本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫檢測(cè)固相載體材料、其制備方法以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用抗原抗體間的特異性識(shí)別作用，免疫檢測(cè)可以對(duì)體液中的微量物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，且具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好，以及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)，疾病的預(yù)防以及治療康復(fù)中扮演著重要角色。
免疫檢測(cè)平臺(tái)種類很多，主要包括以酶聯(lián)免疫試劑盒為代表的商業(yè)試劑盒，免疫傳感器，微流控芯片以及即時(shí)檢測(cè)設(shè)備四大類。目前這些免疫檢測(cè)平臺(tái)在復(fù)雜環(huán)境，如全血，100％血清以及血漿中進(jìn)行微量識(shí)別時(shí)，均面臨著非特異性蛋白含量高的問題，其濃度相對(duì)待測(cè)物質(zhì)，可高達(dá)106～107倍。大量非特異性蛋白在檢測(cè)溶液中的存在以及載體材料表面的吸附，會(huì)干擾并削弱抗原抗體間的特異性識(shí)別作用；同時(shí)標(biāo)記信號(hào)分子的識(shí)別抗體在基底的吸附也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)背景信號(hào)高，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果；此外載體材料表面負(fù)載抗體的數(shù)量以及活性，也會(huì)影響最終免疫檢測(cè)靈敏度。
為了提高免疫檢測(cè)靈敏度，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了很多種可以用作免疫檢測(cè)的固相載體。其中，憑借大的比表面積以及高的探針負(fù)載量，許多納米材料，如四氧化三鐵磁珠，碳納米管，氧化鋅納米棒等均被用來構(gòu)建三維納米基底，從而提高檢測(cè)信號(hào)。然而，納米材料具有的高比表面積，在提高探針負(fù)載量的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致非特異性蛋白吸附增強(qiáng)，導(dǎo)致高的背景信號(hào)，最終使信噪比降低。因此，構(gòu)建一種既可以有效提高探針負(fù)載量，同時(shí)又能抑制非特異性蛋白吸附的免疫檢測(cè)固相載體材料十分具有挑戰(zhàn)性。
中國發(fā)明專利103926398A公開了一種免疫磁珠的制備方法，其中將硅基磁珠與帶有雙端羧基的有機(jī)小分子反應(yīng)制備得到羧基磁珠，隨后直接進(jìn)行抗體固定。中國發(fā)明專利104096548A公開的免疫磁珠制備方法中在惰性氣氛中，將堿性溶液注入含有鐵源和穩(wěn)定劑的混合液中，得到磁性納米粒子，隨后在磁性納米粒子表面直接修飾抗體。以上免疫磁珠表面均不具備良好的抗非特異性蛋白吸附性能，同時(shí)直接將抗體固定在免疫磁珠表面，抗體固定量有限且會(huì)導(dǎo)致抗體活性降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種免疫檢測(cè)固相載體材料、其制備方法以及應(yīng)用，制備的載體材料用于免疫檢測(cè)時(shí)，背景信號(hào)低，負(fù)載量高，具有較高的檢測(cè)靈敏度。
本發(fā)明提供了一種免疫檢測(cè)固相載體材料，包括：納米基底，和修飾于納米基底表面的內(nèi)層抗污聚合物刷層和外層抗體固定聚合物刷層。
優(yōu)選的，所述抗污聚合物刷層由抗污單體聚合得到，所述抗污單體包括聚(乙二醇)甲基丙烯酯，2-羥基乙基甲基丙烯酸酯，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿，[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸中的一種或多種；
所述抗體固定聚合物刷層由抗體固定單體聚合得到，所述抗體固定單體包括甲基丙烯酸，丙烯酸，甲基丙烯酸縮水甘油醚，2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮，3-丙烯酰胺基苯硼酸，3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸和烯丙基胺中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述納米基底、抗污聚合物刷層和抗體固定聚合物刷層的質(zhì)量比為100：(20～60)：(5～50)。
優(yōu)選的，所述納米基底為磁珠，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子，碳納米管或氧化鋅納米棒。
本發(fā)明還提供了一種免疫檢測(cè)固相載體材料的制備方法，包括以下步驟：
a)將含芐基氯的偶聯(lián)劑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉先后固定到納米基底表面，得到可用于接枝聚合的基底；
b)將步驟a)得到的基底與抗污單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到抗污聚合物刷修飾的基底；
c)將步驟b)得到的基底與抗體固定單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到所述免疫檢測(cè)固相載體材料。
優(yōu)選的，所述步驟b)具體為：
