基于內(nèi)嗎啡肽2或Biphalin的棕櫚?；揎椀陌⑵念愃莆锛捌浜铣珊蛻?yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類阿片肽類似物的合成，尤其涉及一類基于阿片肽內(nèi)嗎啡肽2、 Biphalin通過棕櫚?；揎椂鴺?gòu)建的全新阿片肽類似物及其合成方法；本發(fā)明同時還涉 及該類阿片肽類似物在鎮(zhèn)痛藥物制備中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛是一種令人不快的感覺和情緒上的感受，伴隨有現(xiàn)存的和潛在的組織損害， 可導(dǎo)致整體生活質(zhì)量下降1986，3:S1-226)。目前，包括嗎啡、杜冷丁和芬太尼等在 內(nèi)的阿片類鎮(zhèn)痛藥物是臨床應(yīng)用最廣泛的鎮(zhèn)痛藥物。并且，經(jīng)過長期的臨床實(shí)踐和應(yīng)用，阿 片類鎮(zhèn)痛藥物已被證實(shí)在多種急性和慢性疼痛治療中均具有高效的鎮(zhèn)痛活性，已成為臨床 中、重度疼痛治療的一線藥物。阿片類鎮(zhèn)痛藥物主要是通過y-阿片受體來介導(dǎo)其鎮(zhèn)痛作 用的1997，386:499-502)。因此，針對阿片受體類的新藥研究和開發(fā)一直是鎮(zhèn)痛 藥物研發(fā)中"熱點(diǎn)"。大量的研究表明，阿片肽也能通過作用于阿片受體而介導(dǎo)高效的鎮(zhèn)痛 活性。而多肽藥物普遍具有高效、低作用劑量、低副作用的優(yōu)點(diǎn)，阿片肽在鎮(zhèn)痛新藥研發(fā)中 具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 已有的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)嗎啡肽2和Biphalin這兩種阿片肽均具有高效的鎮(zhèn)痛的作 用。內(nèi)嗎啡肽2(EM-2，Tyr-Pr〇-Phe-Phe-NH2)是1997年從哺乳動物牛腦組織中分離出來 的y-阿片受體的內(nèi)源性配體，對y-阿片受體具有很高的親和力和特異選擇性，并廣泛分 布于人中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)中。相關(guān)藥理學(xué)活性研究表明，在熱板實(shí)驗(yàn)、甩尾實(shí)驗(yàn)、福爾馬林 痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图翱雇疵裟Ｐ椭?，EM-2都能產(chǎn)生有效的中樞鎮(zhèn)痛作用。而且，低劑量的EM-2在 神經(jīng)痛模型中就能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。而Biphalin( [Tyr-(勸Ala-Gly-Phe-NH]2)是Lipkowski 等人于1982年發(fā)現(xiàn)的一種高效鎮(zhèn)痛的阿片肽，它是內(nèi)源性阿片肽腦啡肽的類似物。進(jìn)一步 藥理學(xué)活性研究表明，Biphalin可顯著地增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛活性。其在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中作用的 效價大于嗎啡，中樞和腹腔注射時都能引起極其高效的鎮(zhèn)痛作用。因此，以阿片肽內(nèi)嗎啡肽 2和Biphalin可作為化學(xué)模板，通過進(jìn)一步的化學(xué)修飾來提高其生物利用度，以用于鎮(zhèn)痛 新藥的研發(fā)。
[0004] 目前，阿片肽可通過化學(xué)的修飾來提高其受體選擇性，而獲得具有優(yōu)勢構(gòu)象的阿 片肽類似物，這些化學(xué)修飾手段主要為非天然氨基酸的引入、環(huán)化、脂化、糖基化等（ifed K. 2012，32 (3): 536-80)。脂化修飾不僅可提高多肽分子的脂溶性，還能顯著地增 強(qiáng)其穩(wěn)定性，有效防止多肽分子被體內(nèi)水解酶所降解，同時，還影響了藥物的吸收、分布、排 泄和生物利用度，所以脂化修飾是多肽藥物的化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)優(yōu)化中的有效策略之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對內(nèi)嗎啡肽2、Biphalin兩種阿片肽類在鎮(zhèn)痛劑量范圍內(nèi)伴隨 一些副作用且穩(wěn)定性差等弱點(diǎn)，提供了一種基于內(nèi)嗎啡肽2或Biphalin的棕櫚?