本發(fā)明涉及生物
技術領域:
,具體涉及一種用于檢測肉毒毒素的試劑盒。
背景技術:
:肉毒素素是由肉毒梭狀芽孢桿菌在生長繁殖過程中分泌的神經(jīng)外毒素,主要有A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型。除肉毒梭菌外,某些酪酸梭菌(C.butyricum)和巴拉特梭菌(C.baratii)也可產(chǎn)生肉毒毒素。A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型在細胞內(nèi)的底物和切割位點詳見表1,其中A型、C型和E型肉毒素素在細胞內(nèi)的底物均為SNAP-25蛋白(SNAP-25蛋白的ID號為XP-014937011)。表1肉毒素素的切割位點肉毒毒素類型細胞內(nèi)的底物切割位點A型SNAP-25蛋白Gln197-Arg198B型VAMP蛋白Gln76-Phe77C型SNAP-25蛋白Arg198-Ala199C型Syntaxin蛋白Lys253-Ala254D型VAMP蛋白Lys59-Leu60E型SNAP-25蛋白Arg180-Ile181F型VAMP蛋白Gln58-Lys59G型VAMP蛋白Ala81-Ala82檢測肉毒素素的方法有小鼠的致死實驗、基于免疫實驗的雙抗夾心的酶聯(lián)免疫吸附試驗和膠體金免疫層析法等等。小鼠的致死實驗是檢測肉毒毒素的金標準,其最小檢出限可達10pg,但該方法存在檢測周期長、工作量大、成本高、需要大量實驗動物等缺點?;诿庖邔嶒灥碾p抗夾心的酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法可檢測如純?nèi)舛径舅?、肉毒梭菌培養(yǎng)物、血液標本等干擾成分較少的樣本,檢測如食物、糞便、膿等干擾成分較多的樣本實驗結(jié)果會有一定的干擾,即存在局限性,而且該方法檢測時間長,肉毒毒素檢測和型別鑒定需5~6h,與小鼠的致死實驗相比,最小檢出限低10倍~100倍。基于免疫實驗的雙抗夾心的膠體金免疫層析法可快速檢測肉毒毒素,檢測時間約5min,最小檢出限可達10~50ng,操作簡單,適合現(xiàn)場快速篩查,但該方法無法檢測肉毒毒素是否具有活性,也無法對肉毒毒素進行定量。技術實現(xiàn)要素:本發(fā)明所要解決的技術問題是如何檢測肉毒毒素。為解決上述技術問題,本發(fā)明首先提供了一種用于檢測肉毒毒素的試劑盒甲。本發(fā)明所提供的用于檢測肉毒毒素的試劑盒甲,可包括組件甲和組件乙;所述組件甲可為一個末端連接化合物B、另一個末端具有標簽分子的特異蛋白質(zhì);所述特異蛋白質(zhì)可為a1)或a2)或a3):a1)SNAP-25蛋白;a2)含有所述SNAP-25蛋白的蛋白質(zhì);a3)所述SNAP-25蛋白與其它蛋白或肽段的融合蛋白;所述組件乙可為膠體金試紙條,其中,金標墊上可包被有化合物A標記的膠體金,反應膜上的質(zhì)控線位置可包被所述化合物A的抗體,檢測線位置可包被所述標簽分子的抗體;所述化合物B可與所述化合物A結(jié)合。上述試劑盒甲中,所述質(zhì)控線位置包被的所述化合物A的抗體的濃度可為1mg/mL以上,具體可為1mg/mL。上述試劑盒甲中,所述檢測線位置包被的所述標簽分子的抗體的濃度可為1mg/mL以上,具體可為1mg/mL。上述試劑盒甲中,所述金標墊的材質(zhì)可為聚酯纖維素膜。上述試劑盒甲中,所述化合物B可為生物素。所述化合物A可為親和素。所述親和素可為鏈霉親和素。所述標簽分子可為His標簽。所述標簽分子的抗體具體可為Anti-His抗體。所述親和素的抗體具體可為鏈霉親和素抗體。上述試劑盒甲中,所述特異蛋白質(zhì)可為b1)或b2)或b3):b1)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第1至220位所示的蛋白質(zhì);b2)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第16至220位所示的蛋白質(zhì);b3)將b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。所述試劑盒甲具體可由所述組件甲和所述組件乙組成。上述任一所述的試劑盒甲中,所述肉毒毒素可為A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。上述任一所述試劑盒甲在檢測肉毒毒素中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應用中,所述肉毒毒素可為A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。