將步驟a)得到的基底分散在含抗污單體的溶液中，在紫外光照射的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到抗污聚合物刷修飾的基底。
所述步驟c)具體為：
將步驟b)得到的基底分散在含抗體固定單體的溶液中，在紫外光照射的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到所述免疫檢測(cè)固相載體材料。
優(yōu)選的，所述抗污聚合物刷層由抗污單體聚合得到，所述抗污單體包括聚(乙二醇)甲基丙烯酯，2-羥基乙基甲基丙烯酸酯，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿，[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸中的一種或多種；
所述抗體固定聚合物刷層由抗體固定單體聚合得到，所述抗體固定單體包括甲基丙烯酸，丙烯酸，甲基丙烯酸縮水甘油醚，2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮，3-丙烯酰胺基苯硼酸，3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸和烯丙基胺中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述含芐基氯的偶聯(lián)劑為4-氯甲基苯甲酰氯，3-氯甲基苯甲酰氯，4-氯甲基苯基異氰酸酯，4-氯甲基-1,3-苯二異氰酸酯和4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷中的任意一種或幾種。
本發(fā)明還提供了上述免疫檢測(cè)固相載體材料或上述制備方法制備的免疫檢測(cè)固相載體材料在免疫分析、核酸分離提取、細(xì)胞分選或酶的固定中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，使用前在所述免疫檢測(cè)固相載體材料表面負(fù)載抗體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種免疫檢測(cè)固相載體材料，包括：納米基底，和修飾于納米基底表面的內(nèi)層抗污聚合物刷層和外層抗體固定聚合物刷層層。本發(fā)明利用內(nèi)層抗污聚合物刷優(yōu)異的親水性，可有效減少蛋白在表面吸附，從而降低背景信號(hào)。同時(shí)由于納米基底比表面積大以及外層抗體固定聚合物刷上大量的抗體固定單元，可以實(shí)現(xiàn)識(shí)別探針在表面的化學(xué)隨機(jī)固定以及取向固定，最終制備得到的載體材料具有低背景以及高負(fù)載的特性。
本發(fā)明還提供了上述載體材料的制備方法，僅需將光引發(fā)劑固定在基底表面，隨后在紫外光照射下引發(fā)接枝聚合反應(yīng)，即可得到載體材料，方法簡單易操作，適用性廣。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種免疫檢測(cè)固相載體材料，包括：納米基底，和修飾于納米基底表面的內(nèi)層抗污聚合物刷層和外層抗體固定聚合物刷層。
本發(fā)明提供的雙層聚合物刷修飾的載體材料通過在紫外光照射下，分別先后兩次引發(fā)接枝抗污單體以及抗體固定單體聚合制備得到。
由于本發(fā)明提供的載體材料具有抗污底層，因此所制得的載體材料具有良好的親水性，可以均勻分散在水中，同時(shí)有效減少非特異性蛋白在基底表面吸附。同時(shí)由于本發(fā)明提供的納米基底比表面積大、且具有上層抗體固定層，因此聚合物刷上存在的大量結(jié)合位點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)抗體化學(xué)固定并且進(jìn)一步提高負(fù)載量，因此本發(fā)明提供的載體材料不僅具有低的背景信號(hào)，同時(shí)具有高的抗體負(fù)載量。
上述修飾于基底表面的內(nèi)層抗污聚合物刷層由抗污單體聚合得到，所述抗污單體優(yōu)選包括聚(乙二醇)甲基丙烯酯，2-羥基乙基甲基丙烯酸酯，1-乙烯基-2-吡咯烷酮，甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿，[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]二甲基(3-硫代丙基)氫氧化銨和2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸中的一種或多種。
本發(fā)明利用抗污單體的親水性，使得到的內(nèi)層抗污聚合物刷層可以減少非特異性蛋白在表面吸附。
所述外層抗體固定聚合物刷層修飾于內(nèi)層抗污聚合物刷層表面，即所述載體材料的最外層。由抗體固定單體聚合得到，所述抗體固定單體優(yōu)選包括甲基丙烯酸，丙烯酸，甲基丙烯酸縮水甘油醚，2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮，3-丙烯酰胺基苯硼酸，3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸和烯丙基胺中的一種或多種。
本發(fā)明利用上層中大量的抗體結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了抗體的化學(xué)固定以及高負(fù)載量。
本發(fā)明中，所述納米基底、抗污聚合物刷層和抗體固定聚合物刷層的質(zhì)量比優(yōu)選為100：(20～60)：(5～50)，更優(yōu)選為100：(20～40)：(10～50)。
