專利名稱：改進(jìn)的側(cè)流分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及側(cè)流分析，更具體地本發(fā)明涉及改進(jìn)的側(cè)流分析，其中分析物結(jié)合劑偶聯(lián)于檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑。
對(duì)流體樣品，尤其是體液樣品中的細(xì)胞和分析物進(jìn)行定量分析，通常會(huì)為醫(yī)生和病人提供關(guān)鍵的診斷和治療信息。例如，利用了抗原-抗體反應(yīng)高特異性的免疫測(cè)試方法，就提供了一種測(cè)量分析物的方法(Kennedy，D.M.和S.J.Challacombe(編)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和其他固相免疫測(cè)定理論和實(shí)踐(ELISAand Other Solid Phase ImmunoassaysTheoretical and Practical Aspects)，John Wiley and Sons，Chichester(1988)。該文獻(xiàn)與本文提及的其他文獻(xiàn)都被引用作為參考，就如同它們被完全復(fù)制那樣。這些分析方法也可用于其他應(yīng)用方面，例如獸醫(yī)、食品測(cè)試或農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面。
可提供樣品中分析物的定量測(cè)量值的免疫測(cè)定方法，早已使用只有在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下才有的昂貴分析儀而且所用的程序復(fù)雜且步驟多。
免疫色譜分析，例如在下列文獻(xiàn)中所描述的免疫色譜分析是較簡(jiǎn)單的，但是不能提供分析物的定量測(cè)量值英國(guó)2,204,398A；美國(guó)專利No.5,096,837、5,238,652和5,266,497；Birnbaum，S.等人，分析生物化學(xué)(AnalyticalBiochem.)，206168-171(1992)；Roberts，M.A.和R.A.Durst，分析化學(xué)(Analytical Chem.)67482-491(1995)；和Klimov，A.D.等人，臨床化學(xué)(Clinical Chem.)411360(1995)。相反，這些免疫色譜分析檢測(cè)是否有高于界定的測(cè)試截止水平(cutoff level)的分析物。無(wú)法進(jìn)行定量測(cè)定限制了這些分析方法的用途。
Cathy等人在美國(guó)專利No.5,660,993中公開(kāi)了一種一次性的診斷測(cè)試裝置及其用法。該裝置包括一個(gè)與至少一個(gè)主通道液體相通的加樣孔。在液體流動(dòng)方向上，主通道包括一個(gè)與孵育區(qū)和廢物區(qū)液體相通的主試劑區(qū)。與主通道液體相通的是至少一個(gè)側(cè)向試劑通道。在液體流動(dòng)方向上，側(cè)向試劑通道含有液體添加孔和側(cè)向試劑區(qū)，它們?cè)谥魍ǖ赖姆跤齾^(qū)上游某處與主通道液體相通。攪拌裝置可被包括在至少一個(gè)主的和側(cè)向的試劑區(qū)和/或孵育區(qū)。毛細(xì)閥可位于孵育區(qū)上游沿著主試劑通道和側(cè)試劑通道的不同位置，以便控制液體在裝置中的流動(dòng)。這種裝置機(jī)械結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此不適合重復(fù)而精確的用途。
Palace等人在國(guó)際出版號(hào)WO92/12428中公開(kāi)了一種非濾紙的單步式側(cè)流分析的設(shè)計(jì)，它使用側(cè)流測(cè)試片來(lái)分析生物樣品中的分析物。在所公開(kāi)的裝置中，采用了三個(gè)處于非濾紙式側(cè)流接觸的區(qū)域樣品接受區(qū)、標(biāo)記區(qū)和捕獲區(qū)。含分析物的樣品被攜帶通過(guò)標(biāo)記區(qū)，與具有可視分子的分析標(biāo)記物反應(yīng)，該分析標(biāo)記物宜為顆粒并且這些顆粒偶聯(lián)于對(duì)分析物特異的結(jié)合劑或者偶聯(lián)于可與分析物競(jìng)爭(zhēng)捕獲劑的競(jìng)爭(zhēng)劑。樣品和某些可視分子一起繼續(xù)流動(dòng)進(jìn)入捕獲區(qū)，其中被分析物或競(jìng)爭(zhēng)劑就被偶聯(lián)于或捕獲于可視分子。過(guò)量液體被吸入與捕獲區(qū)接觸的吸收區(qū)?？梢暦肿釉诓东@區(qū)顯現(xiàn)，就獲得了陽(yáng)性結(jié)果。包含可視分子的對(duì)照標(biāo)記物(較佳地可與分析標(biāo)記物在顏色上區(qū)分開(kāi))也可被包括在標(biāo)記區(qū)，并且在捕獲區(qū)單獨(dú)的對(duì)照區(qū)域被捕獲以證實(shí)液體流動(dòng)是如預(yù)計(jì)的那樣。然而，對(duì)照標(biāo)記物不能修正側(cè)流測(cè)試片之間的差異，從而導(dǎo)致測(cè)量值的不準(zhǔn)確和不一致。對(duì)照劑流過(guò)捕獲區(qū)的對(duì)照區(qū)域這一證據(jù)，并不能證明分析的標(biāo)記部分流過(guò)了捕獲區(qū)的分析物特異性區(qū)域。
Eisinger等人的美國(guó)專利No.4,943,522公開(kāi)了一種進(jìn)行特異性結(jié)合配對(duì)測(cè)定(例如免疫測(cè)定)的方法和裝置。一種允許非濾紙式側(cè)流的多孔膜被用作分析基質(zhì)；結(jié)合配對(duì)的一員被固定在基質(zhì)上劃定的指示區(qū)。樣品被加在遠(yuǎn)離指示區(qū)的某處，并側(cè)流通過(guò)指示區(qū)；樣品中的任何分析物被固定化的特異性結(jié)合成員所結(jié)合，并被檢測(cè)出。然而，這種分析沒(méi)有任何對(duì)照，這會(huì)導(dǎo)致測(cè)試不準(zhǔn)確和產(chǎn)生差錯(cuò)。
Campbell等人的美國(guó)專利No.4,703,017公開(kāi)了一種測(cè)試分析物的固相分析法，其中結(jié)合劑被負(fù)載在固相載體(例如硝酸纖維素)上，而示蹤物包括用有色顆粒標(biāo)記物(如包含了染料的脂質(zhì)體)標(biāo)記的配體。該分析的靈敏度高，而且示蹤物在分析條件下可在載體上顯現(xiàn)出，因此示蹤物在測(cè)定時(shí)就被顯現(xiàn)出，而不需要測(cè)量?jī)x器也不需要進(jìn)一步處理。然而，因?yàn)闊o(wú)測(cè)量?jī)x器，因此人的主觀因素被引入分析，導(dǎo)致不準(zhǔn)確和產(chǎn)生差錯(cuò)。
Campbell等人的美國(guó)專利No.4,743,560公開(kāi)了一種測(cè)試分析物的固相分析法，其中結(jié)合劑被負(fù)載在固相載體(例如硝酸纖維素)上，而示蹤物包括用顆粒標(biāo)記物(如脂質(zhì)體)標(biāo)記的配體，其中包括不直觀的可檢測(cè)標(biāo)記物。然而，該分析方法沒(méi)有對(duì)照，因此會(huì)導(dǎo)致測(cè)試不準(zhǔn)確和產(chǎn)生差錯(cuò)。
Brooks的美國(guó)專利No.5,753,517公開(kāi)了使用定量免疫測(cè)定來(lái)測(cè)量液體樣品中感興趣分析物的數(shù)量的方法，以及用于該測(cè)定方法的設(shè)備。該測(cè)定采用了“快速抗原測(cè)量平臺(tái)”(rapid antigen measurement platform，RAMP)設(shè)備。該設(shè)備包括一膜片，該膜片是用諸如硝酸纖維素和玻璃纖維之類的材料制成的，有足夠的孔隙度且能夠被含分析物的液體所潤(rùn)濕，而且允許顆粒通過(guò)毛細(xì)作用移動(dòng)。
所公開(kāi)的膜片具有加樣點(diǎn)、接觸區(qū)和檢測(cè)區(qū)；接觸區(qū)位于加樣點(diǎn)和檢測(cè)區(qū)之間。包埋在接觸區(qū)的是許多顆粒，例如膠體金顆粒、有機(jī)分子、脂質(zhì)體或有機(jī)聚合物乳膠顆粒。顆粒上涂有針對(duì)感興趣分析物的抗體。顆?？捎帽壬珮?biāo)記物、熒光標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物或其他合適標(biāo)記物標(biāo)記以便于檢測(cè)。檢測(cè)劑被固定在檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)劑可以是針對(duì)感興趣分析物的抗體、或是感興趣的分析物本身。該裝置還可包括一個(gè)或多個(gè)下列特征位于加樣點(diǎn)之上并覆蓋住加樣點(diǎn)的加樣墊片；位于接觸區(qū)之上并覆蓋住接觸區(qū)的接觸墊片，接觸墊片中可包埋有涂著抗體的顆粒。如果有接觸墊片，則如公開(kāi)的那樣存在一隔離墊片，并且該隔離墊片位于膜上且位于接觸區(qū)和接觸墊片之間。還公開(kāi)了毛細(xì)墊片，它位于膜上且靠近接觸區(qū)，使得接觸區(qū)位于毛細(xì)墊片和接觸區(qū)之間；還公開(kāi)了內(nèi)部對(duì)照，它包括包埋在接觸區(qū)的內(nèi)部對(duì)照顆粒、對(duì)照檢測(cè)劑和對(duì)照反應(yīng)區(qū)。
該設(shè)備包括了內(nèi)部對(duì)照，以便如公開(kāi)地那樣補(bǔ)償各次測(cè)試之間在膜性能方面的差異。該內(nèi)部對(duì)照包括內(nèi)部對(duì)照顆粒、對(duì)照檢測(cè)劑和對(duì)照反應(yīng)區(qū)。所公開(kāi)的內(nèi)部對(duì)照顆粒與涂有抗體的顆粒被一起包埋在接觸區(qū)。
這種“內(nèi)部對(duì)照顆?！迸c涂有抗體的顆粒相類似。如公開(kāi)的那樣，它們涂有相同表面濃度的抗體，不同點(diǎn)在于內(nèi)部對(duì)照顆粒上的抗體是針對(duì)對(duì)照檢測(cè)劑的，而該對(duì)照檢測(cè)劑不與針對(duì)分析物的抗體反應(yīng)。所公開(kāi)的“對(duì)照檢測(cè)劑”是一種不與待測(cè)量的分析物、位于涂有抗體的顆粒上的抗體反應(yīng)，也不與檢測(cè)劑反應(yīng)的試劑。對(duì)照檢測(cè)劑被涂在膜上的“對(duì)照反應(yīng)區(qū)”。如所公開(kāi)的那樣，對(duì)照反應(yīng)區(qū)指膜片上固定有對(duì)照檢測(cè)劑的位點(diǎn)。然而，因?yàn)閷?duì)照和分析物檢測(cè)劑在本質(zhì)上是獨(dú)立的，因此對(duì)照移動(dòng)通過(guò)測(cè)量基質(zhì)并不能證明模擬了分析物檢測(cè)劑的移動(dòng)。因此，通過(guò)測(cè)量各測(cè)量裝置中對(duì)照和分析物檢測(cè)劑的相對(duì)反應(yīng)，會(huì)發(fā)現(xiàn)這些對(duì)照劑在所設(shè)計(jì)的補(bǔ)償測(cè)試間差異的方法中起的作用很差。
因此，需要有針對(duì)上述問(wèn)題的側(cè)流免疫測(cè)定和使用這些測(cè)定的方法。
