亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，包括以下步驟：（1）、獲取重組蛋白Htt（1-90）：a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1-htt的構(gòu)建；c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5α-htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達(dá)；（2）、重組蛋白Htt（1-90）的純化；（3）、SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的純化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽與重組蛋白Htt（1-90）經(jīng)過(guò)偶聯(lián)獲得經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）；（6）經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt（1-158）的純化。通過(guò)對(duì)亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾，顯示出蛋白的穩(wěn)定性增加，棕櫚化蛋白有對(duì)抗水解酶的能力，顯示出棕櫚化蛋白有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，因此研究亨廷頓蛋白的棕櫚化對(duì)亨廷頓疾病的治療有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，具體涉及一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)修飾是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在真核生物中修飾類(lèi)型很多，常見(jiàn)的有棕櫚化、乙?；⒎核鼗?、磷酸化和SUMO化，蛋白質(zhì)修飾能夠改變蛋白質(zhì)的活性、定位或功能。蛋白質(zhì)的棕櫚化修飾是指16個(gè)碳的脂肪酸棕櫚酸鹽通過(guò)硫酯鍵共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)特定的半胱氨酸殘基側(cè)鏈上，這對(duì)不同膜蛋白及膜蛋白信號(hào)通路的功能調(diào)節(jié)非常重要。 [0003]亨廷頓舞蹈病(Huntington disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)變性疾病，HD基因編碼一個(gè)由3144個(gè)氨基酸組成的亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)，從Htt氨基酸末端第17位開(kāi)始有一段重復(fù)的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重復(fù)序列將產(chǎn)生兩個(gè)直接結(jié)果:一是使野生型亨廷頓蛋白(wild huntingtin, wHtt)缺失,二是產(chǎn)生突變型亨廷頓蛋白(mutant Htt,mHtt)。隨著多聚谷氨酰胺的過(guò)度延長(zhǎng),Htt蛋白會(huì)在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用下發(fā)生交聯(lián)而形成聚集體，在主鏈和側(cè)鏈酰胺基之間氫鍵連接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，稱(chēng)為多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ長(zhǎng)度小于35個(gè)，而HD患者的PolyQ長(zhǎng)度會(huì)超過(guò)37個(gè)。這些異常蛋白質(zhì)積聚成塊，損壞部分腦細(xì)胞，特別是那些與肌肉控制有關(guān)的細(xì)胞，導(dǎo)致患者神經(jīng)系統(tǒng)逐漸退化，神經(jīng)沖動(dòng)彌散，動(dòng)作失調(diào)，出現(xiàn)不可控制的顫搐，并能發(fā)展成癡呆，甚至死亡。臨床表現(xiàn)主要為舞蹈樣不自主動(dòng)作、精神障礙和進(jìn)行性癡呆。
[0004]Htt的214位半胱氨酸可由位于高爾基體的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白14(HIP14)棕櫚?；?。HIP14的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性Htt的重新分配，并且能夠在一定程度上將mHtt也分配到質(zhì)膜中，而沒(méi)有被棕櫚?；腍tt不能被重新分配，這種現(xiàn)象表明Htt重新分配到質(zhì)膜是由棕櫚?；饔脕?lái)調(diào)節(jié)的。相反，當(dāng)PolyQ中的Htt棕櫚?；稽c(diǎn)突變從而沒(méi)有棕櫚?；瘯r(shí)加劇了其細(xì)胞毒性,致使蛋白聚合和細(xì)胞死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，通過(guò)對(duì)亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾，主要是Ser和Thr的O-連接棕櫚化，顯示出蛋白的穩(wěn)定性增加，棕櫚化蛋白有對(duì)抗水解酶的能力，顯示出棕櫚化蛋白有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，因此研究亨廷頓蛋白的棕櫚化對(duì)亨廷頓疾病的治療有重要意義。