本發(fā)明對(duì)所述納米基底并無特殊限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適用于免疫檢測(cè)的基底材料，本發(fā)明優(yōu)選為磁珠，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子，碳納米管或氧化鋅納米棒。更優(yōu)選為四氧化三鐵磁珠。
磁珠不僅具有納米結(jié)構(gòu)的高比表面積特點(diǎn)，同時(shí)具有超順磁性，在外界磁場(chǎng)作用下即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)物質(zhì)分離，過程簡便快速，而且磁珠制備方法多，磁珠種類多，尺寸范圍廣，且表面易于進(jìn)行化學(xué)修飾，因此在生物領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明以磁珠作為基底，制備的生物磁珠具有非常高的抗體負(fù)載量。
所述磁珠的粒徑優(yōu)選為10nm～10μm。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的載體材料抗體負(fù)載量更大，檢測(cè)信號(hào)更強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度同時(shí)增加。
本發(fā)明還提供了上述免疫檢測(cè)固相載體材料的制備方法，包括以下步驟：
a)將含芐基氯的偶聯(lián)劑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉先后固定到納米基底表面，得到可用于接枝聚合的基底；
b)將步驟a)得到的基底與抗污單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到抗污聚合物刷修飾的基底；
c)將步驟b)得到的基底與抗體固定單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到所述免疫檢測(cè)固相載體材料。
本發(fā)明首先將光引發(fā)劑含芐基氯的偶聯(lián)劑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉兩部分先后固定到納米基底表面。
優(yōu)選的，將納米基底分散在無水甲苯中，得到基底溶液，然后將光引發(fā)劑含芐基氯的偶聯(lián)劑溶解在上述基底溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，回流反應(yīng)，得到固定含芐基氯的偶聯(lián)劑的基底。隨后將基底用甲苯溶液先后清洗3次，分散在乙醇中備用。
在本發(fā)明中，所述含芐基氯的偶聯(lián)劑與納米基底反應(yīng)的溫度優(yōu)選為40～100℃，更優(yōu)選為50～100℃，最優(yōu)選為60～80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4～24h，更優(yōu)選為6～20h，最優(yōu)選為8～16h。
本發(fā)明中，所述含芐基氯的偶聯(lián)劑優(yōu)選為4-氯甲基苯甲酰氯，3-氯甲基苯甲酰氯，4-氯甲基苯基異氰酸酯，4-氯甲基-1,3-苯二異氰酸酯和4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷。
得到固定含芐基氯的偶聯(lián)劑的基底后，本發(fā)明將其分散在乙醇中，加入二乙基二硫代氨基甲酸鈉反應(yīng)，最終得到固定引發(fā)劑的、可用于接枝聚合的基底。在本發(fā)明中，所述二乙基二硫代氨基甲酸鈉與固定了含芐基氯的偶聯(lián)劑的基底反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20～80℃,更優(yōu)選為30～70℃，最優(yōu)選為40～60℃。所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為2～24h，更優(yōu)選為4～20h，最優(yōu)選為6～16h。
得到可用于接枝聚合的基底后，將其與抗污單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，在其表面引發(fā)抗污單體的聚合反應(yīng)，得到抗污聚合物刷修飾的基底。
具體的，將上述得到的基底分散在含抗污單體的溶液中，在紫外光照射的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到抗污聚合物刷修飾的基底。
優(yōu)選的，將抗污單體分散在溶劑中，隨后將上述得到的基底分散在上述溶液中，置于紫外燈下照射，得到內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的基底。在本發(fā)明中，所述抗污單體的種類與上述技術(shù)方案中抗污單體的種類一致，在此不再贅述。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)溶劑優(yōu)選為二甲苯，甲苯，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺和甲醇中的任意一種或多種，更優(yōu)選為二甲苯，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，甲醇，最優(yōu)選為四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺或甲醇。在本發(fā)明中，所述基底在溶劑中的濃度優(yōu)選為0.1～10mg/mL,更優(yōu)選為0.5～8mg/mL，最優(yōu)選為1～5mg/mL。所述抗污單體在溶劑中的濃度優(yōu)選為5％～50％，更優(yōu)選為5％～40％，最優(yōu)選為10％～30％。上述濃度，對(duì)于液體而言，為體積百分含量；對(duì)于固體而言，為質(zhì)量含量。