為解決上述技術問題,本發(fā)明還提供了采用上述任一所述試劑盒甲檢測檢測待測樣本中是否含有肉毒毒素的方法。本發(fā)明所提供的采用上述任一所述試劑盒甲檢測待測樣本中是否含有肉毒毒素的方法,依次包括如下步驟:(1)將待測溶液與所述組件甲混勻,得到孵育體系;所述待測溶液為待測液相樣本或待測固相樣本溶解得到的液相樣本;(2)孵育,用所述組件乙檢測。上述方法中,所述步驟(1)中,所述組件甲在所述孵育體系的濃度為50ng/mL以上。上述方法中,所述步驟(1)可為將所述待測溶液、所述組件甲和含0.3-0.7mMZnCl2的pH7.0-7.5、0.005-0.015M的PBS緩沖液混勻,得到孵育體系。上述方法中,所述步驟(1)具體可為將所述待測溶液、所述組件甲和含0.5mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液混勻,得到孵育體系。上述方法中,所述步驟(2)中,所述孵育的參數(shù)可為:35~39℃孵育12~14h。上述方法中,所述步驟(2)中,所述孵育的參數(shù)具體可為:37℃孵育12h-14h。上述方法中,所述步驟(2)中,用組件乙檢測,檢測結(jié)果可進行如下評判:如果質(zhì)控線顯示紅色且檢測線不顯示紅色,則所述待測溶液含有肉毒毒素;如果所述質(zhì)控線和檢測線均顯出紅色,則所述待測溶液不含有肉毒毒素。上述任一所述的方法中,所述肉毒毒素可為A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。為解決上述技術問題,本發(fā)明還提供了一種用于檢測肉毒毒素的試劑盒乙。本發(fā)明所提供的用于檢測肉毒毒素的試劑盒乙,可包括組件甲、化合物A標記的的膠體金溶液、所述化合物A的抗體和標簽分子的抗體;所述組件甲可為一個末端連接化合物B、另一個末端具有所述標簽分子的特異蛋白質(zhì);所述特異蛋白質(zhì)可為a1)或a2)或a3):a1)SNAP-25蛋白;a2)含有所述SNAP-25蛋白的蛋白質(zhì);a3)所述SNAP-25蛋白與其它蛋白或肽段的融合蛋白;所述化合物B可與所述化合物A結(jié)合。上述試劑盒乙中,所述化合物B可為生物素。所述化合物A可為親和素。所述親和素可為鏈霉親和素。所述標簽分子可為His標簽。所述標簽分子的抗體具體可為Anti-His抗體。所述親和素的抗體具體可為鏈霉親和素抗體。上述試劑盒乙中,所述特異蛋白質(zhì)可為b1)或b2)或b3):b1)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第1至220位所示的蛋白質(zhì);b2)氨基酸序列是序列表中序列1自N端起第16至220位所示的蛋白質(zhì);b3)將b1)或b2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。所述試劑盒乙具體可由所述組件甲、所述化合物A標記的的膠體金溶液、所述化合物A的抗體和所述標簽分子的抗體組成。上述任一所述的試劑盒乙中,所述肉毒毒素可為A型肉毒毒素、C型肉毒毒素或E型肉毒毒素。實驗證明,使用本發(fā)明所提供的試劑盒檢測肉毒毒素,操作簡單,耗時短,準確率高,且特異性好,靈敏度高,最小檢出限可達20pg/mL。因此,本發(fā)明所提供的試劑盒在檢測肉毒毒素中具有重要的應用價值。附圖說明圖1為實施例3的檢測結(jié)果。圖2為實施例4的檢測結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述,給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結(jié)果取平均值。實施例1、檢測肉毒毒素的膠體金試紙的制備質(zhì)粒pET22b-SNAP25記載在如下文獻中:劉昊,etal.,SNAP-25基因克隆及其在大腸桿菌中的表達與鑒定.軍事醫(yī)學科學院院刊,2009(03):p.228-230.A型肉毒桿菌記載與如下文獻中:游哲榮,etal.,抗A型肉毒毒素卵黃抗體的制備、純化及活性檢測.軍事醫(yī)學,2014(03):p.174-177+180.B型肉毒毒素記載與如下文獻中:Zhao,Y.,etal.,PEGprecipitationcoupledwithchromatographyisanewandsufficientmethodforthepurificationofbotulinumneurotoxintypeB[corrected].PLoSOne,2012.7(6):p.e39670.E型肉毒毒素記載與如下文獻中:賈宏麗,etal.,重組肉毒毒素E(BoNT/E)重鏈C端的表達、純化及其抗原性分析.