在一方面，本發(fā)明涉及一種進(jìn)行側(cè)流分析(或側(cè)流測(cè)定)的方法，它包括讓感興趣的分析物與第一分析物結(jié)合劑接觸，其中第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑被偶聯(lián)于檢測(cè)劑。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種在包括測(cè)試片的側(cè)流分析中提高測(cè)試平均陽(yáng)性結(jié)果和測(cè)試平均陰性結(jié)果之間差異的方法，它包括在空間上重新排列測(cè)試片上一個(gè)或多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)相對(duì)于分析物結(jié)合區(qū)的位置。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種在包括測(cè)試片的側(cè)流分析中降低側(cè)流分析的變差系數(shù)的方法，它包括在空間上重新排列測(cè)試片上一個(gè)或多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)相對(duì)于分析物結(jié)合區(qū)的位置。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種在側(cè)流分析中提高側(cè)流分析重復(fù)性的方法，它包括定量位于第一對(duì)照區(qū)中的第一數(shù)量的檢測(cè)劑；定量位于第二對(duì)照區(qū)中的第二數(shù)量的檢測(cè)劑；將定量的第一和第二數(shù)量的檢測(cè)劑映射到相對(duì)標(biāo)尺上，得到檢測(cè)劑的第一相對(duì)數(shù)量和第二相對(duì)數(shù)量；以及所進(jìn)行的映射使得定量的第一數(shù)量檢測(cè)劑與第二數(shù)量檢測(cè)劑之比大于第一相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑與第二相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑之比。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種包括測(cè)試片的側(cè)流分析，該測(cè)試片包括偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑。


圖1是本發(fā)明一種側(cè)流測(cè)試片的剖面圖。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分析物”指待定量測(cè)定的分子或化合物。分析物的例子包括蛋白質(zhì)，如激素或其他分泌蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細(xì)胞壁組份；或其他具有表位的化合物。感興趣的分析物宜具有免疫原性部分，這意味著可產(chǎn)生針對(duì)感興趣分析物該部分的抗體(如下所述)。
為了進(jìn)行本發(fā)明的側(cè)流分析，可使用側(cè)流測(cè)試片。圖1描述了本發(fā)明的一種測(cè)試片例子。測(cè)試片100包括背襯片102、膜片104、隔離墊片106、偶聯(lián)物墊片108、測(cè)試區(qū)110、低對(duì)照區(qū)112、高對(duì)照區(qū)114、吸收墊片116和保護(hù)性蓋片118。測(cè)試片100具有遠(yuǎn)端和近端。合適的測(cè)試片式樣的例子包括可從ScrippsLaboratories獲得的Scripps Laboratories牌側(cè)流免疫測(cè)定開(kāi)發(fā)系統(tǒng)。
安裝在背襯片102中央的是膜片104。位于膜片104遠(yuǎn)端且與膜片104有少許重疊的是偶聯(lián)物墊片108。在背襯片102上位于偶聯(lián)物墊片108遠(yuǎn)端且與偶聯(lián)物墊片108幾乎完全重疊的是隔離墊片106。吸收墊片116也位于背襯片102上，吸收墊片116與膜片104接觸且位于膜片104的近端。保護(hù)性蓋片118復(fù)合于隔離墊片106、膜片104和吸收墊片116，且與背襯片102相對(duì)。
背襯片102可以由穩(wěn)定的、無(wú)孔的材料制成，其強(qiáng)度應(yīng)足以支承材料和粘于其的測(cè)試片。通常，背襯片102基本上不透水。在一個(gè)優(yōu)選例中，背襯片102是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的。
測(cè)試片100還含有吸收墊片116。吸收墊片包含吸收材料，它可吸收因毛細(xì)管作用而輸送至膜片104末端的溶液。適用作為吸收墊片的材料例子包括纖維素和玻璃纖維。
保護(hù)性蓋片118復(fù)合于膜片104且與背襯片102相對(duì)。保護(hù)性蓋片118保護(hù)或覆蓋著膜片104、偶聯(lián)物墊片108、吸收墊片116和非必要的隔離墊片106。保護(hù)性蓋片118可用總體不透水的材料制成，而且較佳地是半透明或透明的。保護(hù)性蓋片可以是單層或多層。用作保護(hù)性蓋片118的優(yōu)選材料包括透光材料，例如聚酰胺、聚酯、聚乙烯、丙烯酸類材料、玻璃或類似的材料。保護(hù)性蓋片118可以是透明或不透明的，這取決于所用的檢測(cè)方法。在一個(gè)優(yōu)選例中，保護(hù)性蓋片是透光透明的聚酯。
膜片可以用具有如下特性的材料制成有足夠孔隙度從而允許在材料表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細(xì)管作用；允許涂有抗體或抗原的顆粒通過(guò)毛細(xì)管作用而移動(dòng)(即宜不阻礙顆粒)；可被含分析物的液體所潤(rùn)濕(例如，對(duì)于水性液體具有親水性，對(duì)于有機(jī)溶劑具有疏水性)。通過(guò)例如在美國(guó)專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變膜的疏水性從而使膜具有親水性以便用于水性液體。膜材料的例子包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個(gè)優(yōu)選例中，膜片是用硝酸纖維素制成的。
隔離墊片106可以由吸收材料制成，它能夠在將液體樣品加至隔離墊片106時(shí)，將液體樣品輸送至偶聯(lián)物墊片108。優(yōu)選的材料包括(但并不限于)纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。
偶聯(lián)物墊片108與隔離墊片106相復(fù)合。偶聯(lián)物墊片108可以用吸收材料制成。代表性的材料包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。
偶聯(lián)物墊片含有一群結(jié)合于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑。在另一例子中，這群試劑也可排他地或非排他地位于測(cè)試片上。分析物非特異性試劑被定義為對(duì)感興趣分析物不特異的試劑。第一分析物結(jié)合劑是可特異性地結(jié)合于感興趣分析物的試劑。在測(cè)試片上可以存在一群以上的結(jié)合于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑。這些群體可以在組成、位置或其他特性方面相同或不同。
在一個(gè)優(yōu)選例中，第一分析物結(jié)合劑是針對(duì)感興趣分析物的抗體。在另一優(yōu)選例中，如果感興趣分析物是具有已知特異性的抗體，那么該群體可以含有該分析物(抗體)所針對(duì)的抗原?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”也指足以結(jié)合于感興趣分析物的抗體片段。
或者，在優(yōu)選例中還可使用各種可特異性地結(jié)合于感興趣分析物的分子，例如工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結(jié)合位點(diǎn))的異源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 137-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends in Biotechnology 1452-60(1996)。在另一優(yōu)選例中，如果感興趣分析物是配體，那么可使用結(jié)合于該配體的受體，反之亦然。
第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑被偶聯(lián)于檢測(cè)劑。檢測(cè)劑包括各種不同物質(zhì)，只要它便于檢測(cè)與檢測(cè)劑相結(jié)合的第一分析物結(jié)合劑。合適的檢測(cè)劑包括顆粒、發(fā)光標(biāo)記物；比色標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物；化學(xué)標(biāo)記物；酶；放射性標(biāo)記物；或射頻標(biāo)記物；金屬膠體；和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
在一優(yōu)選例中，至少一種第一分析物結(jié)合劑和至少一種分析物非特異性試劑被偶聯(lián)于一種單一檢測(cè)劑。這種例子包括與至少一種第一分析物結(jié)合劑和至少一種分析物非特異性試劑偶聯(lián)的一群?jiǎn)我坏臋z測(cè)劑分子。如下所述，這種例子可降低非特異性結(jié)合并且能夠修正某些類型的測(cè)試差異。
如果使用不同種類的偶聯(lián)于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑，那么可以使用不同的檢測(cè)劑。例如需要在同一測(cè)試片上分析兩種不同的有關(guān)分析物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生這種情況。使用兩種不同檢測(cè)劑有利于檢測(cè)兩種不同的有關(guān)分析物。例如，當(dāng)檢測(cè)劑是熒光劑時(shí)，可以選擇檢測(cè)劑使其在不同的波長(zhǎng)下發(fā)熒光。
在一個(gè)優(yōu)選例中，可檢測(cè)標(biāo)記物是顆粒?？捎糜诒景l(fā)明的顆粒例子包括(但并不限于)膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；鹵化銀顆粒；二氧化硅顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；涂有有機(jī)或無(wú)機(jī)層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質(zhì)或肽分子；脂質(zhì)體；或有機(jī)聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。優(yōu)選的顆粒是膠體金顆粒。顆粒大小與膜片的孔隙度有關(guān)顆粒宜足夠小，從而能因液體的毛細(xì)管作用而在膜中被運(yùn)輸。
膠體金顆?？捎萌魏纬Ｒ?guī)方法制造，例如總結(jié)于G.Frens，1973，NaturePhysical Science，24120(1973)中的方法。其他方法描述于美國(guó)專利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
顆粒大小的選擇會(huì)影響一些因素，例如總?cè)苣z試劑及其偶聯(lián)物物的穩(wěn)定性、偶聯(lián)物墊片108釋放顆粒的效率和充分性、反應(yīng)的速度和充分性。此外，顆粒表面積會(huì)影響結(jié)合分子之間的空間位阻。
顆?？梢员粯?biāo)記，以協(xié)助檢測(cè)。標(biāo)記物的例子包括(但并不限于)發(fā)光標(biāo)記物；比色標(biāo)記物如染料；熒光標(biāo)記物；或化學(xué)標(biāo)記物，如電活性劑(electroactiveagents)(如亞鐵氰化物)；酶；放射性標(biāo)記物；或射頻標(biāo)記物。
存在于測(cè)試片上的顆粒數(shù)目可以改變，這取決于顆粒的大小和組成、測(cè)試片和膜片的構(gòu)成成分、以及分析測(cè)試的靈敏度水平。顆粒數(shù)目的范圍通常約為1×109-1×1013個(gè)顆粒，盡管也可使用低于1×109個(gè)顆粒。在一個(gè)優(yōu)選例中，顆粒數(shù)目約為1×1011個(gè)顆粒。
還偶聯(lián)于檢測(cè)劑的是分析物非特異性試劑?？筛鶕?jù)結(jié)合于除感興趣分析物之外的其他物質(zhì)的穩(wěn)定性，來(lái)選擇分析物非特異性試劑。例如，如果感興趣分析物是抗H.Pylori的抗體，那么分析物非特異性試劑可以是針對(duì)在抗H.Pylori抗體中沒(méi)有或罕有的抗原的抗體。這種結(jié)合對(duì)于除感興趣分析物之外的物質(zhì)而言可以是特異性的，也可以是非特異性的。