在本發(fā)明中，所述紫外燈的光源優(yōu)選為低壓汞燈、中壓汞燈、高壓汞燈、碘鎢燈和加濾光片中的一種或幾種，所述紫外光的主透過波長優(yōu)選為180～450nm,更優(yōu)選為200～400nm，所述紫外照射時(shí)間優(yōu)選為10～60min，更優(yōu)選為10～50min，最優(yōu)選為20～40min。
本發(fā)明優(yōu)選的，完成所述抗污單體在基底表面的接枝聚合反應(yīng)后，將反應(yīng)所得基底材料在搖床振蕩條件下，依次采用丙酮，乙醇進(jìn)行清洗，得到清洗后的基底。
得到抗污聚合物刷修飾的基底后，將其與抗體固定單體進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到修飾有抗污聚合物刷層和抗體固定聚合物刷層的免疫檢測(cè)固相載體材料。
具體的，將其分散在含抗體固定單體的溶液中，在紫外光照射的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)。
本發(fā)明優(yōu)選的，將內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的基底分散在溶劑中，加入抗體固定單體于上述基底溶液中，紫外燈照射，最終即得到修飾有抗污聚合物刷層和抗體固定聚合物刷層的固相載體材料。在本發(fā)明中，所述抗體固定單體的種類與上述技術(shù)方案中抗體固定單體的種類一致，在此不再贅述。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)溶劑優(yōu)選為二甲苯，甲苯，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，甲醇和水中的一種或多種，更優(yōu)選為二甲苯，四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，甲醇或水，最優(yōu)選為四氫呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，甲醇或水。在本發(fā)明中，所述內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的基底在溶劑中的濃度優(yōu)選為0.1～10mg/mL,更優(yōu)選為0.5～8mg/mL，最優(yōu)選為1～5mg/mL。所述抗體固定單體在溶劑中的濃度優(yōu)選為5％～50％，更優(yōu)選為5％～40％，最優(yōu)選為5％～20％。上述濃度，對(duì)于液體而言，為體積百分含量；對(duì)于固體而言，為質(zhì)量含量。
在本發(fā)明中，所述紫外燈的光源優(yōu)選為低壓汞燈、中壓汞燈、高壓汞燈、碘鎢燈和加濾光片中的一種或幾種，所述紫外光的主透過波長優(yōu)選為180～450nm,更優(yōu)選為200～400nm，所述紫外照射時(shí)間優(yōu)選為5～40min，更優(yōu)選為5～35min，最優(yōu)選為10～30min。
完成上述反應(yīng)后，本發(fā)明優(yōu)選將上述雙層聚合物刷修飾的載體材料進(jìn)行清洗，清洗步驟與上述內(nèi)層抗污聚合物刷修飾磁珠的清洗步驟一致，在此不再贅述。
本發(fā)明提供的制備方法僅需將固定光引發(fā)劑的基底材料與接枝單體分散在溶液中，先后兩次置于紫外光照射下進(jìn)行接枝聚合反應(yīng)，條件溫和，反應(yīng)速度快，不需額外催化劑，無其他副反應(yīng)。且所需設(shè)備簡單，方法易操作，有很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明還提供了上述免疫檢測(cè)固相載體材料在免疫分析、核酸分離提取、細(xì)胞分選、或者酶的固定中的應(yīng)用。
本發(fā)明優(yōu)選的，使用前在所述免疫檢測(cè)固相載體材料表面負(fù)載抗體。
具體的，將上述免疫檢測(cè)固相載體材料與抗體溶液反應(yīng)，進(jìn)行抗體固定，最終得到免疫檢測(cè)材料。
在本發(fā)明中，所述緩沖溶液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸和三(羥甲基)氨基甲烷中的任意一種或多種，更優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液或4-羥乙基哌嗪乙磺酸；所述抗體的濃度優(yōu)選為10～500μg/mL,更優(yōu)選為50～300μg/mL，最優(yōu)選為50～200μg/mL。所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為25～45℃，最優(yōu)選為37℃；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為2～24h，更優(yōu)選為2～16h，最優(yōu)選為6～12h。
反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明優(yōu)選的，將上述制備得到的雙層聚合物刷修飾的免疫檢測(cè)用含有0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗，清洗后分散于磷酸鹽緩沖液中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的免疫檢測(cè)固相載體材料、其制備方法以及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g，100nm四氧化三鐵磁珠50mg，二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，密封進(jìn)行反應(yīng)，溫度升高至60℃，回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定了引發(fā)劑的磁珠保存?zhèn)溆谩?/p>
