾的研究廣度與深度均有待進(jìn)一步拓展。

關(guān)于棕櫚?；?去棕櫚?；^程對神經(jīng)元蛋白功能調(diào)控作用的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椝降淖兓c多種神經(jīng)退行性病變及與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)，如老年癡呆癥、亨丁頓氏舞蹈癥、精神分裂癥等。因此，定量分析生物體內(nèi)棕櫚?；鞍踪|(zhì)的動態(tài)變化，有助于闡明棕櫚?；閷?dǎo)的生理病理機(jī)制、尋找高特異性和靈敏性的生物標(biāo)志物，是當(dāng)前棕櫚?；鞍踪|(zhì)組學(xué)研究的熱點課題之一。

早期研究蛋白質(zhì)棕櫚?；姆椒?，通過監(jiān)控細(xì)胞或生物體內(nèi)代謝標(biāo)記的³[H]標(biāo)記棕櫚酸脂，脈沖追蹤分析檢測棕櫚?；省Ｓ捎谛盘柮舾卸鹊?，常常影響低豐度蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀臋z測效率，不能進(jìn)行定量分析。親和富集、多維分離等技術(shù)與生物質(zhì)譜的結(jié)合為棕櫚?；鞍踪|(zhì)組學(xué)的發(fā)展提供了契機(jī)。Davis小組2007年報道的?；?生物素交換(acyl-biotinyl exchange，ABE)方法正式開啟了棕櫚?；鞍踪|(zhì)組學(xué)分析的大門，是近年來廣泛應(yīng)用的方法之一。該法先以N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)將棕櫚?；鞍踪|(zhì)上已存在的游離巰基封閉，在用羥胺將結(jié)合在巰基上的內(nèi)源性棕櫚?；忉尫藕?，用含有生物素親和標(biāo)簽的功能試劑(biotin-HPDP)標(biāo)記新暴露出的巰基，最后通過生物素親和富集技術(shù)將棕櫚酰化蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)提取物中分離出來，進(jìn)行質(zhì)譜分析。該方法適用于無細(xì)胞體系蛋白抽提物棕櫚?；揎椀脑粰z測，與蛋白的棕櫚?；揎棿x率無關(guān)。缺點是羥胺對于跨膜蛋白的硫酯鍵裂解效率較差，致使對膜蛋白棕櫚酰化修飾檢測靈敏度偏低。如標(biāo)記前蛋白質(zhì)游離巰基未全部封閉或羥胺處理后硫酯鍵未全部斷裂，將分別出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，需同時對照無羥胺處理組方可保證實驗結(jié)果的可信度。該方法雖可廣泛應(yīng)用于棕櫚酰化蛋白質(zhì)組譜的繪制，但因缺乏合適的內(nèi)標(biāo)，只能實現(xiàn)棕櫚酰化蛋白質(zhì)的半定量分析。

目前發(fā)展較為成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方法并不能直接應(yīng)用于棕櫚酰化蛋白質(zhì)組的定量分析。前者是基于氨基酸殘基的選擇和對一個或少數(shù)幾個有代表性的肽段的定量分析，這會直接導(dǎo)致氨基酸序列覆蓋度的降低，不能有效區(qū)分棕櫚?；鞍缀臀醋貦磅；鞍?，從而阻礙樣品中棕櫚?；鞍踪|(zhì)的鑒定和定量分析。與磷酸化蛋白質(zhì)相似，棕櫚?；鞍踪|(zhì)在生物樣本中的含量及棕櫚?；稽c的化學(xué)計量值很低，對其進(jìn)行規(guī)?；垦芯繕O具挑戰(zhàn)性。