在一個(gè)優(yōu)選例中，分析物非特異性試劑可以是抗體，較佳地是兔IgG?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”也指足以結(jié)合于感興趣分析物的抗體片段?；蛘撸^佳地也可使用具有針對(duì)感興趣分析物的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的諸如工程化蛋白之類的分子。在另一例子中，可使用受體，該受體會(huì)特異結(jié)合于除感興趣分析物之外的配體；反之亦然。此外，分析物非特異性試劑可以是抗原、其他有機(jī)分子或半抗原，它們被偶聯(lián)于對(duì)感興趣分析物非特異的蛋白之上。其他有關(guān)合適的分析物非特異性試劑的描述，可在美國(guó)專利No.5,096,837中找到，并且包括IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
在一個(gè)優(yōu)選例中，分析物非特異性試劑包括對(duì)照結(jié)合劑。選擇對(duì)照結(jié)合劑，使其能特異地結(jié)合于除了特異結(jié)合于感興趣分析物的分子之外的其他分子。如下所述，在這種方式下，對(duì)照結(jié)合劑可結(jié)合于對(duì)照區(qū)?？捎米鲗?duì)照結(jié)合劑的物質(zhì)包括上述可用作第一分析物結(jié)合劑的物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選例中，對(duì)照結(jié)合劑包括兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)抗體。對(duì)照結(jié)合劑的其他有利特性包括(但并不限于)整體穩(wěn)定性、對(duì)有關(guān)分析物的非特異性、測(cè)試的重現(xiàn)性和可預(yù)測(cè)性、分子大小、與對(duì)照劑結(jié)合的親和力。
第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑與檢測(cè)劑的結(jié)合可以是共價(jià)的或非共價(jià)的(例如離子、氫鍵、范德瓦耳斯力等)。常規(guī)的偶合化學(xué)和技術(shù)可適用于本發(fā)明。此外，每一個(gè)第一分析物結(jié)合劑、檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑都可相互偶聯(lián)，通過(guò)另一者而偶聯(lián)，或通過(guò)接頭、載體或間隔基團(tuán)而偶聯(lián)。
例如，如果顆粒被用作檢測(cè)劑，那么第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑都可通過(guò)非特異吸附而結(jié)合于檢測(cè)劑?；蛘?，可用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)將第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑共價(jià)連于顆粒。或者，可以使用非共價(jià)的結(jié)合系統(tǒng)，例如生物素-親和素或甚至對(duì)第一分析物結(jié)合劑特異的第二抗體，來(lái)將檢測(cè)劑(如熒光標(biāo)記物)偶聯(lián)于第一分析物結(jié)合劑，而分析物非特異性試劑可直接偶聯(lián)于第一分析物結(jié)合劑。在另一例子中，還可用雙官能或多官能試劑將第一分析物結(jié)合劑、檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑偶聯(lián)在一起。偶聯(lián)于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑的數(shù)目可隨具體例子而變化。例如，可將兩份第一分析物結(jié)合劑偶聯(lián)于一份檢測(cè)劑和一份分析物非特異性試劑。或者，將兩種分析物非特異性試劑偶聯(lián)于一份檢測(cè)劑和一份第一分析物結(jié)合劑。這些配置的其他變化形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言毫無(wú)疑問(wèn)是可行的，因此被包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
位于測(cè)試片100上的是多個(gè)檢測(cè)區(qū)120。每個(gè)檢測(cè)區(qū)的位置使得自動(dòng)的或半自動(dòng)的分析儀器，或者觀察者，能夠測(cè)定側(cè)流分析的確定結(jié)果。檢測(cè)區(qū)包括對(duì)測(cè)量分析的確定結(jié)果進(jìn)行測(cè)量的測(cè)量區(qū)。檢測(cè)區(qū)可包括一個(gè)或多個(gè)分析物結(jié)合區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)。
分析物結(jié)合區(qū)是膜片上含有第二(種)分析物結(jié)合劑的區(qū)域。一種或多種上述的適用于第一分析物結(jié)合劑的物質(zhì)，可用作分析物結(jié)合區(qū)中的第二分析物結(jié)合劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，第一分析物結(jié)合劑是可被感興趣分析物(它是抗體)所識(shí)別的抗原。第二分析物結(jié)合劑也可是抗原或甚至對(duì)感興趣分析物(抗體)特異的第二種抗體。在另一優(yōu)選例中，感興趣分析物是抗原。第二分析物結(jié)合劑是抗體，與第一分析物結(jié)合劑(當(dāng)?shù)谝环治鑫锝Y(jié)合劑也是抗體時(shí))相比，第二分析物結(jié)合劑針對(duì)分析物上不同的表位。或者，當(dāng)分析物具有多拷貝的相同表位時(shí)，第二分析物結(jié)合劑可以與第一分析物結(jié)合劑一樣針對(duì)相同的表位。
在某些例子中，讓一個(gè)或多個(gè)測(cè)量區(qū)也含有至少一個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)，對(duì)照結(jié)合區(qū)包含至少一種對(duì)照劑。對(duì)照劑會(huì)特異地結(jié)合于對(duì)照結(jié)合劑，形成對(duì)照結(jié)合配對(duì)。
對(duì)照結(jié)合配對(duì)的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是，它們是內(nèi)部對(duì)照--即與分析物測(cè)量結(jié)果作比較的對(duì)照位于各測(cè)試片上。因此，本發(fā)明的對(duì)照可用于修正測(cè)試片-測(cè)試片之間的差異。用基于例如對(duì)測(cè)試片的統(tǒng)計(jì)采樣而得出的外部對(duì)照來(lái)進(jìn)行這種修正是不切實(shí)際的。此外，通過(guò)使用本發(fā)明的對(duì)照結(jié)合劑和對(duì)照劑，可以減小不同測(cè)試片在各個(gè)批次和各次使用之間的差異。此外，如下所述，還可減低非特異性結(jié)合的影響。在使用外部的非測(cè)試片對(duì)照時(shí)，所有這些修正都是難以實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的測(cè)量裝置可在測(cè)試片上具有一個(gè)以上的對(duì)照結(jié)合區(qū)。在這種情況下，對(duì)照結(jié)合區(qū)可被用于產(chǎn)生一標(biāo)準(zhǔn)曲線，而大量不同的分析物測(cè)量結(jié)果就可與該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。因此，具有一個(gè)以上內(nèi)部對(duì)照，可使側(cè)流分析比常規(guī)側(cè)流分析具有更廣的動(dòng)態(tài)量程。在優(yōu)選例中，如下所述，將具有多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)的測(cè)試片與相對(duì)比例法結(jié)合使用，從而可以將檢測(cè)到的對(duì)照結(jié)合配對(duì)的數(shù)量映射到同一標(biāo)尺，并根據(jù)該標(biāo)尺得出分析物的數(shù)量。
在一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明測(cè)試片有至少一個(gè)高對(duì)照結(jié)合區(qū)和至少一個(gè)低對(duì)照結(jié)合區(qū)。兩個(gè)區(qū)之間的差異通常為一種濃度。在高對(duì)照結(jié)合區(qū)中的對(duì)照劑濃度大于在低對(duì)照結(jié)合區(qū)中的對(duì)照劑濃度。因此，在高對(duì)照區(qū)中的對(duì)照結(jié)合配對(duì)的數(shù)量高于低對(duì)照區(qū)。在給定對(duì)照區(qū)中的對(duì)照結(jié)合配對(duì)物數(shù)量被映射到同一測(cè)量標(biāo)尺上(并可根據(jù)該標(biāo)尺得出分析物的數(shù)量)的例子中，可以通過(guò)高和低對(duì)照結(jié)合區(qū)中結(jié)合配對(duì)物的數(shù)值而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在其他例子中，可存在2個(gè)以上對(duì)照結(jié)合區(qū)。這樣所產(chǎn)生的曲線能更好地反映測(cè)試中在檢測(cè)的分析物數(shù)量和被映射數(shù)量的測(cè)量值之間的非線性現(xiàn)象(如下所述)。盡管這些非線性現(xiàn)象原本會(huì)影響假定較為線性關(guān)系的測(cè)試，但是通過(guò)使用多個(gè)對(duì)照區(qū)可對(duì)其進(jìn)行校正。
在另一實(shí)施例中，一個(gè)單個(gè)對(duì)照區(qū)可含有一種以上的對(duì)照劑。這在有一群組以上偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑的情況下是有用的。例如，當(dāng)需要在同一測(cè)試片上分析兩種或多種感興趣的分析物時(shí)，可以制備兩群偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑。對(duì)于每群可使用不同的檢測(cè)劑，從而可以區(qū)分感興趣的兩種不同分析物的測(cè)量結(jié)果。在這種情況下，可能需要使用包含不同對(duì)照劑或?qū)φ战Y(jié)合配對(duì)的對(duì)照結(jié)合區(qū)。
適用于對(duì)照劑的物質(zhì)包括上述適合作為對(duì)照結(jié)合劑的物質(zhì)，不同點(diǎn)是對(duì)照劑會(huì)特異地結(jié)合于對(duì)照結(jié)合劑。例如，在一個(gè)優(yōu)選例中，對(duì)照結(jié)合劑是兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)IgG，而對(duì)照劑是偶聯(lián)于BSA(牛血清白蛋白)的二硝基苯酚。
對(duì)照結(jié)合區(qū)可位于包含它的測(cè)量區(qū)的各種不同位置，而含有對(duì)照結(jié)合區(qū)的測(cè)量區(qū)可位于測(cè)試片上的各種不同位置。在不同的測(cè)試中，相對(duì)于分析物結(jié)合區(qū)和第一分析物結(jié)合劑、分析物非特異性試劑和檢測(cè)劑群體的貯藏所，來(lái)重新排列對(duì)照結(jié)合區(qū)的位置是有利的。例如，當(dāng)含有該群體的貯藏所位于偶聯(lián)物墊片時(shí)，在某些例子中需要將分析物結(jié)合區(qū)位于偶聯(lián)物墊片和對(duì)照結(jié)合區(qū)之間。在另一些例子中，需要將對(duì)照結(jié)合區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)和偶聯(lián)物墊片之間。
此外，對(duì)照結(jié)合區(qū)和分析物結(jié)合區(qū)在測(cè)試片上相對(duì)液體流動(dòng)方向的放置次序，會(huì)影響分析物結(jié)合劑結(jié)合于檢測(cè)區(qū)以及對(duì)照結(jié)合劑結(jié)合于對(duì)照檢測(cè)區(qū)的絕對(duì)量。這種效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致對(duì)照與分析物檢測(cè)測(cè)量值之比的增大或減小，尤其在測(cè)試非常強(qiáng)的陽(yáng)性樣品時(shí)。這種改變對(duì)測(cè)試截止值有影響，如果使用截止值的話；對(duì)于截止處的測(cè)試精度有影響；或者對(duì)總體的測(cè)試動(dòng)態(tài)量程和重復(fù)性有影響。
