本發(fā)明涉及癌細胞分析檢測技術(shù)、多枝雜交鏈信號放大技術(shù)、紙芯片技術(shù)及復合納米材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種用于超靈敏檢測癌細胞的電致化學發(fā)光細胞傳感器的制備。
背景技術(shù)：
靈敏地檢測癌細胞在癌癥的早期檢測、轉(zhuǎn)移及治療中具有重要的意義。到目前為止，一些檢測方法像流式細胞術(shù)、聚合酶鏈反應、微量測定分析法和細胞濃縮方法已經(jīng)被發(fā)展并用于癌細胞的檢測。由于在血清中循環(huán)流通的腫瘤細胞的數(shù)量是非常少的，因此仍急需發(fā)展一種超靈敏、準確的檢測癌細胞的分析方法。
石墨烯量子點（GQDs）作為一種以碳為基礎(chǔ)的發(fā)光材料，由于其無毒性、良好的生物相容性、水溶性及獨特的光和電性能在電致化學發(fā)光（ECL）傳感器中被廣泛地應用。提高ECL傳感器靈敏度的關(guān)鍵是提高GQDs的ECL響應。銀納米粒子（AgNPs）具有良好的導電性和生物相容性，其可以減小ECL發(fā)射源和工作電極之間的電子傳播阻礙?；贏gNPs獨特的性能，我們利用AgNPs增強GQDs的ECL發(fā)射，獲得更強的ECL響應。
目前，以DNA為基礎(chǔ)的信號放大技術(shù)在生物分析中被廣泛地利用。其中，多枝雜交鏈信號放大技術(shù)引起了廣泛的研究興趣，通過多枝雜交鏈反應，可以獲得更長的帶有多條分枝的DNA雙螺旋，這種獨特的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)有利于負載更多的GQDs和AgNPs，極大地放大ECL響應。為了進一步放大分析檢測信號，我們利用AgNPs對Ag+良好的催化還原作用，在DNA雙螺旋骨架上沉積更多的AgNPs，更高地增強GQDs的ECL響應，提高分析檢測的靈敏度。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過原位生長法制備具有大的比表面積、良好的生物相容性和導電性的三維花狀的紙金電極，利用其捕獲目標癌細胞，通過癌細胞與特定適配體的特異性結(jié)合作用，將修飾有AgNPs的多枝雜交鏈負載在電極表面，然后在多枝雜交鏈上修飾和沉積大量的GQDs和AgNPs，完成ECL細胞傳感器的制備，實現(xiàn)對癌細胞的超靈敏、準確檢測。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：
（1）在計算機上利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，將設(shè)計好的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130 ℃加熱50秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；
（2）在計算機上設(shè)計與步驟（1）中獲得的蠟打印圖案相匹配的工作電極、對電極和參比電極的印刷圖案，并利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在步驟（1）中獲得的蠟打印色譜紙上印刷碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極；
（3）利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區(qū)域生長三維花狀的金；
（4）將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞；
（5）將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域；
（6）將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上；
（7）在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs；
（8）在步驟（7）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，滴加10 μL包含0.1 M K2S2O8的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），在電壓范圍為0 ~ -1.6V進行ECL信號檢測，光電倍增管電壓為800 V，繪制ECL強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現(xiàn)對癌細胞的檢測。
本發(fā)明所述的利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區(qū)域生長三維花狀的金的具體步驟為：
（1）合成金納米粒子：首先將90 mL 二次水置于單口燒瓶中并加熱到90 ℃，然后加入0.8 mL 1% 氯金酸，繼續(xù)水浴加熱到96 ℃，待反應進行1 min后，再加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，在磁力攪拌下反應15 min，獲得酒紅色的溶液；
（2）取10-20 μL金納米粒子滴加到工作區(qū)域，在室溫下靜置反應30-60 min，用二次水洗滌除去多余的金納米粒子，取10-20 μL新鮮制備的氯金酸和抗壞血酸的混合溶液滴加到工作區(qū)域，所述的氯金酸的濃度為10-15mM，抗壞血酸的濃度為80-120 mM，在室溫下生長20-40 min后，用二次水清洗工作區(qū)域并在室溫下自然干燥30 min。
本發(fā)明所述的將伴刀豆球蛋白A修飾在步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，采用牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點，然后利用伴刀豆球蛋白A捕獲癌細胞的具體步驟為：取10 μL伴刀豆球蛋白A滴到紙工作區(qū)域，在室溫下孵化30 min，用pH 7.4 PBS洗滌除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10 μL1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結(jié)合位點，利用pH 7.4 PBS洗滌后，繼續(xù)滴加10 μL不同濃度的癌細胞，在37 ℃下孵化40 min，隨后用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的癌細胞。
