本發(fā)明屬于DNA生物傳感器領(lǐng)域,涉及一種基于卟啉與DNA雙螺旋的溝槽鑲嵌作用的無標(biāo)記DNA的ECL檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
以DNA結(jié)構(gòu)材料為基礎(chǔ)的檢測(cè)在醫(yī)療診斷、食品分析、生化襲擊、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面有非常重要的作用。DNA結(jié)構(gòu)材料構(gòu)建過程的信號(hào)放大策略也發(fā)展起來。目前常用的核酸探針信號(hào)放大策略主要包括聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)放大技術(shù)、雜交鏈反應(yīng)(HCR)放大技術(shù)、DNAzyme信號(hào)放大技術(shù)、滾環(huán)(RCA)放大技術(shù)及鏈置換(SDA)技術(shù)等。
HCR技術(shù)以核酸鏈之間競(jìng)爭(zhēng)雜交作用為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,可以在室溫下進(jìn)行,不需要變溫和其它酶的輔助,特別適于檢測(cè)應(yīng)用。HCR技術(shù)的反應(yīng)機(jī)理為發(fā)夾型探針H1和H2二者在溶液中均能穩(wěn)定存在,不會(huì)相互雜交而彼此打開,當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí),H1可以與目標(biāo)DNA部分互補(bǔ),從而打開發(fā)卡的頸部,伸出一條臂來,與H2部分互補(bǔ)配對(duì),使H2的末端露出再與H1互補(bǔ),如此依次循環(huán)打開,延伸DNA鏈,實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。HCR作為無酶信號(hào)放大技術(shù),簡(jiǎn)單易于操作,在核酸的分析檢測(cè)中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為核酸放大策略的理想選擇。
化學(xué)發(fā)光(CL)是由化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光現(xiàn)象。大多數(shù)CL是由氧化還原反應(yīng)引起的,常存在試劑不穩(wěn)定、難以實(shí)現(xiàn)時(shí)間和空間上的控制、CL試劑難以重復(fù)使用和溶液混合不均勻所帶來的重現(xiàn)性相對(duì)較差等問題。ECL分析法除了具有CL分析法所具有的靈敏度高、線性范圍寬和儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)外,還具有電化學(xué)方法的許多優(yōu)點(diǎn):(1)采用電化學(xué)方法可以很容易改變物質(zhì)的氧化還原能力,可選擇更加穩(wěn)定的試劑、便于電化學(xué)可逆的物質(zhì)的循環(huán)利用和便于實(shí)現(xiàn)需要極端不穩(wěn)定的試劑參與的化學(xué)發(fā)光分析;(2)由于發(fā)光是通過電化學(xué)激發(fā)的,便于調(diào)節(jié)發(fā)光的時(shí)間和空間;(3)可以同時(shí)提供電流信號(hào),便于發(fā)光機(jī)理研究等。
基于HCR反應(yīng)的CL檢測(cè),將信號(hào)因子——聯(lián)吡啶釕,作為標(biāo)記嵌入HCR反應(yīng)后的雙鏈DNA溝槽中(Xu J,et.al.Manganese Porphyrin-dsDNA Complex:A Mimicking Enzyme for Highly Efficient Bioanalysis[J].Anal.Chem.,2013,85:3374~3379)。受常規(guī)聯(lián)吡啶釕分子的電子結(jié)構(gòu)啟發(fā),具有相對(duì)較低HOMO和LUMO能級(jí)、存在金屬-配體電荷傳遞的金屬卟啉經(jīng)理論推測(cè)可成為陰極ECL的備選發(fā)光體,并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其代表性配合物ZnPPIX有極佳的發(fā)光性能。