軍事醫(yī)學科學院院刊,2004(05):p.417-419+423.A液:含0.02M磷酸鈉、0.5M氯化鈉和0.04M咪唑的水溶液,pH值為7.4。洗脫液:含0.02M磷酸鈉、0.5M氯化鈉和0.4M咪唑的水溶液,pH值為7.4。LB液體培養(yǎng)基:將1gNaCl、0.5g酵母提取物和1g胰蛋白胨溶于100mL去離子水,調(diào)節(jié)pH值為7.0。明膠磷酸鹽緩沖液:將2g明膠和4g磷酸氫二鈉溶于1L去離子水,加熱溶解,然后調(diào)節(jié)pH值至6.2,121℃高壓滅菌15min。TPYG液體培養(yǎng)基:將3g蛋白胨、0.5g酵母抽提物、0.5g葡萄糖、0.05gL-半胱氨酸鹽酸鹽和0.025g硫代乙醇酸鈉溶于100mL去離子水,然后用磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH值至6.2,112℃高壓滅菌20min。TPOM培養(yǎng)基:將1g酵母粉、2g酶水解酪素、0.05g巰基乙酸鈉、0.1gL-鹽酸半胱氨酸和0.5g葡萄糖,溶于100mL去離子水,然后調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4,112℃高壓20min。鏈霉親和素抗體為Prospec-TanyTechnoGene公司產(chǎn)品。Anti-His為Abbkine公司產(chǎn)品。大腸桿菌BL21(DE3)為北京全式金生物技術有限公司的產(chǎn)品。Ni-NTA純化柱、PD10除鹽柱和DEAEFF柱均為GE公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號分別為17-5319-01、17-0851-01和17-5055-01,簡稱鎳柱。Avi-Tag試劑盒為Avidity公司產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為BirA500。HAucl4為上海拓思化學有限公司的產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為16903-35-8。鏈霉親和素為Prospec公司的產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為PRO-283。聚酯纖維素膜為上海杰一生物技術有限公司的產(chǎn)品。硝酸纖維素膜和塑料背板均為上海杰一生物技術有限公司的產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號分別為NC-b105和NC-b105。雌性昆明小鼠為軍事醫(yī)學科學院豐臺實驗動物中心產(chǎn)品。正常人的血清來源于北京307醫(yī)院血液中心。一、肉毒毒素底物蛋白的制備1、重組大腸桿菌的獲得將質(zhì)粒pET22b-SNAP25轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌BL21(DE3),得到重組大腸桿菌,將其命名為BL21(DE3)/pET22b-SNAP-25。BL21(DE3)/pET22b-SNAP-25表達序列表的序列1所示的重組蛋白Avi-SNAP-25-His。重組蛋白Avi-SNAP-25-His依次包括Avi標簽、蛋白SNAP-25和His標簽,Avi標簽的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第1至15位所示,蛋白SNAP-25的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第16至220位所示,His標簽的氨基酸序列如序列表中序列1自N端起第221至226位所示。2、重組蛋白Avi-SNAP-25-His的表達(1)將BL21(DE3)/pET22b-SNAP25的單克隆接種于5mL含100μg/μL氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的LB液體培養(yǎng)基,37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h,得到培養(yǎng)菌液1。