目前已報道的棕櫚?；鞍踪|(zhì)組的定量方法只是生物樣本間的相對定量分析，屬于比較蛋白質(zhì)組學(xué)的范疇。就棕櫚?；鞍踪|(zhì)組學(xué)而言，棕櫚酰化修飾發(fā)生于蛋白質(zhì)合成之后，通過相對定量分析方法獲得的不同狀態(tài)下生物體棕櫚?；鞍踪|(zhì)水平的相對變化，是否真正反映出生物體蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椷^程的改變呢？之所以產(chǎn)生這樣的疑問，是因為蛋白質(zhì)組是高度動態(tài)的，在不同生理或病理環(huán)境中，即使同一細(xì)胞中的同一種蛋白質(zhì)的合成表達(dá)也是不盡相同的。換言之，某些情況下，狀態(tài)的改變，不僅僅影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾的過程，也影響了蛋白質(zhì)被修飾之前自身的合成表達(dá)。因此，我們最終所檢測到的不同狀態(tài)下生物體棕櫚?；鞍踪|(zhì)水平的相對變化，并非由單純意義上的蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾過程的改變所引起，而是來自于被修飾蛋白質(zhì)自身的合成表達(dá)過程和其后棕櫚?；揎椷^程的疊加。因此，對蛋白質(zhì)棕櫚?；?即棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)的量/總目標(biāo)蛋白質(zhì)的量)的精確定量或?qū)ψ貦磅；鞍踪|(zhì)的絕對定量分析，更能準(zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀倪^程，更有利于直觀地判斷與蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椣嚓P(guān)的疾病的發(fā)生和發(fā)展，對于臨床疾病的診斷和治療具有明顯的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種不同狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)棕櫚?；实淖兓实臏y定方法，該方法通過對目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚?；?即棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)的量/總目標(biāo)蛋白質(zhì)的量)的精確測定，能更準(zhǔn)確地描述目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀倪^程。

本發(fā)明的活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)棕櫚酰化率的變化率的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)用輕型同位素試劑標(biāo)記第一狀態(tài)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，再用棕櫚酸類試劑標(biāo)記所述第一狀態(tài)活細(xì)胞內(nèi)棕櫚酰化蛋白質(zhì)，得到第一標(biāo)記活細(xì)胞；用重型同位素試劑標(biāo)記第二狀態(tài)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，再用棕櫚酸類試劑標(biāo)記所述第二狀態(tài)活細(xì)胞內(nèi)棕櫚?；鞍踪|(zhì)，得到第二標(biāo)記活細(xì)胞。

(2)將步驟(1)中第一、第二標(biāo)記活細(xì)胞裂解并混合，對活細(xì)胞內(nèi)總目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和定量分析，得到式(1)的比值R1；將棕櫚酰化蛋白質(zhì)和未棕櫚?；鞍踪|(zhì)分離，并對棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定和定量分析，得到式(2)的比值R2。

(3)由式(3)得到第一、第二狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚?；实淖兓蔙2/R1。

計算公式如下：

Ht/Lt＝R1 (1)

Hp/Lp＝R2 (2)

(Hp/Ht)/(Lp/Lt)＝R2/R1 (3)

其中，Hp、Lp分別代表重型同位素試劑和輕型同位素試劑標(biāo)記的活細(xì)胞內(nèi)棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)度；Ht、Lt分別代表重型同位素試劑和輕型同位素試劑標(biāo)記的活細(xì)胞內(nèi)總目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)度；R1代表第二狀態(tài)和第一狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)總目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)度之比；R2代表第二狀態(tài)和第一狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)度之比；R2/R1代表第二狀態(tài)和第一狀態(tài)下的活細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚?；实淖兓?。

進(jìn)一步的，所述同位素試劑為穩(wěn)定同位素試劑，其中重型穩(wěn)定同位素的元素為²H、¹⁸O、¹³C、¹⁵N等。

進(jìn)一步的，所述穩(wěn)定同位素試劑為含有穩(wěn)定同位素的氨基酸，如含重型穩(wěn)定同位素¹³C、¹⁵N的賴氨酸(K8)、精氨酸(R10)。

進(jìn)一步的，所述棕櫚酸類試劑為17-十八炔酸。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述第一、第二標(biāo)記活細(xì)胞裂解并等比例混合。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，在進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和定量分析前將蛋白質(zhì)進(jìn)行消化處理。

進(jìn)一步的，將所述蛋白質(zhì)進(jìn)行胰酶消化處理。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，通過基于點擊反應(yīng)的親和富集將棕櫚?；鞍踪|(zhì)和未棕櫚酰化蛋白質(zhì)分離。