將固定了引發(fā)劑的磁珠分散在二甲苯中，濃度為10mg/mL,隨后加入抗污單體聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，濃度為5％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射10min。丙酮、乙醇依次分別清洗30min，得到內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的磁珠。
將上述內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的磁珠分散在二甲苯中，濃度5mg/mL，隨后加入抗體固定單體單元甲基丙烯酸縮水甘油醚，濃度10％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射6min。丙酮、乙醇依次分別清洗30min，制得雙層聚合物刷修飾的磁珠。
取上述雙層聚合物刷修飾的磁珠10mg，分散至磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)中，加入抗體，濃度為10μg/mL，45℃下反應(yīng)2h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明采用熒光標(biāo)記蛋白對(duì)磁珠的非特異性蛋白吸附進(jìn)行研究。以異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白以及羅丹明標(biāo)記纖維蛋白原為代表。首先取上述制得的免疫磁珠1mg,分散至含1mg/mL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白(或100μg/mL羅丹明標(biāo)記纖維蛋白原)的PBS溶液中，37℃下?lián)u床吸附2h，隨后PBS溶液清洗3次，每次10min，后分散至1mL PBS溶液中。取吸附熒光蛋白后的磁珠溶液200μL，加至黑色酶標(biāo)板中，測(cè)試其熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度掃描采用多功能酶標(biāo)儀(Biotek，Synergy H1)進(jìn)行，其中對(duì)于異硫氰酸熒光素的測(cè)試條件為激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長為520nm，gain值為100。對(duì)于羅丹明B標(biāo)記纖維蛋白原樣品的測(cè)試條件為激發(fā)波長560nm，發(fā)射波長為590nm。每種樣品測(cè)試五個(gè)重復(fù)樣品，記錄熒光強(qiáng)度平均值。所得結(jié)果如表1所示，表1為本發(fā)明實(shí)施例以及比較例中，免疫磁珠上非特異性蛋白吸附量。
本發(fā)明對(duì)抗體固定量的評(píng)價(jià)采用Alexa Fluor 555標(biāo)記的二抗進(jìn)行識(shí)別負(fù)載抗體，通過讀取負(fù)載在磁珠表面抗體的熒光強(qiáng)度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，最后計(jì)算得到每毫克磁珠表面抗體負(fù)載量μg。首先取上述制得的免疫磁珠1mg,分散至含10μg/mL的Alexa Flour 555標(biāo)記的二抗溶液中，37℃下?lián)u床識(shí)別30min，隨后PBS溶液清洗3次，每次5min，后分散至1mL PBS溶液中。取識(shí)別二抗后的磁珠溶液200μL，加至黑色酶標(biāo)板中，測(cè)試其熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度掃描采用多功能酶標(biāo)儀(Biotek，Synergy H1)進(jìn)行，其中對(duì)于Alexa Fluor555的測(cè)試條件為激發(fā)波長555nm，發(fā)射波長為590nm，gain值為100。每種樣品測(cè)試五個(gè)重復(fù)樣品，取平均值。配制1μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,30μg/mL,40μg/mL,50μg/mL,60μg/mL,70μg/mL,80μg/mL,90μg/mL,100μg/mL的Alexa Fluor 555標(biāo)記的二抗溶液，測(cè)試其熒光強(qiáng)度，得到熒光強(qiáng)度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出免疫磁珠上抗體固定量。所得結(jié)果如表2所示，表2為本發(fā)明實(shí)施例以及比較例中，免疫磁珠上抗體負(fù)載量。
實(shí)施例2
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g,200nm四氧化三鐵磁珠50mg,二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溫度升高至50℃，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定引發(fā)劑的磁珠保存?zhèn)溆谩?/p>
將固定了引發(fā)劑的磁珠分散在二甲苯中，濃度為5mg/mL,隨后加入抗污單體1-乙烯基-2-吡咯烷酮，濃度為5％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射10min。丙酮乙醇先后清洗30min，得到內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的磁珠。