取培養(yǎng)菌液1,以1:100(體積比)接種于500mL含100μg/μLAmp的LB液體培養(yǎng)基,37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm值0.4~0.6,得到培養(yǎng)菌液2。(2)完成步驟(1)后,向培養(yǎng)菌液2中加入IPTG得到誘導體系,IPTG在誘導體系中的濃度為1mM,然后25℃、120rpm振蕩培養(yǎng)12h,得到誘導培養(yǎng)菌液。將誘導培養(yǎng)菌液4℃、6000rpm離心20min,收集菌體,獲得IPTG誘導后的菌體。(3)完成步驟(2)后,取IPTG誘導后的菌體,用A液重懸,然后置冰上在超聲破碎儀上超聲破碎(超聲波功率100W,循環(huán)程序為:破碎6s,停4s,共計30min),然后4℃、12000rpm離心20min,得到菌體破碎上清液和菌體破碎沉淀。將菌體破碎上清液和菌體破碎沉淀進行SDS-PAGE。結(jié)果表明,重組蛋白Avi-SNAP-25-His在菌體破碎上清液和菌體破碎沉淀均存在,大小約為25.82kD。3、重組蛋白Avi-SNAP-25-His的純化使用Ni-NTA純化柱純化重組蛋白Avi-SNAP-25-His,具體步驟如下:(1)用10個柱體積的雙蒸水沖洗鎳柱(流速為5mL/min);(2)完成步驟(1)后,用5個柱體積的A液平衡鎳柱(流速為5mL/min)。(3)完成步驟(2)后,將步驟2中(3)得到的菌體破碎上清液上樣至鎳柱(流速為1mL/min)。(4)完成步驟(3)后,用5個柱體積的A液平衡鎳柱(流速為5mL/min),以去除雜蛋白。(5)完成步驟(4)后,依次用5個柱體積的含100mmol/L咪唑的洗脫液、5個柱體積的含150mmol/L咪唑的洗脫液和沖洗鎳柱(流速為1.5mL/min),以去除大多數(shù)的雜蛋白,最后用5個柱體積的含350mmol/L咪唑的洗脫液沖洗鎳柱(流速為1.5mL/min)并收集過柱后溶液,即為濃度為2mg/mL的重組蛋白Avi-SNAP-25-His溶液。4、重組蛋白Avi-SNAP-25-His的生物素化按照Avi-Tag試劑盒的操作步驟,對重組蛋白Avi-SNAP-25-His溶液進行生物素化,具體步驟如下:(1)反應體系由500μL重組蛋白Avi-SNAP-25-His溶液、96.8μLBiomaxA、96.8μLBiomaxB、9.68μLBirA酶和264.72μLH2O組成;其中BiomaxA、BiomaxB和BirA酶均為Avi-Tag試劑盒中的組件。(2)完成步驟(1)后,將反應體系置于30℃孵育5h,得到反應混合物。(3)完成步驟(2)后,反應混合物經(jīng)PD10除鹽柱除鹽,并采用超濾管進行超濾濃縮,得到的濃縮液即為肉毒毒素底物蛋白溶液。二、檢測肉毒毒素的膠體金試紙的制備1、膠體金溶液的制備膠體金溶液的制備方法為:將HAucl4配制成0.01%(0.01g/100mL)HAucl4水溶液,取100mL0.01%(0.01g/100mL)HAucl4水溶液,加熱至煮沸,然后加入2mL1%(1g/100mL)枸櫞酸三鈉水溶液,繼續(xù)加熱煮沸直至溶液呈葡萄酒紅色,冷卻后用無菌水定容至100mL,即為膠體金溶液,該膠體金溶液中膠體金顆粒直徑約為20nm。2、金標墊的制備(1)膠體金包鏈霉親和素溶液的制備經(jīng)過大量實驗,膠體金包鏈霉親和素的制備方法如下:取100mL膠體金溶液,加入5.6mg鏈霉親和素,調(diào)節(jié)pH值至7.8,用混勻攪拌機攪拌30min(目的為使鏈霉親和素和金顆粒結(jié)合);然后加入2mL的5%(質(zhì)量百分比)的BSA水溶液,混勻放置30min(目的為封閉),得到膠體金包鏈霉親和素溶液。(2)金標墊的制備取膠體金包鏈霉親和素溶液,均勻涂布在聚酯纖維素膜上并使其厚度為2mm,然后自然晾干,得到金標墊。3、包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜的制備(1)用去離子水稀釋鏈霉親和素抗體,得到濃度為1mg/mL的質(zhì)控線溶液,用于包被質(zhì)控線。(2)用去離子水稀釋Anti-His,分別得到濃度為1mg/mL的檢測線溶液,用于包被檢測線。(3)完成步驟(1)和(2)后,通過劃膜儀向硝酸纖維素膜劃質(zhì)控線溶液和檢測線溶液,形成相互分離的質(zhì)控線(C)和檢測線(T),37℃干燥2h,得到包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜。4、檢測肉毒毒素的膠體金試紙的組裝檢測肉毒毒素的膠體金試紙由吸水紙(如濾紙)、包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜、金標墊和樣品墊(材質(zhì)為玻璃纖維素膜)四部分組成。