在操作中，先獲得含有感興趣分析物的液體樣品，再開(kāi)始進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)量分析。樣品可包括具有如下特性的任何液體能濕潤(rùn)膜片104，支持抗體/抗原反應(yīng)(即不干擾抗體/抗原的相互作用)，并且其粘度足以讓樣品移動(dòng)通過(guò)測(cè)試片。在一個(gè)優(yōu)選例中，樣品是水溶液(例如體液)。
在本發(fā)明測(cè)試法的第一個(gè)例子中，隔離墊片106與含感興趣分析物的液體樣品接觸。在隔離墊片106與含感興趣分析物的液體樣品接觸之后，測(cè)試片100被維持在允許液體通過(guò)毛細(xì)管作用將感興趣分析物輸送至偶聯(lián)物墊片108的條件下。
當(dāng)感興趣分析物被輸送至偶聯(lián)物墊片108時(shí)，存在于液體中的感興趣分析物就與偶聯(lián)物墊片108中所含的、偶聯(lián)于檢測(cè)劑上的第一分析物結(jié)合劑接觸。此時(shí)，還發(fā)生了液體中所含物質(zhì)與偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物非特異性試劑之間的接觸。因?yàn)檫@些接觸，同時(shí)導(dǎo)致了特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合，從而形成各種復(fù)合物。優(yōu)選地，所有或幾乎所有的特異性結(jié)合發(fā)生在感興趣分析物和第一分析物結(jié)合劑之間。
液體樣品的液體毛細(xì)管作用，使得結(jié)合或未結(jié)合的第一分析物結(jié)合劑(它偶聯(lián)于檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑)移動(dòng)，側(cè)向地移動(dòng)至膜片104。此外，含有非特異結(jié)合的檢測(cè)劑的復(fù)合物會(huì)形成并增大，尤其是在樣品中存在與其他組份發(fā)生非特異結(jié)合的各種物質(zhì)時(shí)。毛細(xì)管作用也會(huì)移動(dòng)這些復(fù)合物，即使它們非常大。
在移動(dòng)中，保護(hù)性蓋片118可減少了液體通過(guò)蒸發(fā)而導(dǎo)致的液體損失以及所導(dǎo)致的蒸發(fā)性冷卻，這提高了一致性和重復(fù)性，盡管這對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施并不是必需的。保留合適的液體體積，對(duì)于液體在測(cè)試片100上的充分流動(dòng)是至關(guān)重要的。防止蒸發(fā)性冷卻對(duì)于測(cè)試反應(yīng)的速度和充分性是有用的。此外，保護(hù)性蓋片118起到使傳染性物質(zhì)被保留在測(cè)試片100的作用。
第一分析物結(jié)合劑和其他復(fù)合物的移動(dòng)，會(huì)在達(dá)到檢測(cè)區(qū)中的測(cè)量區(qū)時(shí)停止，如果測(cè)量區(qū)包含對(duì)感興趣分析物或?qū)φ战Y(jié)合劑特異的第二分析物結(jié)合劑，那么第一分析物結(jié)合劑和/或?qū)φ战Y(jié)合劑，以及任何直接或間接與它們復(fù)合的物質(zhì)，會(huì)被固定在測(cè)量區(qū)。
一旦第一分析物結(jié)合劑和/或?qū)φ战Y(jié)合劑，以及任何直接或間接與它們復(fù)合的物質(zhì)，被固定在測(cè)量區(qū)，那么就可用檢測(cè)劑來(lái)檢測(cè)它們的存在。停滯于測(cè)量區(qū)的檢測(cè)劑數(shù)量可用常規(guī)技術(shù)加以定量。例如，光學(xué)方法，如測(cè)量光散射、單反射、光度計(jì)或光電倍增管；放射性(用蓋革計(jì)數(shù)器等進(jìn)行測(cè)量)；導(dǎo)電性或電介質(zhì)(電容)；電化學(xué)法檢測(cè)所釋放的電活性物質(zhì)，如銦、鉍、鎵、碲離子[如用Hayes等人(Analytical Chem.661860-1865(1994)所述的方法]，或亞鐵氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67482-491(1995)所提出的方法。其中通過(guò)在檢測(cè)區(qū)滴加洗滌劑，使包裹在脂質(zhì)體中的亞鐵氰化物被釋放出，然后用電化學(xué)法檢測(cè)釋放的亞鐵氰化物]。其他常規(guī)方法只要合適，也可使用。
一旦檢測(cè)劑數(shù)量被定量，那么這些數(shù)量就可被映射到另一測(cè)量標(biāo)尺上。例如，盡管本發(fā)明測(cè)試的結(jié)果是以(光)反射密度(density of reflectance，Dr)形式測(cè)量的，但是以其他單位來(lái)表示測(cè)量結(jié)果可能更有意義，例如用RI(相對(duì)于對(duì)照區(qū)的相對(duì)強(qiáng)度)。結(jié)果還可表示為測(cè)量體積中存在的分析物拷貝數(shù)。將檢測(cè)的分析物數(shù)量映射到其他測(cè)量標(biāo)尺上，是一種報(bào)告本發(fā)明測(cè)試結(jié)果的優(yōu)選例子。
例如，測(cè)試結(jié)果可被映射到相對(duì)標(biāo)尺上。對(duì)于內(nèi)部對(duì)照，使用相對(duì)標(biāo)尺(例如相對(duì)強(qiáng)度(RI))，可以將反射密度(Dr)值轉(zhuǎn)化為RI值。在一個(gè)優(yōu)選例中，低對(duì)照的RI值被定為1而高對(duì)照的RI值被定為3，盡管這些對(duì)照的Dr絕對(duì)值之比并不如此。在一個(gè)優(yōu)選例中，Dr絕對(duì)值之比至少約為5∶1，而RI之比約為3∶1。
通過(guò)這樣做法，在各測(cè)試片中影響測(cè)量Dr絕對(duì)值的變化因素，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線在Y軸上下波動(dòng)，但是對(duì)于沿X軸繪制的RI值的影響卻較小。這會(huì)全面地減小報(bào)告數(shù)據(jù)的可變幅度，即會(huì)表現(xiàn)為“負(fù)增益”。
例如，如果在分析物的測(cè)量數(shù)量和分析物的報(bào)告數(shù)量之間存在負(fù)增益，那么在分析物測(cè)量數(shù)量上的大變化會(huì)轉(zhuǎn)化為分析物報(bào)告數(shù)量上的較小變化。盡管分析物測(cè)量數(shù)量的內(nèi)在差異沒(méi)有改變，但這種方法在某些情況下是有用的。負(fù)增益效應(yīng)減小了某些測(cè)試差異度，并且與簡(jiǎn)單地報(bào)告Dr測(cè)量值相比，可用于提高測(cè)試報(bào)告結(jié)果的重復(fù)性。
除了在連續(xù)標(biāo)尺上報(bào)告測(cè)試結(jié)果(直接地報(bào)告所檢測(cè)分析物的數(shù)量，或者將檢測(cè)的分析物數(shù)量映射到標(biāo)尺再間接地報(bào)告測(cè)量標(biāo)度)之外，本發(fā)明測(cè)試方法還可用于“截止”式分析。如果檢測(cè)劑在分析物結(jié)合區(qū)被檢測(cè)，那么可將測(cè)得的檢測(cè)劑數(shù)量與截止值相比較。截止值是高于該數(shù)值時(shí)測(cè)試就被認(rèn)為陽(yáng)性的數(shù)值；即，感興趣分析物在液體樣品中的存在達(dá)到了某種統(tǒng)計(jì)置信度。低于截止值時(shí)，測(cè)試通常被認(rèn)為非陽(yáng)性--或者感興趣分析物并不存在，或者本發(fā)明側(cè)流分析不能檢測(cè)到它的存在。盡管可根據(jù)直接測(cè)量值(如測(cè)得的分析物數(shù)量)來(lái)建立截止關(guān)系，但是如果數(shù)據(jù)以間接或相對(duì)標(biāo)度來(lái)表示那將更有意義。
陰性值和陽(yáng)性值之間的區(qū)別越大，截止式側(cè)流分析越有利。陰性值是當(dāng)有關(guān)分析物在統(tǒng)計(jì)意義上不存在時(shí)在連續(xù)標(biāo)尺上的報(bào)告值。與之相反，陽(yáng)性值是當(dāng)有關(guān)分析物在統(tǒng)計(jì)意義上存在時(shí)在連續(xù)標(biāo)尺上的報(bào)告值。當(dāng)這些數(shù)值收斂時(shí)，能夠在統(tǒng)計(jì)上區(qū)分陽(yáng)性和陰性的可能性就下降。
在截止處的準(zhǔn)確度上升的截止式側(cè)流也是有利的。當(dāng)在選定的截止處的變異度較小時(shí)，陽(yáng)性被準(zhǔn)確地定為陽(yáng)性以及陰性被準(zhǔn)確地定為陰性的可能性就增加。
測(cè)試結(jié)果可以被變換成上述的“相對(duì)”標(biāo)度或“絕對(duì)”標(biāo)度。絕對(duì)標(biāo)度是以實(shí)際物理單位測(cè)量的，例如分析物的拷貝數(shù)/每毫升液體。用絕對(duì)標(biāo)度表示的測(cè)量值，在測(cè)試某些疾病或病癥是有優(yōu)選的，例如測(cè)試癌癥指標(biāo)時(shí)。在這些優(yōu)選例中，結(jié)果可用例如ng/ml之類的單位表示。因此，對(duì)照區(qū)具有指定濃度值的對(duì)照劑。作為相對(duì)測(cè)量概念的延伸，可以測(cè)量一系列已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)物的反射強(qiáng)度(density of reflectance，DR)值，并如上所述計(jì)算相對(duì)于對(duì)照的強(qiáng)度(相對(duì)強(qiáng)度值)。然后，可將RI值對(duì)分析物濃度進(jìn)行作圖，以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在該曲線中各RI值對(duì)應(yīng)于有關(guān)分析物的某個(gè)濃度值。然后，樣品的RI可在這一數(shù)值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上解讀，得出用所需單位表示的結(jié)果。
本發(fā)明的偶聯(lián)于檢測(cè)劑的單群分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑，提供了優(yōu)于雙群式(two population)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。一種雙群式測(cè)定包括一群偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑和另一群偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物非特異性試劑。如下面實(shí)施例所示，可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行單群式測(cè)定，它優(yōu)于類似的雙群式測(cè)定。這些優(yōu)點(diǎn)包括測(cè)試方法可使陰性和陽(yáng)性樣品組的測(cè)量值分得更開(kāi)，并且截止準(zhǔn)確度也更高。
許多環(huán)境因素會(huì)影響側(cè)流分析的絕對(duì)反應(yīng)性，其中包括(但并不限于)制造方面的變數(shù)、操作者所引入的變數(shù)、環(huán)境所引入的變數(shù)和樣品效應(yīng)。使用常規(guī)的側(cè)流分析時(shí)，任何這些因素會(huì)抑制或可能提高一個(gè)測(cè)試片相對(duì)另一測(cè)試片的反應(yīng)性，從而導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)于這些或其他變數(shù)沒(méi)有對(duì)照，會(huì)導(dǎo)致很不準(zhǔn)確、無(wú)重復(fù)性、缺乏敏感度和缺乏測(cè)試特異性。