將上述內(nèi)層抗污聚合物刷修飾磁珠分散在水中，濃度5mg/mL，隨后加入抗體固定單體丙烯酸，濃度10％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射6min。丙酮、乙醇先后清洗30min，制得雙層聚合物刷修飾的磁珠。
取上述雙層聚合物刷修飾的磁珠10mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽0.4g,N-羥基琥珀酰亞胺0.1g,2-(N-嗎啡啉)乙磺酸0.2g,分散至10mL水中，25℃下活化30min，反應(yīng)完畢后水清洗。將上述活化磁珠加入抗體的PBS溶液中，濃度為10μg/mL，37℃下反應(yīng)2h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了本實(shí)施例2得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
實(shí)施例3
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g,500nm四氧化三鐵磁珠50mg,二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溫度升高至50℃，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定引發(fā)劑的磁珠保存?zhèn)溆谩?/p>
將固定了引發(fā)劑的磁珠分散在甲醇中，濃度為5mg/mL,隨后加入抗污單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿，濃度為5wt％。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射10min。丙酮、乙醇先后清洗30min，得到內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的磁珠。
將上述內(nèi)層抗污聚合物刷修飾的磁珠分散在N,N-二甲基甲酰胺中，濃度5mg/mL，隨后加入抗體固定單體單元3-丙烯酰胺基苯硼酸，濃度10wt％。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射6min。丙酮、乙醇先后清洗30min，制得雙層聚合物刷修飾的磁珠。
取上述雙層聚合物刷修飾的磁珠10mg，加至10mL的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH＝8.5)的緩沖液中，加入抗體，濃度為10μg/mL，37℃下反應(yīng)6h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了本實(shí)施例3得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
實(shí)施例4
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g,1μm磁珠50mg,二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，超聲攪拌回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，磁鐵分離，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溫度升高至50℃，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定引發(fā)劑的磁珠保存?zhèn)溆谩?/p>
將固定了引發(fā)劑的磁珠分散在甲醇中，濃度為5mg/mL,隨后加入抗污單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿，濃度為5wt％。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射10min。丙酮乙醇先后清洗30min，得到底層抗污聚合物刷修飾的磁珠。
將上述底層抗污聚合物刷修飾磁珠分散在二甲苯中，濃度5mg/mL，隨后加入抗體固定單體單元2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮，濃度10％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射6min。丙酮清洗30min，制得雙層聚合物刷修飾的磁珠。
取上述雙層聚合物刷修飾的磁珠10mg，加至10mL磷酸鹽緩沖液中，加入抗體，濃度為10μg/mL，37℃下反應(yīng)2h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了本實(shí)施例4得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
比較例1
三頸瓶中加入環(huán)氧丁基三甲氧基硅烷0.1g,100nm磁珠50mg,二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，磁分離，二甲苯乙醇先后清洗三次，得到固定了環(huán)氧丁基三甲氧基硅烷的磁珠。
取上述固定了環(huán)氧丁基三甲氧基硅烷的磁珠10mg，分散至磷酸鹽緩沖液(pH＝7.5)中，加入抗體，濃度為10μg/mL，45℃下反應(yīng)2h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了本比較例1得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
比較例2