[0006]本發(fā)明的目的可通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達(dá)質(zhì)SpTWINl-Aii的構(gòu)建；c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a-htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達(dá)；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3)、SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1-90)經(jīng)過(guò)偶聯(lián)獲得經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158); (6)經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化。
[0007]作為優(yōu)選，所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:設(shè)計(jì)含有I和I限制酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，從質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法擴(kuò)增亨廷頓蛋白基因片段，將所擴(kuò)增的Aii基因片段和克隆載體pMDlS-T載體鏈接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證，所得重組質(zhì)粒命名為pMD18T-Aii ;b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWINl-htt的構(gòu)建:將原核表達(dá)載體pTWINl和重組質(zhì)粒pMD18T-Aii分別用限制性?xún)?nèi)切酶I和Pst I雙酶切，純化處理后將線(xiàn)性pTWINl質(zhì)粒片段和Aii基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證,所得重組質(zhì)粒命名為pTWINl-Α-- ;c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建:采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，得到重組菌，命名為:DH5 a -htt ;d、重組蛋白的表達(dá):將重組菌DH5 a -htt接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，吸取過(guò)夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白4~6h,離心收集菌體,在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中進(jìn)行超聲破碎，通過(guò)離心(23000 X g，30min，40°C)將細(xì)胞碎片和上清液分離。
[0008]進(jìn)一步地，所述的步驟(3)中合成Htt (Cys-K92_K158)多肽的過(guò)程分為三個(gè)片段合成:a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成Cys-K92-1108片段；d、每個(gè)片段通過(guò)自然化學(xué)連接NCL或EPL方法連接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
[0009]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中棕櫚化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即C105位點(diǎn)、C109位點(diǎn)、C137位點(diǎn)、C152位點(diǎn)中的至少一個(gè)位點(diǎn)。
[0010]進(jìn)一步地,合成Cys-K92-1108片段所用的固相載體是wang —樹(shù)脂。
[0011]進(jìn)一步地，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹(shù)脂。
[0012]經(jīng)棕櫚化修飾的亨廷頓蛋白與野生型亨廷頓蛋白比較，具有以下優(yōu)點(diǎn):通過(guò)對(duì)亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾，主要是Ser和Thr的O-連接棕櫚化，顯示出蛋白的穩(wěn)定性增加，棕櫚化蛋白有對(duì)抗水解酶的能力，顯示出棕櫚化蛋白有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，因此研究亨廷頓蛋白的棕櫚化對(duì)亨廷頓疾病的治療有重要意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為獲得Httl-90重組蛋白的流程圖；
圖2為S95位點(diǎn)棕櫚化修飾的Htt (Cys-K92-K158)多肽合成示意圖；
圖3為經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)的合成流程圖；
圖4:A為HttCys-K92-K158蛋白序列和合成片段；
B為Htt (Cys-K92-K158)多肽棕櫚化修飾位點(diǎn)；
圖5:A為棕櫚化修飾亨廷頓蛋白的反相色譜圖；B為非棕櫚化亨廷頓蛋白的反相色譜圖；
圖6:A為經(jīng)棕櫚化修飾亨廷頓蛋白水解后的反相色譜圖；
B為未經(jīng)棕櫚化修飾亨廷頓蛋白水解后的反相色譜圖；
圖7為棕櫚化修飾和非棕櫚化修飾蛋白水解后免疫印跡分析顯影圖。[0014]其中I為天然Htt蛋白；2為掠桐化修飾后Htt蛋白；3為蛋白酶水解天然Htt蛋白；4為蛋白酶水解棕櫚化修飾后Htt蛋白。
具體實(shí)施例
[0015]實(shí)施例1:獲得重組蛋白Httl-90 一)試驗(yàn)材料
(I)載體和菌株