側(cè)流分析還會(huì)受到多種干擾，它們會(huì)影響分析物結(jié)合劑或分析物非特異性試劑與對(duì)照結(jié)合區(qū)或分析物結(jié)合區(qū)之間結(jié)合的絕對(duì)量。影響因素包括(1)從偶聯(lián)物墊片上釋放分析物結(jié)合劑或?qū)φ战Y(jié)合劑方面的差異，(2)裝置和裝置之間在分析物結(jié)合群與測(cè)試片的非特異結(jié)合方面的差異，(3)在測(cè)試過(guò)程中，因測(cè)試片或膜片材料的孔徑或分析物結(jié)合劑的非特異聚集而導(dǎo)致的分析物結(jié)合群通過(guò)或沿測(cè)試片移動(dòng)方面的差異。因此，由這些或其他因素而導(dǎo)致的結(jié)合絕對(duì)測(cè)量值的差異，會(huì)在常規(guī)側(cè)流分析中高得無(wú)法接受。
通過(guò)實(shí)施本發(fā)明，可以降低這些差異。使用單群偶聯(lián)于對(duì)照結(jié)合劑和檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑，可提供了優(yōu)于常規(guī)測(cè)定(其中具有一群含對(duì)照結(jié)合劑的群體和另一群獨(dú)立的含分析物結(jié)合劑的群體)的多種優(yōu)點(diǎn)。第一，與常規(guī)雙群式分析相比，已暴露于分析物非特異性試劑的側(cè)流分析基質(zhì)的任何部分，也更可能暴露于分析物結(jié)合劑。第二，與常規(guī)雙群式分析相比，任何阻礙或防止分析物非特異性試劑沿著或通過(guò)側(cè)流基質(zhì)運(yùn)動(dòng)的機(jī)制，也更可能阻礙或防止分析物結(jié)合劑的運(yùn)動(dòng)。第三，可以選擇分析物非特異性試劑以減少分析物結(jié)合劑的非特異結(jié)合量。
此外，還可通過(guò)修飾分析物檢測(cè)基質(zhì)的疏水性/親水性來(lái)降低非特異性結(jié)合。分析物檢測(cè)基質(zhì)顆粒的聚集“自締合”現(xiàn)象(這會(huì)阻礙基質(zhì)在測(cè)試片上的運(yùn)動(dòng))，也可通過(guò)選擇性質(zhì)合適的分析物非特異性試劑而加以減少。最終的好處在于，因?yàn)橹恍柚苽涓俚脑噭?，所以可降低制造成本?br> 如本文所述，在側(cè)流分析的實(shí)踐中多個(gè)對(duì)照區(qū)可提供許多潛在好處。額外的對(duì)照區(qū)可用于擴(kuò)展分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的動(dòng)態(tài)量程，而不論曲線是線性還是非線性的。多個(gè)對(duì)照區(qū)還可用于確定在給定測(cè)試中是否存在前帶或高劑量彎曲效應(yīng)(hookeffect)。如果存在這種效應(yīng)，那么可建議用戶稀釋樣品以便準(zhǔn)確地測(cè)定有關(guān)分析物的濃度。
本發(fā)明的側(cè)流分析可用于各種不同用途。例如，該分析可用于分析人類疾病，例如傳染性疾病、或任何其他涉及可識(shí)別表位的人類疾病(如癌癥、自身免疫疾病、心血管病癥和病理)。該分析還可用于獸醫(yī)、食品測(cè)試、農(nóng)業(yè)和精細(xì)化學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明的側(cè)流分析可用各種不同方法進(jìn)行，包括使用側(cè)流分析測(cè)試設(shè)備，例如在＿＿＿日提交的申請(qǐng)?zhí)枮镹o.＿＿＿(案卷號(hào)No.19669-702)，名稱為“側(cè)流分析方法及設(shè)備”的未審定專利申請(qǐng)中所述的設(shè)備，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。在一個(gè)優(yōu)選例中，側(cè)流分析測(cè)試設(shè)備包括可從BlackHawk BioSystems(San Ramon，CA)得到的ReLIATM測(cè)試設(shè)備。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，很明顯可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明的裝置和方法作各種改動(dòng)和修改。因此，本發(fā)明覆蓋了本發(fā)明的這些改動(dòng)形式，只要它們?cè)谒綑?quán)利要求或等價(jià)形式的范圍內(nèi)。此外，下列實(shí)施例是為了闡明要求保護(hù)的本發(fā)明，而不是用于限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1如下制備Helicobacter pylori(幽門(mén)螺旋菌)單群偶聯(lián)物用100mM碳酸鉀將600毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調(diào)至pH9.5。將溶液置于攪拌馬達(dá)上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP和Helicobacter pylori抽提物的混合物，每種試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將混合物(12毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質(zhì)與膠體金的吸附進(jìn)行10分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，加入12毫升0.2微米過(guò)濾處理過(guò)的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續(xù)在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯(lián)物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機(jī)的GSA離心頭中離心30分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，吸去上清液，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH9.0)(簡(jiǎn)稱為“硼酸鹽/PEG”)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約600毫升，并再次如上進(jìn)行離心。在離心結(jié)束時(shí)，上清液被吸去，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
再用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約600毫升，然后如上進(jìn)行最后一次離心。在離心結(jié)束時(shí)，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中，然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約15毫升。接著，偶聯(lián)物溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，并貯藏于4℃。
產(chǎn)量是15毫升原料，在520納米處的光密度為26.64。
實(shí)施例2如下制備HIV單群偶聯(lián)物用100mM碳酸鉀將300毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調(diào)至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達(dá)上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP和HIV包膜抗原env-131-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物的混合物，每種試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將混合物(4.5毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質(zhì)與膠體金的吸附進(jìn)行10分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，加入6毫升0.2微米過(guò)濾處理過(guò)的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續(xù)在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯(lián)物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機(jī)的GSA離心頭中離心60分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，吸去上清液，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約300毫升，并再次如上進(jìn)行離心。在離心結(jié)束時(shí)，上清液被吸去，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
再次用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約300毫升，并如上進(jìn)行最后一次離心。在離心結(jié)束時(shí)，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約10毫升。接著，偶聯(lián)物溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，并貯藏于4℃。
產(chǎn)量是9.5毫升原料，在520納米處的光密度為26.74。
實(shí)施例3如下制備對(duì)照偶聯(lián)物用100mM碳酸鉀將1200毫升41nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調(diào)至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達(dá)上的聚丙烯燒杯中。然后制備兔抗-DNP的溶液，試劑的含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(12毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質(zhì)與膠體金的吸附進(jìn)行10分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，加入24毫升0.2微米過(guò)濾處理過(guò)的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續(xù)在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯(lián)物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機(jī)的GSA離心頭中離心60分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，吸去上清液，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約1200毫升，并再次如上進(jìn)行離心。在離心結(jié)束時(shí)，上清液被吸去，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約1200毫升，并如上進(jìn)行最后一次離心。在離心結(jié)束時(shí)，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約42毫升。接著，偶聯(lián)物溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，并貯藏于4℃。
產(chǎn)量是42毫升原料，在520納米處的光密度為11.76。