卟啉分子具有良好的生物相容性,相比經(jīng)典光電分子聯(lián)吡啶釕更加適合用于生物傳感器。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)易的基于卟啉與DNA雙螺旋的溝槽鑲嵌作用的無標(biāo)記DNA的ECL檢測(cè)方法,該方法基于卟啉與DNA雙螺旋的溝槽鑲嵌作用,實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記DNA的ECL檢測(cè),利用DNA納米結(jié)構(gòu)的空間組合,通過形成雜化的ECL組裝體實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的靈敏檢測(cè)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:
基于卟啉與DNA雙螺旋的溝槽鑲嵌作用的無標(biāo)記DNA的ECL檢測(cè)方法,采用DNA納米技術(shù),以納米金為基底,固定cDNA,頂端利用cDNA與tDNA互補(bǔ)形成雙鏈DNA大溝槽,與卟啉的相互作用結(jié)合信號(hào)分子,利用卟啉的光電特性,以電致化學(xué)發(fā)光作為檢測(cè)手段,構(gòu)建DNA檢測(cè)用的ECL生物傳感器,具體步驟如下:
步驟1,在經(jīng)打磨、去除雜質(zhì)的玻碳電極表面滴加納米金溶液,室溫干燥,清洗后氮?dú)獯蹈桑?/p>
步驟2,將巰基化的cDNA溶液滴加在納米金修飾的電極表面,水汽飽和條件下過夜,之后用PBS緩沖液洗去未結(jié)合的巰基化的cDNA,然后滴加6-巰基-1己醇(MCH)封閉,防止非特異性吸附,PBS緩沖液沖洗未結(jié)合的MCH,之后將待檢測(cè)的tDNA滴加到電極表面,水汽飽和條件下孵育,PBS緩沖液沖洗后,滴加發(fā)卡探針H1和H2到電極表面,水汽飽和條件下孵育3~4h,PBS緩沖液沖洗,最后滴加鋅卟啉(ZnPPIX)溶液到電極表面,孵育;
步驟3,以步驟2得到的電極為工作電極,Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對(duì)電極,以0.1M四丁基高氯酸銨(TBAP)的二氯甲烷(DCM)溶液為電解液,采用循環(huán)伏安法檢測(cè)ECL信號(hào),調(diào)節(jié)電位為-2.2~0V,掃描速度為100mV S-1,根據(jù)tDNA濃度對(duì)數(shù)值與ECL信號(hào)變化值的線性關(guān)系式計(jì)算出tDNA的濃度,得出待測(cè)液中tDNA的含量。
步驟1中,所述的納米金的半徑為5-20nm。
步驟2中,所述的巰基化的cDNA溶液為含有三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和cDNA的PBS溶液,PBS溶液的濃度為0.01M,pH=4,三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的濃度為100μM,cDNA的濃度為1μM。
步驟2中,所述的PBS緩沖液的濃度為0.01M,pH=7.4。
步驟2中,ZnPPIX溶液為含有NaCl和ZnPPIX的PBS溶液,PBS溶液的濃度為0.01M,pH=7.4,NaCl的濃度為0.5M,ZnPPIX的濃度為50μM。
本發(fā)明以生物相容性好的陰極發(fā)光材料鋅卟啉為信號(hào)分子,利用卟啉與DNA的結(jié)合作用,采用了HCR放大技術(shù),提高了傳感器的靈敏度和信噪比,可以有效的區(qū)分堿基錯(cuò)配序列,能夠應(yīng)對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)問題。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的基于卟啉與DNA雙螺旋的溝槽鑲嵌作用的無標(biāo)記DNA的ECL檢測(cè)方法的流程示意圖。
圖2為電極組裝過程中各階段的ECL信號(hào)圖,其中,a為HCR放大后,b為未經(jīng)HCR放大,c為tDNA/cDNA-BSA/AuNPs/GCE,d為cDNA-BSA/AuNPs/GCE,e為AuNPs/GCE,f為裸電極。
圖3為HCR反應(yīng)電泳結(jié)果圖。
圖4為HCR反應(yīng)時(shí)間與ECL強(qiáng)度曲線關(guān)系圖。