進(jìn)一步的，所述親和富集試劑為生物素標(biāo)記的疊氮化合物(Biotin-N₃)和鍵合抗生物素蛋白的磁珠(Avidin-Fe₂O₃)。

進(jìn)一步的，所述質(zhì)譜鑒定和定量分析為通過對輕型同位素和重型同位素分別標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)中相同氨基酸序列的肽段豐度進(jìn)行比較。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明將細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)和點擊化學(xué)相結(jié)合，借助高分辨質(zhì)譜儀，可實現(xiàn)活細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚酰化率(即棕櫚?；繕?biāo)蛋白的量/總目標(biāo)蛋白質(zhì)的量)的精確測定，得到棕櫚?；实淖兓剩芨鼫?zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀倪^程，更直觀地判斷與蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椣嚓P(guān)的疾病的發(fā)生和發(fā)展，對于臨床疾病的診斷和治療具有明顯的現(xiàn)實意義。相對于目前已報道的僅僅針對不同狀態(tài)下生物體棕櫚?；鞍踪|(zhì)水平相對變化的測定，本發(fā)明既考慮了被修飾蛋白質(zhì)自身合成表達(dá)量的變化，也考慮了合成后棕櫚?；揎椷^程的改變。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實施例中基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)的活細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的棕櫚?；实臏y試流程圖；

圖2圖示了本發(fā)明的實施例中Western Blot檢測CHO細(xì)胞株中FA2H的表達(dá)；

圖3是本發(fā)明的實施例中17-ODYA代謝標(biāo)記CHO細(xì)胞裂解蛋白的凝膠熒光成像圖；

圖4圖示了本發(fā)明的實施例中Western Blot檢測不同濃度17-ODYA代謝標(biāo)記的CHO細(xì)胞中的棕櫚?；鞍踪|(zhì)的富集；

圖5圖示了本發(fā)明的實施例中Western Blot檢測17-ODYA代謝標(biāo)記的CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)CHO細(xì)胞中Caveolin-1總蛋白的表達(dá)(A)和棕櫚酰化蛋白質(zhì)的表達(dá)(B)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和脂肪酸2-羥基化酶(FA2H)過表達(dá)的CHO細(xì)胞中蛋白質(zhì)棕櫚?；实淖兓实臏y定，測試流程圖如圖1所示，具體步驟如下：

(1)構(gòu)建FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞模型

在哺乳動物細(xì)胞中，脂肪酸2-羥基化酶(FA2H)可催化直鏈脂肪酸生成2-羥基脂肪酸，這一過程被認(rèn)為是直鏈脂肪酸氧化的起始步驟。同時，其催化產(chǎn)物2-羥基脂肪酸因多耦合于鞘磷脂，在調(diào)控細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的生理學(xué)意義。因此，我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將FA2H真核表達(dá)載體穩(wěn)定表達(dá)于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，并以此作為細(xì)胞模型來考察和驗證本技術(shù)的有效性和可行性。Western blot實驗證明FA2H穩(wěn)定表達(dá)于CHO細(xì)胞株，如圖2所示。

(2)穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞

將CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞分別置于含有輕型穩(wěn)定同位素¹²C、¹⁴N標(biāo)記的氨基酸(賴氨酸K0和精氨酸R0，屬正常代謝的氨基酸)和重型穩(wěn)定同位素¹³C、¹⁵N標(biāo)記的氨基酸(賴氨酸K8和精氨酸R10)的F-12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至少六代。收集每一代細(xì)胞，其蛋白質(zhì)裂解液經(jīng)胰酶消化為肽段后，在ThermoVelos高分辨質(zhì)譜儀上進(jìn)行肽段分析。根據(jù)相同肽段的一級質(zhì)譜圖，比較輕型穩(wěn)定同位素和重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的相同肽段的同位素峰的信號強(qiáng)度，監(jiān)測細(xì)胞穩(wěn)定同位素的代謝標(biāo)記率。我們發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長，相比較于輕型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段，重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段的比例逐漸增加。在穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記六代后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的同位素代謝標(biāo)記率接近100％，說明細(xì)胞中的賴氨酸和精氨酸均被重型溫度同位素標(biāo)記的氨基酸置換，此時的細(xì)胞方可用于后續(xù)的實驗研究。

(3)17-十八炔酸(17-ODYA)代謝標(biāo)記CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞

將上述穩(wěn)定同位素標(biāo)記的CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞分別與含有100μM17-ODYA的培養(yǎng)基共培養(yǎng)16h后，收集細(xì)胞獲取裂解蛋白。為驗證17-ODYA的代謝標(biāo)記效率，將100μM熒光標(biāo)記的疊氮化合物(Cy7.5-N₃)與100ug上述CHO細(xì)胞裂解蛋白混合，加入200μM TBTA(Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)、2mM CuSO₄水溶液和1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)中，室溫(25-35℃)反應(yīng)1h。此時，17-ODYA代謝標(biāo)記的蛋白質(zhì)可被熒光基團(tuán)Cy7.5標(biāo)記。將反應(yīng)后的溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，借助凝膠熒光成像儀，觀察17-ODYA對細(xì)胞的代謝標(biāo)記效率，結(jié)果示于圖3。相對于陰性對照組，10μM 17-ODYA代謝標(biāo)記的細(xì)胞裂解蛋白反應(yīng)后呈現(xiàn)出明顯的熒光蛋白條帶，說明17-ODYA成功地代謝標(biāo)記了細(xì)胞內(nèi)的棕櫚?；鞍踪|(zhì)。