實(shí)施例4如下制備Helicobacter pylori偶聯(lián)物用100mM碳酸鉀將140毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調(diào)至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達(dá)上的聚丙烯燒杯中。然后制備Helicobacter pylori抽提物(含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍)和非特異性兔IgG(含量為完全封阻氯化鈉誘導(dǎo)的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(2.8毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質(zhì)與膠體金的吸附進(jìn)行10分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，加入2.8毫升0.2微米過(guò)濾處理過(guò)的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續(xù)在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯(lián)物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機(jī)的GSA離心頭中離心30分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，吸去上清液，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約140毫升，并再次如上進(jìn)行離心。在離心結(jié)束時(shí)，上清液被吸去，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約140毫升，并如上進(jìn)行最后一次離心。在離心結(jié)束時(shí)，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約5毫升。接著，偶聯(lián)物溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，并貯藏于4℃。
產(chǎn)量是4.5毫升原料，在520納米處的光密度為28.4。
實(shí)施例5如下制備HIV檢測(cè)偶聯(lián)物用100mM碳酸鉀將400毫升16nm膠體金(Frens，G.，Nature(London)Phys.Sci.，24120(1973))調(diào)至pH 9.5。將溶液置于攪拌馬達(dá)上的聚丙烯燒杯中。然后制備HIV包膜抗原env-131-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(含量為完全封阻因氯化鈉引起的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍)和非特異性兔IgG(含量為完全封阻氯化鈉誘導(dǎo)的膠體金聚集反應(yīng)而所需含量的兩倍)的溶液(Geoghegan，W.D.等人，J.Histochem.Cytochem.251187(1977))。
在室溫下，將溶液(4.26毫升)攪拌加至膠體金，蛋白質(zhì)與膠體金的吸附進(jìn)行10分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，加入8毫升0.2微米過(guò)濾處理過(guò)的牛血清白蛋白的去離子水溶液，繼續(xù)在室溫下再攪拌30分鐘。然后，將膠體金偶聯(lián)物置于250毫升離心瓶中，在室溫和13000rpm(27000×g)下，在Sorvall RC-5C離心機(jī)的GSA離心頭中離心60分鐘。時(shí)間結(jié)束時(shí)，吸去上清液，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
然后用含0.1％PEG(MW 20,000)的10mM硼酸鈉(pH 9.0)(硼酸鹽/PEG)，將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約400毫升，并再次如上進(jìn)行離心。在離心結(jié)束時(shí)，上清液被吸去，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。
再次用硼酸鹽/PEG將膠體金偶聯(lián)物稀釋至約400毫升，并如上進(jìn)行最后一次離心。在離心結(jié)束時(shí)，通過(guò)回旋混合和超聲波處理將膠體金偶聯(lián)物分散在剩余液體中。然后用硼酸鹽/PEG稀釋至約15毫升。接著，偶聯(lián)物溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，并貯藏于4℃。
產(chǎn)量是12毫升原料，在520納米處的光密度為26.66。
實(shí)施例6根據(jù)如下程序制備測(cè)試片。對(duì)微孔STHF背襯硝酸纖維素片(2.5厘米×20厘米)進(jìn)行涂覆，即用Bio Dot XYZ3000分配平臺(tái)并且生物噴口(Biojet)的工作頻率為120Hz的情況下，以20.83nl/滴和0.5μl/cm將一個(gè)抗原條帶和兩個(gè)對(duì)照條帶按縱向涂于硝酸纖維素上。對(duì)照抗原是位于含0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的二硝基苯酚化的牛血清白蛋白(DNP-BSA)。對(duì)于各測(cè)試，高對(duì)照可合適地以150-500微克/毫升的范圍進(jìn)行涂覆，而低對(duì)照可合適地以15-100微克/毫升的范圍進(jìn)行涂覆。對(duì)于各測(cè)試，抗原可在含洗滌劑的磷酸鹽緩沖溶液中以0.5-4毫克/毫升的范圍進(jìn)行涂覆?？蓪⑦€原劑(如DTT和/或乙二胺四乙酸(EDTA))加至抗原溶液中，如果存在活性巰基的話。在實(shí)施例23中所用的測(cè)試片，HIV-env-131是以2毫克/毫升PBS(含2mM EDTA，10mM DTT，0.2％十二烷基磺酸鈉(SDS))的濃度進(jìn)行涂覆，高對(duì)照涂覆濃度是300微克/毫升，而低對(duì)照涂覆濃度是25微克/毫升。
然后，片材在強(qiáng)風(fēng)溫箱中于37℃干燥1小時(shí)，在含10mg/ml BSA、1％(w/v)PEG8000、3％(w/v)甘露醇、0.3％(w/v)明膠、0.01％(w/v)疊氮化鈉和0.05％(w/v)十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中封閉15分鐘。接著在強(qiáng)風(fēng)溫箱中于37℃再干燥1小時(shí)。涂覆的片材以干燥形式在室溫下貯藏于箔袋中。
Gelman 8980玻璃纖維墊片通過(guò)如下方式進(jìn)行預(yù)封閉將其浸入PBS溶液(含10mg/ml BSA、2mg/ml兔IgG、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)，然后在強(qiáng)風(fēng)溫箱中干燥1.5小時(shí)。預(yù)封閉的偶聯(lián)物墊片用根據(jù)實(shí)施例2制備的HIV OMNITM偶聯(lián)物，或根據(jù)實(shí)施例1制備的Helicobacer pylori OMNITM偶聯(lián)物進(jìn)行涂覆，它們是通過(guò)將等體積的偶聯(lián)物原液(OD 520約26)與PBS(含20mg/ml BSA、4mg/ml兔IgG、2％(w/v)Triton X-100、5％(w/v)蔗糖和0.6％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)混合而成。然后加入1/40體積的20×PBS，溶液經(jīng)0.2微米過(guò)濾處理，然后在室溫和27英寸汞柱的真空下脫氣1小時(shí)。用Bio Dot XYZ3000分配平臺(tái)并且單生物噴口的工作頻率為120Hz的情況下，以104.17nl/滴和2.5μl/cm的速度，將偶聯(lián)物的混合物按縱向涂于預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。偶聯(lián)物的涂覆圖案是每厘米4線，并且在每個(gè)3厘米×10厘米的墊片上涂覆3個(gè)圖案。涂覆后的墊片在2托和室溫下真空干燥1小時(shí)，然后切割成1厘米×10厘米的小塊，每塊含一個(gè)4線的圖案。
測(cè)試片是這樣制備的按圖1所示的結(jié)構(gòu)，將一片2.5厘米×20厘米的背襯硝酸纖維素片、一片1.8厘米×20厘米Gelman 133型吸收墊片、兩片1厘米×10厘米的涂有偶聯(lián)物的墊片(并排放置)和一片2厘米×20厘米GelmanCytosep 1662片，固定在一片涂有粘合劑且厚0.010’’的6厘米×20厘米乙烯背襯片上(G＆L Precision Die Cutting)。用背面涂有粘合劑的透明聚酯膜(G&LPrecision Die Cutting)覆蓋測(cè)試片，從Cytosep片上方2毫米覆蓋至吸收墊片上方。用Bio Dot Cutter 3000TM切片機(jī)，從組裝好的片材上切下0.5厘米寬的測(cè)試片。
實(shí)施例7用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒(cassette)置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori(幽門(mén)螺旋菌)的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
>實(shí)施例8用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例9用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例10用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))最接近偶聯(lián)物墊片，低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升H.pylori陰性adsol漿樣品(n＝12)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例11用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升BBI PMH201混合效價(jià)組樣品(n＝7)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例12用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升BBI PMH201混合效價(jià)組樣品(n＝7)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例13用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升BBI PMH201混合效價(jià)組樣品(n＝7)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例14用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))最接近偶聯(lián)物墊片，低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)h.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升BBI PMH201混合效價(jià)組樣品(n＝7)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例15用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升隨機(jī)血清樣品(n＝10)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例16用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升隨機(jī)血清樣品(n＝10)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例17用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升隨機(jī)血清樣品(n＝10)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例18用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))最接近偶聯(lián)物墊片，低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升隨機(jī)血清樣品(n＝10)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下<