質(zhì)粒pcDNA3.Ι/mys-His由CHDI惠贈(zèng)；表達(dá)載體pTWINl購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒pMD18_T和大腸桿菌JM109、DH5a購(gòu)自Takara生物科技有限公司。
[0016](2)弓丨物
Pl:5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3 (EcoR I)
P2:5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3 (Pst I)
由上海生工生物工程有限公司合成。
[0017]二)實(shí)施方案
1.亨廷頓蛋白基因的獲得
以質(zhì)粒pcDNA3.Ι/mys-His為模板，設(shè)計(jì)合成含有I和I限制酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，PCR擴(kuò)增Aii基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收，純化處理后與載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質(zhì)粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒用丨和Pst I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物純化處理后置4°C冰箱保存。
[0018]2.重組表達(dá)質(zhì)粒pTWINl-Α--的構(gòu)建
將原核表達(dá)載體pTWINl用限制性?xún)?nèi)切酶丨和I雙酶切，純化處理后將線(xiàn)性PTffINl質(zhì)粒片段和Ai?基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pTWINl-Α--。
[0019]3.表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建
采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，得到重組菌DH5 a -htt。
[0020]將重組菌DH5a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)。吸取過(guò)夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白4~6h,離心收集菌體。在40mmol/L的TRIS-Acetate>5mmol/L pH=8.3的溶液中進(jìn)行超聲破碎。通過(guò)離心(23000X g, 30 min,40°C)將細(xì)胞碎片和上清液分離開(kāi)來(lái)。粗多肽純度為60%。如圖1所示為獲取重組蛋白Httl-90的流程圖。
[0021 ] 實(shí)施例2:重組蛋白的純化
Httl-90-1ntein-CBD融合蛋白中CBD成分可與幾丁質(zhì)樹(shù)脂特異結(jié)合，從而便于去除雜蛋白，隨后intein成分在一定條件下催化融合蛋白在Httl-90和Intein之間發(fā)生斷裂。具體操作如下:將上清液上樣于2ml幾丁質(zhì)重力柱。柱子先經(jīng)過(guò)A液(Na-HEPES (pH8.0)20mmol/L,NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L)進(jìn)行平衡，上清液上樣后，再以A液洗脫。然后柱子在 B 液(Na-HEPES (ρΗ8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L,DTT 50mmol/L)中 40C 下浸泡 16h。C 液(Na-HEPES (pH8.0) 20mmol/L, NaCl 500mmol/L)洗脫蛋白，每 Iml收集。將每步收集到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白質(zhì)的純度是90%。
[0022]洗脫蛋白溶液中加入含有0.25mmol/L pH7.8 MESNA的溶液，室溫?fù)u床切割3次，每次24h。收集切割液加I倍體積的HEPES Buffer慢速?zèng)_洗柱子，合并二次洗脫液，最后一次切割液加壓吹干并回收樹(shù)脂。將蛋白洗脫液移至超濾管，10000r/min離心15_30min，超濾至1.5ml時(shí)移液槍轉(zhuǎn)移上層蛋白液，得到純度為99%的重組多肽2g，_4°C凍存。
[0023]實(shí)施例3 =SPPS方法獲得位于C105位點(diǎn)棕櫚化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽 本合成過(guò)程分為三個(gè)片段，首先合成Cys-S138-K158，再合成CyS-E110_L136，最后合
成 Cys-K92-1108。
[0024]固相肽的合成是在CS336X的多肽合成儀上進(jìn)行的，Cys-S138_K158多肽的合成是基于Wang樹(shù)脂。樹(shù)脂的去保護(hù)和解聚在(TFA/DCM/H20/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能夠自發(fā)進(jìn)行。然后通過(guò)10倍當(dāng)量的冷乙醚對(duì)其沉淀，這些原始多肽通過(guò)反相HPLC進(jìn)行純化，使用waters 600泵和waters 2489紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器，柱子采用GRACE-Vydac 218TP54C18柱。流動(dòng)相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測(cè)波長(zhǎng)是214nm和234nm。多肽的質(zhì)量通過(guò)MALD1-TOF-MS和ES1-MSF分析。最終得到12mg、純度為99%的Cys-S138-K158多肽，產(chǎn)率為40%。