(4)17-ODYA代謝標(biāo)記棕櫚?；鞍踪|(zhì)的富集分離

將輕型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的CHO細(xì)胞和重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞分別與含有100μM17-ODYA的培養(yǎng)基共培養(yǎng)16h后，收集細(xì)胞獲取蛋白裂解液，BCA(聚氰基丙烯酸正丁酯)蛋白定量。將100μg輕型穩(wěn)定同位素和重型穩(wěn)定同位素分別標(biāo)記的裂解液按1:1比例混合，加入100μM生物素標(biāo)記的疊氮化合物(Biotin-N₃)、200μM TBTA、2mM CuSO₄水溶液和1mM TCEP中，室溫(25-35℃)反應(yīng)1h，可將Biotin標(biāo)簽連接至棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)上。反應(yīng)溶液經(jīng)氯仿-甲醇沉淀后，重懸于PBS/2％SDS(磷酸緩沖鹽溶液/質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2％十二烷基硫酸鈉水溶液)中。用PBS將蛋白重懸液稀釋至0.1％SDS后，加入鍵合抗生物素蛋白Avidin的磁珠，通過免疫共沉淀反應(yīng)，可將17-ODYA標(biāo)記的棕櫚?；鞍踪|(zhì)組富集于磁珠上。Western Blot實驗檢測磁珠上富集的蛋白，結(jié)果示于圖4。明顯地，17-ODYA標(biāo)記的細(xì)胞中的棕櫚?；鞍踪|(zhì)實現(xiàn)了成功富集。

5)富集后的棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)和總目標(biāo)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

將富集后的棕櫚?；鞍踪|(zhì)進(jìn)行胰酶消化酶解，經(jīng)2D-LC分離后，在Thermo Orbitrap Velos儀器上進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并用軟件Protein Discoverer 2.0處理，通過對氨基酸序列相同、不同穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段豐度的比較，可以得到重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記(實驗組，H)輕型穩(wěn)定同位素標(biāo)記(對照組，L)活細(xì)胞內(nèi)棕櫚?；繕?biāo)蛋白質(zhì)(S)和目標(biāo)總蛋白質(zhì)(T)的相對定量關(guān)系。將兩者相比較，即可實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)棕櫚酰化率的精確測量，計算方法參考原理圖附圖1中的計算公式(1)、(2)和(3)。結(jié)果顯示，相對于對照組，CHO細(xì)胞中FA2H過表達(dá)誘導(dǎo)25個蛋白的棕櫚?；曙@著上調(diào)，10個蛋白棕櫚酰化率顯著下調(diào)，其中Caveolin-1(窖蛋白)總蛋白質(zhì)的表達(dá)雖未受到FA2H過表達(dá)的影響，但棕櫚酰化修飾的Caveolin-1的含量受FA2H的調(diào)控下降了50％。

(6)生物實驗驗證

將CHO細(xì)胞和FA2H過表達(dá)的CHO細(xì)胞用17-ODYA代謝標(biāo)記，獲取其裂解蛋白。經(jīng)“click”反應(yīng)(點擊反應(yīng))和免疫共沉淀的方法，富集蛋白裂解液中的棕櫚?；鞍踪|(zhì)組。Western blot實驗檢測Caveolin-1蛋白的表達(dá)和棕櫚?；疌aveolin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，F(xiàn)A2H對caveolin-1總蛋白質(zhì)的表達(dá)未產(chǎn)生影響，但顯著降低了棕櫚?；疌aveolin-1的表達(dá)，如圖5所示。這一結(jié)果與步驟(5)中質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)基本吻合，說明本發(fā)明中建立的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)和點擊化學(xué)相結(jié)合、借助高分辨質(zhì)譜儀的蛋白棕櫚酰化率的測定方法是有效的。同時，該結(jié)果也說明FA2H對caveolin-1的棕櫚酰化過程具有抑制作用，對理解FA2H對細(xì)胞膜脂筏的調(diào)控機(jī)制具有指導(dǎo)意義。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。