實(shí)施例19用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升樣品(如下所述)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例20用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升樣品(如下所述)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例21用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是低對(duì)照區(qū)最接近偶聯(lián)物墊片，分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))位于低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合0.968毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、0.681毫升實(shí)施例4所述的偶聯(lián)物、1.868毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％TritonX-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)、0.094毫升20×PBS和0.185毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升BBI PMH混合效價(jià)組樣品(n＝4)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
實(shí)施例22用于該實(shí)施例的測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有Helicobacter pylori抽提物溶液(在280納米處的光密度為2.70)。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))最接近偶聯(lián)物墊片，低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)H.pylori的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升樣品(如下所述)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％Triton X-100，0.5％PE6(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)。
結(jié)果如下
上面實(shí)施例的數(shù)據(jù)可總結(jié)如下。在實(shí)施例7-22中測(cè)試了4種分析格式。這4種分析格式格式1獨(dú)立的含對(duì)照結(jié)合劑的顆粒偶聯(lián)物群以及含分析物結(jié)合劑的顆粒偶聯(lián)物群，且分析物結(jié)合區(qū)位于高對(duì)照區(qū)和低對(duì)照區(qū)之間；格式2獨(dú)立的含對(duì)照結(jié)合劑的顆粒偶聯(lián)物群以及含分析物結(jié)合劑的顆粒偶聯(lián)物群，且高對(duì)照區(qū)和低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)和偶聯(lián)物墊片之后；格式3含對(duì)照結(jié)合劑和分析物結(jié)合劑的顆粒的OMNITM偶聯(lián)物群，且分析物結(jié)合區(qū)位于高對(duì)照區(qū)和低對(duì)照區(qū)之間；格式4含對(duì)照結(jié)合劑和分析物結(jié)合劑的顆粒的OMNITM偶聯(lián)物群，且高對(duì)照區(qū)和低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)和偶聯(lián)物墊片之后；按格式對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，列于表1-5。
表1以HC/LC的CV％表示<
表2對(duì)陰性樣本的結(jié)果，以Dr平均值(分析物結(jié)合區(qū))/低對(duì)照區(qū)的Dr平均值表示
表3對(duì)陽(yáng)性樣本的結(jié)果，以Dr平均值(分析物結(jié)合區(qū))/低對(duì)照區(qū)的Dr平均值表示
表4總體擴(kuò)展，以表3平均值/表2平均值表示
表5在截止處的分析精確性(S/CO 0.9-1.2)
從這些表格中可看出，獨(dú)立的各顆粒群和OMNITM偶聯(lián)物群的不同配置，以及對(duì)照結(jié)合區(qū)和分析物結(jié)合區(qū)的不同配置，會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。對(duì)于測(cè)試H.pylori，格式2的HC/LC之比的變差系數(shù)最低而且對(duì)H.pylori陰性樣品的讀數(shù)最低。相反，格式3產(chǎn)生的對(duì)H.pylori陽(yáng)性樣品的讀數(shù)最高。最后，格式4在指定的截止值處的精確性最好，而且H.pylori陰性樣品和H.pylori陽(yáng)性樣品的測(cè)量值的擴(kuò)展也最大。
因此，對(duì)于截止式測(cè)試H.pylori，格式4似乎是最佳選擇。
實(shí)施例23用于該實(shí)施例的格式2和格式4測(cè)試片，在高對(duì)照區(qū)涂有300微克/毫升偶聯(lián)于二硝基苯酚的牛血清白蛋白(BSA-DNP)，在低對(duì)照區(qū)涂有25微克/毫升BSA-DNP，并且在分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))涂有2毫克/毫升的HIV包膜蛋白env-131溶液。這些條帶區(qū)在測(cè)試片上的次序是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))最接近偶聯(lián)物墊片，低對(duì)照區(qū)位于分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))和高對(duì)照區(qū)之間，而高對(duì)照區(qū)離偶聯(lián)物墊片最遠(yuǎn)且離吸收墊片最近。如實(shí)施例6所述，對(duì)硝酸纖維素片進(jìn)行涂覆并制備測(cè)試片。
對(duì)于格式2測(cè)試片，偶聯(lián)物墊片在0.1M磷酸鈉(pH 7.4，含0.5M氯化鈉、1％(w/v)酪蛋白、1mM EDTA、1％(w/v)Triton X-100、0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.05％(w/v)硫酸慶大霉素、0.1％(w/v)酵母提取物、0.05％(w/v)大腸桿菌提取物、1％(w/v)BSA、0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.05％SDS、2.5％蔗糖和2mg/ml兔IgG)中預(yù)封閉，然后在37℃干燥1.5小時(shí)。偶聯(lián)混合物的制備是通過(guò)混合0.908毫升實(shí)施例3所述的偶聯(lián)物、1.440毫升實(shí)施例5所述的偶聯(lián)物混合物和1.388毫升10mM硼酸鹽(pH 9.0，含0.1％PEG(MW20000))。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
對(duì)于格式4的測(cè)試片，偶聯(lián)物墊片的制備是通過(guò)混合1.0毫升實(shí)施例1所述的偶聯(lián)物、1.0毫升PBS(含20毫克/毫升BSA、2％Triton X-100、5％蔗糖、0.6％聚乙烯吡咯烷酮K-30和4毫克/毫升兔IgG)和0.050毫升20×PBS。如實(shí)施例6所述，將混合物涂在預(yù)封閉過(guò)的偶聯(lián)物墊片上。
測(cè)試是這樣進(jìn)行的將含測(cè)試片的測(cè)試盒置于ReLIATM儀上，該儀器已被設(shè)置好可運(yùn)行檢測(cè)HIV的測(cè)試并讀取數(shù)據(jù)。按提示，通過(guò)加入25微升樣品(HIV陽(yáng)性或HIV陰性)而開(kāi)始測(cè)試，然后加入3滴洗滌緩沖液(PBS，含0.05％TritonX-100，0.5％PEG(20000)，0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)。測(cè)試片溫度被設(shè)為37℃，并在15分鐘后對(duì)測(cè)試片進(jìn)行讀數(shù)
在上述實(shí)施例中，使用單群的偶聯(lián)于分析物結(jié)合劑和對(duì)照結(jié)合劑的檢測(cè)劑，顯示出優(yōu)于獨(dú)立雙群式所代表的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的單群格式的優(yōu)點(diǎn)在于，它可提高陰性與陽(yáng)性樣品群之間的分離。單群式還通過(guò)降低非特異性結(jié)合和提供更佳的流動(dòng)控制機(jī)制，改善了截止處的精確度。與雙群式方法相比，結(jié)果導(dǎo)致更高的分析靈敏度和特異性。
此外，使用多個(gè)對(duì)照區(qū)以及能夠?qū)⒔Y(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照條帶的相對(duì)強(qiáng)度，這都有助于分析測(cè)試的重復(fù)性和精確度。在本發(fā)明的單群式方法中，與獨(dú)立的第一分析物檢測(cè)顆粒群和對(duì)照檢測(cè)顆粒群相比，這可以通過(guò)更佳地控制測(cè)試差異的來(lái)源而加以實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，盡管含有單群偶聯(lián)于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑在某些情況下是優(yōu)異的，但是本發(fā)明也包括具有多群(兩群或更多)偶聯(lián)于檢測(cè)劑的第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑的例子。
在測(cè)試片上對(duì)照結(jié)合區(qū)和分析物結(jié)合區(qū)相對(duì)于流動(dòng)方向的放置次序，在上述實(shí)施例中會(huì)影響測(cè)試性能。對(duì)于Helicobacter pylori和HIV而言，從偶聯(lián)物墊片至吸收墊片的最佳測(cè)試結(jié)構(gòu)似乎都是分析物結(jié)合區(qū)(即抗原區(qū))、低對(duì)照區(qū)和高對(duì)照區(qū)。然而，這并不意味著在其他測(cè)試中不能通過(guò)不同的區(qū)結(jié)構(gòu)來(lái)獲得最佳結(jié)果，因而本發(fā)明也具體地包括這些其他配置。