；揎椀?阿片肽類似物，以增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛活性。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述基于內(nèi)嗎啡肽2或Biphalin的棕櫚?；揎?的阿片肽類似物的化學(xué)合成方法。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的，就是提供上述阿片肽類似物的鎮(zhèn)痛活性及在制備鎮(zhèn)痛藥物 中的應(yīng)用。
[0008] 一、棕櫚?；⑵念愃莆?本發(fā)明棕櫚酰化阿片肽類似物，是基于具有高效鎮(zhèn)痛活性的阿片肽內(nèi)嗎啡肽2或Biphalin，通過棕櫚?；揎椈瘜W(xué)構(gòu)建而成的一類全新的阿片肽類似物。其結(jié)構(gòu)式如下：
化合物簾。
[0009] (二）棕櫚酰化阿片肽類似物的合成 本發(fā)明阿片肽類似物的合成，是以高效阿片配體內(nèi)嗎啡肽2或Biphalin為化學(xué)模板， 在保留其關(guān)鍵"藥效團(tuán)"的前提下，在其C末端連接3個Lys(多個Lys是為了提高溶解性)， 再通過C末端第一個Lys側(cè)鏈氨基上化學(xué)連接一個Y-Glu，然后經(jīng)棕櫚酸?；揎椂@得。 其具體合成工藝如下： (1)樹脂的預(yù)處理：將Rink-Amide-MBHA樹脂在二氯甲烷中攪拌，使樹脂充分溶脹后減 壓抽干溶劑。
[0010] (2)脫除Fmoc保護(hù)基：在溶脹、抽干溶劑的樹脂中，加入六氫吡啶（Piperidine)、 1，8-二氮雜環(huán)^^一碳-7-烯（DBU)及DMF的混合溶液，攪拌反應(yīng):T5min后抽干，重復(fù)3次， 最后加DMF洗滌，茚檢，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂；混合溶液中，六氫吡啶、1，8-二氮 雜環(huán)i^一碳-7-烯、DMF的體積比為1:1:98。
[0011] (3)連接子Lys的縮合：將等摩爾比的N-(9-芴甲氧羰?；?N'_甲基三苯甲 基-L-賴氨酸Fmoc-Lys(Mtt) -〇H、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基 脲-六氟磷酸鹽完全溶解于DMF中混勻，再在混合溶液中加入二異丙基乙胺；混勻后加至步 驟（2)所得脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂中，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)60min，抽干溶劑；用DMF 重復(fù)洗滌、抽干，茚檢后按步驟（2)的工藝脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)，得到脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的 肽樹脂； Fm〇C-Lys(Mtt)-0H的加量為脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂摩爾量的2~4倍；二異丙基乙 胺的加入量為Fmoc-Lys(Mtt) -0H摩爾量的2倍。
[0012] (4)主鏈延長：將步驟（3)所得脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)的肽樹脂按步驟（2)、步驟（3) 的工藝，依次完成Fmoc_Lys(Boc)-〇H，F(xiàn)moc_Lys(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH或 Fmoc-Gly-〇H，F(xiàn)moc-Pro_OH或Fmoc-(勸Ala-〇H，Boc_Tyr(tBu)-OH的縮合和脫Fmoc基團(tuán)保 護(hù)，并保留Boc-Tyr(tBu) -〇H的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到肽樹脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Ly s(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(勸Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc )-Lys(Mtt)-Resin。