檢測肉毒毒素的膠體金試紙的組裝步驟如下:將吸水紙用雙面膠粘貼在包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜的一端,然后在包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜的另一端上用雙面膠粘貼金標墊的一端,將金標墊的另一端上用雙面膠粘貼樣品墊,最后將它們用雙面膠粘貼在塑料背板上,切成寬度為4mm的膠體金試紙。將該膠體金試紙用塑封袋密封后放干燥盒保存?zhèn)溆谩?、檢測肉毒毒素的膠體金試紙的使用方法和判斷標準(1)處理體系:向18μL含0.5mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液中加入1μL待測樣品(待測樣品分為待測液體樣品(如血清、尿液、胃內(nèi)容物或其它液體樣品)和待測固體樣品,待測固體樣品需使用pH7.2、0.01M的PBS緩沖液溶解得到相應的溶液)和1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白),得到處理體系。(2)處理:將處理體系37℃孵育14h,得到處理后體系。(3)測定:將膠體金試紙的樣品墊浸入處理后體系,樣品墊即吸取液體向上端移動,流經(jīng)金標墊時與膠體金包鏈霉親和素溶液發(fā)生作用,然后向包被質(zhì)控線和檢測線的硝酸纖維素膜滲移。根據(jù)硝酸纖維素膜上顯出的紅色反應線條情況進行如下判斷:①如果僅在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線處顯出紅色反應線條,則待測樣品中含有肉毒毒素;其原理為待測樣品中的肉毒毒素可將肉毒毒素底物蛋白切割為兩段,一段是經(jīng)生物素化的多肽甲,另一段為攜帶His標簽的多肽乙,其中多肽甲可與金標墊上的膠體金包鏈霉親和素溶液結(jié)合形成復合物,此復合物流經(jīng)檢測線不能與Anti-His結(jié)合、因而檢測線處不顯出紅色反應線條,此復合物流經(jīng)質(zhì)控線能與鏈霉親和素抗體結(jié)合、因而質(zhì)控線處顯出紅色反應線條;②如果在硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線處均顯出紅色反應線條,則待測樣品中不含有肉毒毒素;其原理為待測樣品中不含有肉毒毒素,所以不對肉毒毒素底物蛋白進行切割,肉毒毒素底物蛋白與金標墊上的膠體金包鏈霉親和素溶液結(jié)合形成復合物,此復合物流經(jīng)檢測線能與Anti-His結(jié)合、因而檢測線處顯出紅色反應線條,此復合物流經(jīng)質(zhì)控線能與鏈霉親和素抗體結(jié)合、因而質(zhì)控線處顯出紅色反應線條;③如果僅在硝酸纖維素膜上的檢測線處顯出紅色反應線條或在硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線處均不顯出紅色反應線條,則為無效實驗結(jié)果,需重新測定。實施例2、A型肉毒毒素的制備和純化一、A型肉毒毒素的制備和純化①將A型肉毒桿菌的單克隆接種于5mLTPYG液體培養(yǎng)基,置于厭氧溫箱,37℃培養(yǎng)24-48h,得到菌液1。②完成步驟①后,取1mL菌液1,以1:5(體積比)接種于5mLTPYG液體培養(yǎng)基,置于厭氧溫箱,37℃培養(yǎng)12-16h,得到菌液2。③完成步驟②后,取菌液2,以1:200(體積比)接種于1LTPOM培養(yǎng)基,置于厭氧溫箱,室溫靜置96h,得到沉淀甲。④完成步驟③后,取沉淀甲,用滅菌水洗滌,離心,收集沉淀乙。⑤完成步驟④后,取沉淀乙,用50mL的pH6.0、0.2MPBS緩沖液重懸,將得到的重懸液離心,收集上清液甲。⑥完成步驟⑤后,向上清液甲中加入核糖核酸酶,得到混合液(該混合液中,核糖核酸酶的濃度為50~100μg/mL);然后將該混合液34℃處理3h~5h,得到反應溶液。將該反應溶液離心,收集上清液乙。⑦完成步驟⑥后,向上清液乙中緩慢加入飽和硫酸銨溶液直至硫酸銨溶液的飽和度達到60%(在冰浴中進行),待沉淀丙析出,離心,收集沉淀丙。⑧完成步驟⑦后,取沉淀丙,用5mL的pH5.5、0.05M的檸檬酸鈉緩沖液溶解沉淀,將得到的重懸液離心,收集上清液丙并用0.22μm濾器過濾,得到上樣液。