圖5為tDNA、單堿基錯(cuò)配、雙堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配的ECL檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中的納米金的合成按現(xiàn)有方法制備,實(shí)施例參考文獻(xiàn)【Jie J F,et.al.CdS nanrystal-based electrochemiluminescence biosensor for the detection of low-density lipoprotein by increasing sensitivity with gold nanoparticle amplification[J].Anal.Chem.,79:5574~5581.】制備得到,具體步驟為:將100mL含0.01wt.%氯金酸的水溶液攪拌加熱并保持沸騰,迅速加入2.5mL含1.0wt.%的三水合檸檬酸鈉,持續(xù)攪拌待溶液顏色變?yōu)榫萍t色并維持15~20min,攪拌冷卻至室溫,制得納米金。
實(shí)施例中使用的DNA序列如下:
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
實(shí)施例1
傳感器的制備與檢測(cè)
5mm直徑玻碳電極(GCE)分別在0.3nm、0.05nm氧化鋁的麂皮上面各拋光3min,每次皆以超純水沖洗掉吸附在電極表面的氧化鋁,之后以丙酮、乙醇、去離子水超聲,氮?dú)獯蹈纱?。發(fā)卡探針H1和H2先在95℃條件下孵育5min之后降至室溫1h用以活化。SH-cDNA用10mM PBS配制成1μM溶液,并加入TCEP防止巰基之間形成二硫鍵,溶液中TCEP的濃度為100μM。
將25μL上述步驟合成的納米金修飾電極,室溫干燥,超純水滴洗后氮?dú)獯蹈伞?0μL SH-cDNA滴涂在納米金修飾的電極表面,水汽飽和條件下室溫過夜;之后以PBS緩沖液輕輕沖洗掉未吸附的SH-cDNA,以1mM MCH封閉2h;PBS緩沖液沖洗后,修飾20μL不同濃度的tDNA,設(shè)濃度梯度為10-11M~10-7M tDNA滴加于電極表面,水汽飽和條件下37℃孵育3h;洗去未與cDNA結(jié)合的tDNA,將10μL H1(1μM)和10μLH2(1μM)混合滴加在電極表面,水汽飽和條件下37℃孵育3h;PBS緩沖液輕柔沖洗后,以50μM ZnPPIX的PBS溶液修飾傳感表面,孵育4h。
電極組裝過程中,以Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對(duì)電極,調(diào)節(jié)電位為-2~0V,掃描速度為100mV S-1,在3mL以TBAP作為電介質(zhì),濃度為0.1M的DCM溶液中,以電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各階段的ECL信號(hào),結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示,a為0.01μM目標(biāo)核酸存在下通過HCR放大后的ECL,b為0.01μM目標(biāo)核酸存在下無HCR放大步驟的ECL,c為tDNA/cDNA-BSA/AuNPs/GCE,d為cDNA-BSA/AuNPs/GCE,e為AuNPs/GCE(e),f為裸電極。結(jié)果表明只有加入ZnPPIX之后才能檢測(cè)到電致化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象(c,d,e,f均無ECL信號(hào));且通過HCR反應(yīng)延長(zhǎng)DNA鏈進(jìn)行信號(hào)放大之后,同樣濃度目標(biāo)核酸的條件下,ECL信號(hào)強(qiáng)度相差近十倍(如圖所示a與b之間),說明通過HCR策略對(duì)信號(hào)放大的效果非常明顯,可以使檢測(cè)限變低。
實(shí)施例2
1、HCR反應(yīng)核酸分子量觀察,其步驟如下:
2.5%的瓊脂糖凝膠以TBE緩沖液配制,加入10μL EB/100mL溶液混勻,微波爐加熱5min,待溫度降至50℃左右倒入模板冷卻成膠。將各泳道樣品通過溴酚藍(lán)染色后,各取6μM分別滴加。電壓設(shè)為80mV,時(shí)間為90min。泳道1為購(gòu)買自上海生工的50-1000bp DNA Ladder-H2;泳道2為10μM H1、10μM H2、0.1μM tDNA的10mM pH7.4PBS 37℃加速反應(yīng)2h后的溶液;3為10μM H1的PBS溶液;4為10μM H2的PBS溶液;5、6為空白。如圖3所示,通過一段時(shí)間,H1、H2的條帶移動(dòng)距離最遠(yuǎn),而HCR反應(yīng)后的溶液顯示聚集在條帶開始處的離散帶,從而說明HCR反應(yīng)后溶液中的DNA分子量變大,序列變長(zhǎng),且獨(dú)立的H1、H2幾乎不存在,說明HCR反應(yīng)的發(fā)生并且效率很高。
2、HCR反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
本實(shí)施例中傳感器的制備與檢測(cè)與實(shí)施例1相同,不同的是將H1和H2的孵育時(shí)間為1~6h,結(jié)果如圖4所示。
在電化學(xué)適體傳感器的制備過程中,通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在電極表面得到大量H1和H2雙鏈復(fù)合物的步驟尤為關(guān)鍵,它直接決定了傳感器的電化學(xué)響應(yīng)性能。
對(duì)于不同孵育時(shí)間的傳感器,進(jìn)行ECL以Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對(duì)電極,調(diào)節(jié)電位為-2~0V,掃描速度為100mV S-1,在3mL以TBAP作為電介質(zhì),濃度為0.1M的DCM溶液中以電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)ECL信號(hào)。確定最佳反應(yīng)時(shí)間。如圖4所示是參與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的H1和H2反應(yīng)時(shí)間與電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系圖。由圖示看出,當(dāng)兩小時(shí)以上時(shí),強(qiáng)度增加變慢,三小時(shí)后有平穩(wěn)的趨勢(shì),因此將HCR反應(yīng)時(shí)間定為3h。
實(shí)施例3
25μL納米金修飾處理好的GCE,干燥后將20μL SH-cDNA滴涂在納米金修飾的電極表面,室溫過夜;PBS緩沖液沖洗后,以10μL 1mM MCH封閉2h,修飾20μL不同濃度的tDNA,設(shè)濃度梯度為10-11M~10-7M,37℃孵育3h;洗去未與cDNA結(jié)合的tDNA,以10μL H1(1μM)和10μL H2(1μM)混合滴加在電極表面,37℃孵育3h;最后以50μM ZnPPIX的PBS溶液修飾傳感表面,室溫孵育4h。整個(gè)過程水汽飽和,每一步以PBS緩沖液輕輕沖洗。
將tDNA替換為單堿基,雙堿基和三堿基的錯(cuò)配DNA,按照上述相同步驟構(gòu)建傳感器。
以tDNA以及錯(cuò)配DNA構(gòu)建的玻碳電極作為工作電極,以Ag/AgCl為參比電極,鉑電極為對(duì)電極,調(diào)節(jié)電位為-2~0V,掃描速度為100mV S-1,在3mL以TBAP作為電介質(zhì),濃度為0.1M的DCM溶液中以電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)ECL信號(hào),結(jié)果如圖5所示。由圖5A可以看出,隨著目標(biāo)DNA濃度的增加,電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相應(yīng)增加。內(nèi)插圖說明濃度與發(fā)光強(qiáng)度的呈線性關(guān)系。堿基錯(cuò)配的ECL說明傳感器具有很高的檢測(cè)靈敏度與抗干擾能力,且僅以溶解氧作為共反應(yīng)劑的條件下,檢測(cè)下限達(dá)到10-11M,證明該種傳感策略有很高的檢測(cè)靈敏度。圖5B可以看到堿基錯(cuò)配的ECL,說明傳感策略有很高的抗干擾能力,能夠有效的區(qū)分堿基錯(cuò)配,可以成功的應(yīng)對(duì)單基因多態(tài)性的檢測(cè)問題,具有很好的實(shí)用性。綜上所述,本發(fā)明的無標(biāo)記核酸分析手段,簡(jiǎn)單方便,便宜易操作,高效靈敏,可進(jìn)一步發(fā)展為檢測(cè)生物標(biāo)志物核酸序列的生物醫(yī)學(xué)傳感,用于疾病的診斷。