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g,100nm磁珠50mg,二甲苯50mL，攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溫度升高至50℃，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定引發(fā)劑的磁珠保存?zhèn)溆谩?/p>
將固定了引發(fā)劑的磁珠分散在二甲苯中，濃度為5mg/mL,隨后加入抗污單體聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯，濃度為5％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射10min。丙酮乙醇先后清洗30min，得到抗污底層修飾的磁珠。
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了本比較例2得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
比較例3
三頸瓶中加入光引發(fā)劑4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷0.1g,100nm磁珠50mg,二甲苯50mL，超聲同時(shí)攪拌使磁珠充分分散。氮?dú)獯祾咂績?nèi)空氣30min，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)密封，溫度升高至60℃，超聲攪拌回流6h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，磁分離，二甲苯清洗三次，得到固定了4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷的磁珠。
將50mg的4-(氯甲基)苯基三甲氧基硅烷修飾磁珠分散在乙醇中，隨后加入0.1g二乙基二硫代氨基甲酸鈉，溫度升高至50℃，回流反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，乙醇清洗三次，最終將固定引發(fā)劑的磁珠分散在乙醇中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>
將上述固定引發(fā)劑的磁珠分散在二甲苯中，濃度5mg/mL，隨后加入抗體固定單體丙烯酸，濃度10％(v/v)。隨后將反應(yīng)溶液置于300W高壓汞燈下照射6min。丙酮乙醇先后清洗30min，制得雙層聚合物刷修飾的磁珠。
取上述雙層聚合物刷修飾的磁珠10mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽0.4g,N-羥基琥珀酰亞胺0.1g,2-(N-嗎啡啉)乙磺酸0.2g,分散至10mL水中，25℃下活化30min，反應(yīng)完畢后水清洗。將上述活化磁珠加入抗體的PBS溶液中，濃度為10μg/mL，37℃下反應(yīng)2h，在磁珠表面負(fù)載上抗體，制得免疫磁珠。將上述免疫磁珠在0.05％Tween的磷酸鹽緩沖液中清洗1h，分散在PBS中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明按照實(shí)施例1中的方法測(cè)試了比較例3得到的免疫磁珠的非特異性蛋白吸附以及抗體固定量。所得結(jié)果如表1和表2所示。
表1免疫磁珠上非特異性蛋白吸附
表2免疫磁珠上抗體負(fù)載量
從表1可以看出，對(duì)于比較例1，無聚合物刷修飾的環(huán)氧官能團(tuán)修飾的磁珠表面抗體固定量為每毫克磁珠上固定17μg,牛血清白蛋白吸附后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為2453a.u.,纖維蛋白原吸附產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度1956a.u.。對(duì)于比較例2，接枝單層抗污聚合物刷聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯后的磁珠表面則蛋白吸附減少，對(duì)于牛血清白蛋白，熒光強(qiáng)度為285a.u.,對(duì)于纖維蛋白原，熒光強(qiáng)度為198a.u.，表明親水性分子刷修飾磁珠表面后，蛋白吸附量得到抑制，然而由于沒有抗體固定單元，其抗體負(fù)載量僅有2μg/mg。而對(duì)于比較例3，只接枝單層抗體固定層丙烯酸后，抗體固定量明顯增加，達(dá)到173μg/mg，然而由于其不具有抗非特異性蛋白吸附性能，因此同時(shí)引起非特異性蛋白吸附增加，對(duì)于牛血清白蛋白，熒光強(qiáng)度達(dá)到1772a.u.,對(duì)于纖維蛋白原，熒光強(qiáng)度達(dá)到1634a.u.。相對(duì)以上三個(gè)比較例，對(duì)于實(shí)施例1，由于聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯底層的存在，其可以有效抑制蛋白吸附，對(duì)于牛血清白蛋白，熒光強(qiáng)度為320a.u.,對(duì)于纖維蛋白原，熒光強(qiáng)度為235a.u.，同時(shí)由于上層抗體固定高分子刷聚甲基丙烯酸縮水甘油醚的引入，其具有更高的抗體負(fù)載量，達(dá)到132μg/mg的負(fù)載量。其他實(shí)施例，也表現(xiàn)出低的背景吸附和高的抗體負(fù)載量。
由上述實(shí)施例及比較例可知，本發(fā)明制備得到的免疫磁珠抗體負(fù)載量可以高達(dá)，每毫克磁珠上負(fù)載213μg抗體，同時(shí)背景吸附可降低90％。
本發(fā)明提供的制備方法簡單方便，條件溫和，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。