[0025]Cys-El 10-L136多肽合成基于NBZ樹(shù)脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個(gè)NBZ衍生結(jié)構(gòu)方便進(jìn)行NCL反應(yīng)。Dbz樹(shù)脂最初的制備是通過(guò)氨基酸化的MBHA樹(shù)脂和去保護(hù)的Fmoc-與5倍當(dāng)量的D1-Fmoc-3, 4 二氨基苯甲酸偶聯(lián)得到的。多肽的延長(zhǎng)通過(guò)Fmoc保護(hù)的氨基酸，當(dāng)DIPEA濃度達(dá)到0.5mol/L時(shí)，Dbz與4-硝基苯基氯甲酸酯耦合時(shí)在分子內(nèi)形成環(huán)狀。最后通過(guò)鍵的斷裂得到的多肽，合成的多肽N端采用賽唑燒保護(hù),在methoxyamine HClpH4.0條件下噻唑烷化學(xué)鍵斷裂形成巰基。純化步驟同上。最終得到12mg、純度為99%的Cys-El 10-L136 多肽，產(chǎn)率為 45%。
[0026]Cys-K92-1108合成與El 10-L136多肽合成類(lèi)似，多肽的固態(tài)合成基于NBZ樹(shù)脂，在多肽的C端產(chǎn)生一個(gè)NBZ衍生結(jié)構(gòu)方便進(jìn)行NCL反應(yīng)。C105位的半胱氨酸羧基經(jīng)過(guò)活化，α -氨基fmoc保護(hù)，通過(guò)多肽固態(tài)合成與L106a -氨基形成肽鍵，經(jīng)過(guò)酰氯化的棕櫚酸與賴(lài)氨酸側(cè)鏈上的氨基反應(yīng)，得到棕櫚化修飾的賴(lài)氨酸，最終得到K92-1108-PalmC105多肽。最后合成的多肽在N端賽唑燒保護(hù)和C端NBZ衍生結(jié)構(gòu),在methoxyamine HCl pH4.0條件下噻唑烷化學(xué)鍵斷裂形成巰基，純化步驟同上。最終得到13mg、純度為99%的Cys-E110-L136多肽，產(chǎn)率為50%。
[0027]如圖2為對(duì)位于C105位點(diǎn)經(jīng)棕櫚化修飾的Htt(Cys-K92_K158)多肽合成示意圖。
[0028]實(shí)施例4:位于C105位點(diǎn)經(jīng)棕櫚化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽的純化
多肽的鑒定和純化通過(guò)重新注入反相色譜，此時(shí)檢測(cè)器是二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相同。流動(dòng)相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的檢測(cè)波長(zhǎng)是214nm和234nm。 最終得到3.33mg的HttCys-K92_K158蛋白，產(chǎn)率為9%。[0029]實(shí)施例5:Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白Htt (1_90)經(jīng)過(guò)偶聯(lián)獲得經(jīng)糖基化修飾目的蛋白Htt (1-158)
將重組蛋白Httl-90和Htt (Cys-K92-K158)多肽放入緩沖液中，利用巰基和硫酯的特異性反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成。其合成示意圖如圖3。
[0030]實(shí)施例6:經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化
NCL反應(yīng)后的Httl-158產(chǎn)物通過(guò)反相高效液相色譜純化，純化柱是C0SM0SIL5C4-AR-300C4.6mm*150mm 5 μ m)，線(xiàn)性梯度是10_90%，產(chǎn)物洗脫是在55%梯度下，得到產(chǎn)物
3.5mg (0.5 μ mol，33%)，通過(guò)MALDI計(jì)算產(chǎn)物的分子量。通過(guò)UPLC評(píng)定產(chǎn)物的純度，純度為99%，產(chǎn)率為4.1%。
[0031]實(shí)施例7:棕櫚化修飾和非棕櫚化修飾水解前后的色譜圖比較 樣品制備:將樣品溶解在緩沖液中，通過(guò)反相色譜柱，進(jìn)行分析。
[0032]色譜條件:通過(guò)反相-高效液相色譜(RP-HPLC)，waters2795系統(tǒng)，C18柱(4.6πιπι*250πιπι，5μπι)。流動(dòng)相A:0.1%的三氟乙酸水溶液，B是0.1%的三氟乙酸乙腈溶液。
[0033]經(jīng)過(guò)水解 酶處理后，同樣經(jīng)過(guò)上述色譜柱進(jìn)行分析。
[0034]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明:如圖5所示，棕櫚化修飾的亨廷頓蛋白大概在14min左右出峰，非棕櫚化蛋白即野生型亨廷頓蛋白大概在17min左右出峰。如圖6所示，兩種蛋白經(jīng)過(guò)水解酶處理后，棕櫚化蛋白出現(xiàn)較少的峰，而且峰值比較高，說(shuō)明水解片段較少，而非棕櫚化蛋白出現(xiàn)三個(gè)峰，峰值較低，說(shuō)明棕櫚化修飾后穩(wěn)定性和周期相對(duì)較長(zhǎng)，即說(shuō)明棕櫚化修飾后的蛋白有抗水解酶的能力。
[0035]綜上所述結(jié)果說(shuō)明，棕櫚化修飾的亨廷頓蛋白的有抗水解酶的能力，且棕櫚化修飾后穩(wěn)定性和周期相對(duì)較長(zhǎng)，即相對(duì)比較穩(wěn)定。
[0036]實(shí)施例8:水解Htt和棕櫚化的Htt免疫印跡分析