⑨完成步驟⑧后,將上樣液上樣至DEAEFF柱,然后用2個柱體積的pH3.4、0.1M的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,收集A260/A280的比值在0.6以下的第一個洗脫峰的洗脫產(chǎn)物,即獲得A型肉毒毒素溶液。二、A型肉毒毒素的小鼠毒力實驗①取A型肉毒毒素溶液,用明膠磷酸鹽緩沖液進行稀釋,分別得到毒素稀釋液1(稀釋度為1:5×106,即蛋白濃度為40pg/mL)、毒素稀釋液2(稀釋度為1:107,即蛋白濃度為20pg/mL)、毒素稀釋液3(稀釋度為1:20×106,即蛋白濃度為10pg/mL)和毒素稀釋液4(稀釋度為1:40×106,即蛋白濃度為5pg/mL)。②取體重為14~16g的雌性昆明小鼠,隨機分成實驗組一、實驗組二、實驗組三、實驗組四和對照組(每組4只),分別進行如下處理:實驗組一:實驗第1天腹腔注射0.5mL毒素稀釋液1,實驗第4天觀察雌性昆明小鼠的生存狀態(tài);實驗組二:實驗第1天腹腔注射0.5mL毒素稀釋液2,實驗第4天觀察雌性昆明小鼠的生存狀態(tài);實驗組三:實驗第1天腹腔注射0.5mL毒素稀釋液3,實驗第4天觀察雌性昆明小鼠的生存狀態(tài);實驗組四:實驗第1天腹腔注射0.5mL毒素稀釋液4,實驗第4天觀察雌性昆明小鼠的生存狀態(tài);對照組:實驗第1天腹腔注射0.5mL明膠磷酸鹽緩沖液,實驗第4天觀察雌性昆明小鼠的生存狀態(tài)。表2A型肉毒毒素的小鼠毒力實驗結(jié)果觀察天數(shù)死亡(只數(shù))存活(只數(shù))實驗組一4天31實驗組二4天13實驗組三4天04實驗組四4天04對照組4天04實驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明,步驟一獲得的A型肉毒毒素溶液可導致小鼠死亡,毒力值為1.3×107LD50/mL。實施例3、膠體金試紙的最小檢出限取A型肉毒毒素溶液,用pH7.2、0.01M的PBS緩沖液進行稀釋,分別得到毒素稀釋液6(稀釋度為1:106,即蛋白濃度為200pg/mL)、毒素稀釋液7(稀釋度為1:108,即蛋白濃度為2pg/mL)和毒素稀釋液8(稀釋度為1:109,即蛋白濃度為0.2pg/mL)。1、體系的制備取17μL含0.05mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液,加入1μL正常人的血清、1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白)和1μL毒素稀釋液2,得到體系1。將體系1中的毒素稀釋液2替換為毒素稀釋液6,其它成分均不變,得到體系2。將體系1中的毒素稀釋液2替換為毒素稀釋液7,其它成分均不變,得到體系3。將體系1中的毒素稀釋液2替換為毒素稀釋液8,其它成分均不變,得到體系4。2、處理將體系(體系1、體系2、體系3或體系4)37℃孵育12-14h,得到處理后體系。3、測定將膠體金試紙1的樣品墊浸入處理后體系,一段時間后,觀察硝酸纖維素膜上顯出的紅色反應線條情況。實驗結(jié)果見圖1(1為體系4,2為體系3,3為體系1,4為體系2):體系1或體系2的處理后體系僅在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線處顯出紅色反應線條,而體系3或體系4的處理后體系在硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線處均顯出紅色反應線條。結(jié)果表明,膠體金試紙的最小檢出限為20pg/mL。實施例4、膠體金試紙的特異性1、體系的制備取17μL含0.05mMZnCl2的pH7.2、0.01M的PBS緩沖液,加入1μL正常人的血清、1μL肉毒毒素底物蛋白溶液(其中含有1ng肉毒毒素底物蛋白)和1μL毒素稀釋液2,得到體系1。將體系1中的毒素稀釋液2替換為B型肉毒毒素其它成分均不變,得到體系2。將體系1中的毒素稀釋液2替換為E型肉毒毒素,其它成分均不變,得到體系3。2、處理將體系(體系1、體系2或體系3)37℃孵育12h-14h(即孵育過夜),得到處理后體系。3、測定將膠體金試紙1的樣品墊浸入處理后體系,一段時間后,觀察硝酸纖維素膜上顯出的紅色反應線條情況。實驗結(jié)果見圖2(1為體系2,2為體系3,3為體系1):體系2或體系3的處理后體系在硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線處均顯出紅色反應線條,而體系1的處理后體系僅在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線處顯出紅色反應線條。結(jié)果表明,膠體金試紙具有較好的特異性。當前第1頁1 2 3