[0013] (5)Lys側(cè)鏈Mtt保護(hù)基團(tuán)的脫除：將步驟（4)得到的肽樹脂抽干溶劑后，加入體 積濃度1%~1. 5%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，攪拌90~120s后抽干，重復(fù)50次；最后加入 DMF沖洗，得到脫除Lys側(cè)鏈Mtt基團(tuán)保護(hù)的肽樹脂Boc-Tyr(tBu) -Pro-Phe-Phe-Lys(Boc )-Lys(Boc)-Lys-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(勸Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Res in〇
[0014] (6)Lys側(cè)鏈的棕櫚?；揎棧簩⒉襟E（5)所得肽樹脂按步驟（2)、步驟（3)的工藝 依次完成Fmoc-Glu-OtBu的縮合和脫Fmoc基團(tuán)保護(hù)，茚檢，得縮合和脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù) 的樹脂；再將等摩爾比的棕櫚酸、N-羥基苯并三氮唑、0-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基 脲-六氟磷酸鹽完全溶解于DMF中，混勻后加入二異丙基乙胺，混勻后加入到上述縮合和脫 除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂，攪拌反應(yīng)4~6小時，抽干，用DMF洗滌，得Lys側(cè)鏈棕櫚酰化的肽 樹脂。上述棕櫚酸的量為縮合和脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹脂摩爾量的2~4倍；二異丙基乙胺 的加入量為棕櫚酸摩爾量的2倍。
[0015] (7)肽鏈從樹脂上的切割：將步驟（6)所得Lys側(cè)鏈棕櫚?；碾臉渲枚燃?燒、甲醇交替洗滌，充分抽干溶劑后，加入切割劑，于室溫下切割反應(yīng)2~3小時；過濾，濾液 在不高于37°C的條件下充分減壓旋干，然后用不高于-10°C的乙醚析出沉淀，加水充分溶 解沉淀，分離除去水相中的乙醚；水相通過冷凍干燥得到白色的粗肽固體粉末。
[0016] (8)粗肽的脫鹽和純化：以體積濃度15~20%乙酸溶液為流動相，將粗肽固體粉末 過SephadexG25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱；利用紫外檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得脫鹽的肽化 合物；再用反相高效液相色譜柱對脫鹽的肽化合物進(jìn)行分離純化，經(jīng)分離后收集樣品主峰， 即為目標(biāo)產(chǎn)物。
[0017] 上述方法制備的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜和色譜分析檢測，與設(shè)計的化合物結(jié)構(gòu)一致。表明成 功合成了棕櫚?；揎椀陌⑵念愃莆锘衔锛盎衔颻 ;純化后樣品純度為98%以上。
[0018] 三、棕櫚酰化阿片肽類似物的鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 下面通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明設(shè)計合成的兩種阿片肽類似物在痛覺調(diào)節(jié)方面的藥理 學(xué)功能。在多種痛模型中，檢測化合物和化合物i:這兩種藥物在側(cè)腦室注射水平的鎮(zhèn)痛活 性。實(shí)驗(yàn)過程中，環(huán)境溫度控制在22 ± 1 °C;實(shí)驗(yàn)動物可自由進(jìn)食、飲水。為了確保藥物 注射位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，需要提前4天對實(shí)驗(yàn)所用小鼠進(jìn)行側(cè)腦室埋管手術(shù)。藥物均用生理鹽 水溶解，_2〇°C保存，使用前解凍。小鼠側(cè)腦室每次注射4yl藥物，然后用1yl生理鹽水 沖洗管道。
[0019] 1、化合物i和化合物_在光熱甩尾急性痛中的鎮(zhèn)痛活性研究 本發(fā)明的化合物I:、化合物II和陰性對照生理鹽水，通過側(cè)腦室注射后，利用小鼠光熱 甩尾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)痛覺調(diào)節(jié)作用的活性檢測。