權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行側(cè)流分析的方法，其特征在于，它包括讓感興趣分析物與第一分析物結(jié)合劑接觸，其中第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑被偶聯(lián)于檢測(cè)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種第一分析物結(jié)合劑或分析物非特異性試劑被共價(jià)連于檢測(cè)劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種第一分析物結(jié)合劑或分析物非特異性試劑被非共價(jià)偶聯(lián)于檢測(cè)劑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，感興趣分析物包括蛋白質(zhì)；糖蛋白；肽；小有機(jī)分子；多糖；抗體或其片段；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細(xì)胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，蛋白質(zhì)包括激素或其他分泌蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞表面蛋白，而抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，感興趣分析物具有免疫原性部分。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測(cè)試片包含第一分析物結(jié)合劑、檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，測(cè)試片具有膜片。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，測(cè)試片具有偶聯(lián)物墊片，偶聯(lián)物墊片含有第一分析物結(jié)合劑、檢測(cè)劑和分析物非特異性試劑，而且偶聯(lián)物墊片與膜片接觸且位于膜片遠(yuǎn)端。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，測(cè)試片具有與膜片復(fù)合在一起的保護(hù)性蓋片。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物結(jié)合劑包括針對(duì)感興趣分析物的抗體；具有分析物結(jié)合位點(diǎn)的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；針對(duì)感興趣分析物的受體；針對(duì)感興趣分析物的配體；或針對(duì)感興趣分析物的抗原。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，針對(duì)感興趣分析物的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、或足以結(jié)合于感興趣分析物的抗體片段。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)劑包括顆粒、發(fā)光標(biāo)記物；比色標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物；化學(xué)標(biāo)記物；酶；放射性標(biāo)記物；或射頻標(biāo)記物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，檢測(cè)劑包括顆粒。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，顆粒包括膠體金。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括抗體、具有對(duì)感興趣分析物的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的工程化蛋白、可特異結(jié)合于除感興趣分析物之外的配體的受體、可特異結(jié)合于除感興趣分析物之外的受體的配體、抗原、其他有機(jī)分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、或足以結(jié)合于感興趣分析物的抗體片段。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括兔IgG。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分析物非特異性試劑包括對(duì)照結(jié)合劑。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)照結(jié)合劑包括抗體、具有對(duì)感興趣分析物的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的工程化蛋白、可非特異結(jié)合于除感興趣分析物之外的配體的受體、可非特異結(jié)合于除感興趣分析物之外的受體的配體、抗原、其他有機(jī)分子、半抗原、IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，對(duì)照結(jié)合劑包括兔抗-二硝基苯酚IgG。
22.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，測(cè)試片具有至少一個(gè)檢測(cè)區(qū)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)檢測(cè)區(qū)包含至少一個(gè)測(cè)量區(qū)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)測(cè)量區(qū)包含至少一個(gè)分析物結(jié)合區(qū)和至少一個(gè)對(duì)照區(qū)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，對(duì)照區(qū)含有對(duì)照劑。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，對(duì)照劑特異地結(jié)合于對(duì)照結(jié)合劑，但不特異地結(jié)合于感興趣分析物或第一分析物結(jié)合劑，對(duì)照結(jié)合劑也不特異結(jié)合于第二分析物結(jié)合劑。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，對(duì)照劑包括可偶聯(lián)于BSA的二硝基苯酚。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，對(duì)照劑包括不特異結(jié)合于感興趣分析物的抗體；具有非特異性結(jié)合位點(diǎn)的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；對(duì)感興趣分析物非特異的受體；對(duì)感興趣分析物非特異的配體；或?qū)Ω信d趣分析物非特異的抗原。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，分析物結(jié)合區(qū)包含第二分析物結(jié)合劑。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，第二分析物結(jié)合劑包括針對(duì)感興趣分析物的抗體；具有分析物結(jié)合位點(diǎn)的工程化蛋白、肽、半抗原、或裂解物；針對(duì)感興趣分析物的受體；針對(duì)感興趣分析物的配體；或針對(duì)感興趣分析物的抗原。
31.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，測(cè)試片具有多個(gè)對(duì)照區(qū)。
32.一種在包括測(cè)試片的側(cè)流分析中提高測(cè)試平均陽(yáng)性結(jié)果和測(cè)試平均陰性結(jié)果之間差異的方法，其特征在于，它包括在空間上重新排列測(cè)試片上一個(gè)或多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)相對(duì)于分析物結(jié)合區(qū)的位置。
33.一種在包括測(cè)試片的側(cè)流分析中降低側(cè)流分析的變差系數(shù)的方法，其特征在于，它包括在空間上重新排列測(cè)試片上一個(gè)或多個(gè)對(duì)照結(jié)合區(qū)相對(duì)于分析物結(jié)合區(qū)的位置。
34.一種在側(cè)流分析中提高側(cè)流分析重復(fù)性的方法，其特征在于，它包括定量位于第一對(duì)照區(qū)中的第一數(shù)量的檢測(cè)劑；定量位于第二對(duì)照區(qū)中的第二數(shù)量的檢測(cè)劑；將定量的第一和第二數(shù)量的檢測(cè)劑映射到相對(duì)標(biāo)尺上，得到檢測(cè)劑的第一相對(duì)數(shù)量和第二相對(duì)數(shù)量；以及所進(jìn)行的映射使得定量的第一數(shù)量檢測(cè)劑與第二數(shù)量檢測(cè)劑之比大于第一相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑與第二相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑之比。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，定量的第一數(shù)量檢測(cè)劑與定量的第二數(shù)量檢測(cè)劑之比至少約為5∶1，而第一相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑與第二相對(duì)數(shù)量檢測(cè)劑之比至少約為3∶1。
36.一種側(cè)流分析，它包括測(cè)試片，其特征在于，該測(cè)試片包括偶聯(lián)于檢測(cè)劑的分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑。
37.如權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析，其特征在于，至少一種分析物結(jié)合劑或分析物非特異性試劑被共價(jià)連于檢測(cè)劑。
38.如權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析，其特征在于，至少一種分析物結(jié)合劑或分析物非特異性試劑被非共價(jià)偶聯(lián)于檢測(cè)劑。
39.如權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析，其特征在于，感興趣分析物包括蛋白質(zhì)；糖蛋白；肽；小有機(jī)分子；多糖；抗體或其片段；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細(xì)胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
40.如權(quán)利要求39所述的側(cè)流分析，其特征在于，蛋白質(zhì)包括激素或其他分泌蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞表面蛋白，而抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
41.如權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析，其特征在于，感興趣分析物具有免疫原性部分。
42.一種試劑盒，其特征在于，它包含權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析。
43.一種方法，它包括進(jìn)行側(cè)流分析以測(cè)定與人類疾病、或獸醫(yī)、食品測(cè)試、農(nóng)業(yè)和精細(xì)化學(xué)應(yīng)用有關(guān)的感興趣分析物，其特征在于，該側(cè)流分析是權(quán)利要求36所述的側(cè)流分析。
44.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑在進(jìn)行側(cè)流分析之前被偶聯(lián)于檢測(cè)劑。
全文摘要
公開(kāi)了一種側(cè)流分析,它包括將分析物結(jié)合劑和分析物非特異性試劑偶聯(lián)于檢測(cè)劑。還公開(kāi)了制備和使用該分析的方法,以及改進(jìn)這類分析的性能的方法。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1254844SQ9912437
公開(kāi)日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1999年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月23日
發(fā)明者A·J·波利托, R·M·塞耶, R·K·德尼羅, G·H·謝拉 申請(qǐng)人:普萊克斯生物系統(tǒng)股份有限公司