將野生型Htt蛋白和棕櫚化修飾的Htt蛋白質(zhì)樣品水解處理后，在120V，15%的Imm的聚丙烯酰胺凝膠上跑膠lh，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，室溫下，在膜上固定lh，使用3倍的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，在膜上加入亨廷頓鼠抗抗體和兔抗PalmC109，40C過(guò)夜，采用PBS緩沖液(0.1%的吐溫80)洗脫，最后在700nm紅外成像儀上成像，得到結(jié)果如圖7所示為棕櫚化修飾和非棕櫚化修飾蛋白水解后免疫印跡分析，其中I為棕櫚化修飾后Htt蛋白；2為天然Htt蛋白；3為蛋白酶水解棕櫚化修飾后Htt蛋白；4為蛋白酶水解天然Htt蛋白。經(jīng)過(guò)水解處理的參照樣品組，棕櫚化的亨廷頓蛋白水解度非常小，只有少量低分子量的條帶，而對(duì)于非棕櫚化的蛋白，蛋白水解度很大，幾乎完全水解。
【權(quán)利要求】
1.一種亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)、獲取重組蛋白Htt (1-90):a、亨廷頓蛋白基因的獲得；b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWINl-Α--的構(gòu)建；c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株DH5a -htt的構(gòu)建；d、重組蛋白的表達(dá)；(2)、重組蛋白Htt (1-90)的純化；(3),SPPS方法獲得棕櫚化修飾的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的純化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽與重組蛋白 Htt (1-90)經(jīng)過(guò)偶聯(lián)獲得經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)； (6)經(jīng)棕櫚化修飾目的蛋白Htt (1-158)的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟(1)中:a、亨廷頓蛋白基因的獲得:設(shè)計(jì)含有I和I限制酶切位點(diǎn)的上下游引物Pl和P2，從質(zhì)粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法擴(kuò)增亨廷頓蛋白基因片段，將所擴(kuò)增的htt基因片段和克隆載體pMDlS-Τ載體鏈接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證，所得重組質(zhì)粒命名為pMD18T-Aii ;b、重組表達(dá)質(zhì)粒pTWINl-htt的構(gòu)建:將原核表達(dá)載體pTWINl和重組質(zhì)粒pMD18T-Aii分別用限制性?xún)?nèi)切酶I和I雙酶切，純化處理后將線(xiàn)性pTWINl質(zhì)粒片段和Aii基因片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析驗(yàn)證，所得重組質(zhì)粒命名為pTWINl-Α-- ;c、表達(dá)亨廷頓蛋白的重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建:采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pTWINl-Α--轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，利用氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性克隆子，得到重組菌，命名為:DH5a-Aii ;d、重組蛋白的表達(dá):將重組菌DH5 a-Aii接種至LB液體培養(yǎng)基，置37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，吸取過(guò)夜培養(yǎng)菌體以5%接種量接種LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至0D600=0.5^0.7，然后置20°C搖床培養(yǎng)加入lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白4~6h,離心收集菌體,在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中進(jìn)行超聲破碎，通過(guò)離心(23000 X g，30min, 40°C )將細(xì)胞碎片和上清液分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述的步驟(3)中合成Htt (Cys-K92-K158)多肽的過(guò)程分為三個(gè)片段合成:a、首先合成Cys-S138_K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成CyS-K92_I108片段；d、每個(gè)片段通過(guò)自然化學(xué)連接NCL或EPL方法連接得到Htt (Cys-K92-K158)多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，所述步驟(3)中棕櫚化修飾位于亨廷頓外顯子2或外顯子3區(qū)域，即C105位點(diǎn)、C109位點(diǎn)、C137位點(diǎn)、C152位點(diǎn)中的至少一個(gè)位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-K92-1108片段所用的固相載體是wang —樹(shù)脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓蛋白的棕櫚化修飾方法，其特征在于，合成Cys-El 10-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相載體是N-?；?苯并咪唑酮樹(shù)脂。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103601796SQ201310555189
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】王喆明 申請(qǐng)人:杭州璞題生物科技有限公司