本發(fā)明所述的將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域的具體步驟為：
（1）合成AgNPs：首先制備20 mL硝酸銀和檸檬酸鈉的混合溶液，所述的硝酸銀和檸檬酸鈉的濃度均為0.1-0.5 mM且摩爾比為1:1，在磁力攪拌作用下，向混合液中加入0.5-1 mL新鮮制備的濃度為10-20 mM硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌20-50秒，獲得AgNPs溶液；
（2）在發(fā)夾DNA分子1（H1）和發(fā)夾DNA分子2（H2）上連接AgNPs：將H1和H2溶解于pH 5.0的三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽中，靜置處理1 h，隨后將活化的H1和H2用C18分離填充柱脫鹽，并進行冷凍干燥，然后將冷凍干燥后的H1和H2溶解在1 mL 濃度為0.5 M，pH 7.6的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）中，獲得的H1和H2濃度均為10 μM且摩爾比為1:1，繼續(xù)加入500μL AgNPs，緩慢地震蕩5 min后，加入15 μL 濃度為0.5 M，pH 3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化5 min，隨后繼續(xù)加入15 μL 濃度為0.5 M，pH 3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化25 min后，用pH 7.6 HEPES將混合液調(diào)節(jié)至中性，并用pH 7.6 HEPES離心洗滌5次，獲得H1-Ag和H1-Ag；
（3）多枝雜交鏈反應：將上述獲得H1-Ag和H1-Ag溶解在1 mL雜交鏈反應緩沖溶液（TM）中，所述的TM為pH 8.0，濃度為20 mM且含有50 mM MgCl2的Tris緩沖溶液，然后用PTC-200熱循環(huán)儀在95 oC加熱10 min，并在30 s 內(nèi)冷卻到4 oC，隨后加入100 μL捕獲癌細胞的適配體鏈和引物鏈的混合液，所述的捕獲癌細胞的適配體鏈和引物鏈的濃度均為5 μM且摩爾比為1:1，最后將獲得的混合液在37 oC反應12 h，獲得AgNPs修飾的多枝雜交鏈；
（4）取10 μL上述獲得的AgNPs修飾的多枝雜交鏈滴加到步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，在37 oC孵化30 min后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的多枝雜交鏈。
本發(fā)明所述的將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上的具體步驟為：
（1）合成GQDs:稱取1-2 g 檸檬酸，置于25 mL的小燒杯中，放在烘箱中于200 oC加熱20-30 min，待冷卻至室溫后，用濃度為1000 M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，獲得黃棕色的GQDs溶液；
（2）取10 μL上述獲得GQDs溶液滴加到步驟（5）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，在室溫下孵化2 h后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的GQDs。
本發(fā)明所述的在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs的具體步驟為：將10-15 μL包含硝酸銀和抗壞血酸的銀沉積溶液滴加到步驟（6）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，所述的硝酸銀的濃度為0.1-0.5 mM，抗壞血酸的濃度為0.1-0.25 mM，在室溫下，黑暗處孵化5-10 min后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的溶液。
本發(fā)明的有益效果：
（1）通過簡單的原位生長法制備的三維花狀的紙金電極具有大的表面積，良好的導電性和生物相容性，為捕獲大量的癌細胞提供了一個良好的平臺，有利于放大檢測信號，增強分析的靈敏度。
（2）利用多枝雜交鏈反應獲得的較長的具有多條分肢的多枝雜交鏈，為負載GQDs和AgNPs提供大量的活性位點，可以極大地提高分析檢測信號。
（3）利用AgNPs可以增強GQDs ECL發(fā)射的性能，在多枝雜交鏈上進一步沉積大量的AgNPs，促使GQDs獲得更高的ECL響應，進一步增強分析檢測的靈敏度。
（4）利用多重信號放大技術(shù)，構(gòu)建用于檢測癌細胞的超靈敏的ECL細胞傳感器，可以實現(xiàn)簡單、快速、準確地檢測癌細胞，在臨床癌癥的早期檢測、轉(zhuǎn)移及治療中具有重大的意義。
具體實施方式:
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例1: 超靈敏的ECL細胞傳感器在檢測MCF-7細胞中的應用
（1）在計算機上利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，將設(shè)計好的打印圖案通過蠟打印機打印在色譜紙上，然后將打印過的色譜紙放在烘箱中，在130 ℃加熱50秒使蠟融化并滲透整個色譜紙的厚度，形成疏水墻；
（2）在計算機上設(shè)計與步驟（1）中獲得的蠟打印圖案相匹配的工作電極、對電極和參比電極的印刷圖案，并利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在步驟（1）中獲得的蠟打印色譜紙上印刷碳工作電極、碳對電極和Ag/AgCl參比電極；
（3）利用原位生長法在步驟（2）中獲得的碳工作電極的工作區(qū)域生長三維花狀的金，首先合成金納米粒子：將90 mL二次水置于單口燒瓶中并加熱到90 ℃，然后加入0.8 mL 1% 氯金酸，繼續(xù)水浴加熱到96 ℃，待反應進行1 min后，再加入2.8 mL 1%檸檬酸鈉，在磁力攪拌下反應15 min，獲得酒紅色的溶液；取15 μL金納米粒子滴加到工作區(qū)域，在室溫下靜置反應50 min，用二次水洗滌除去多余的金納米粒子，取15 μL新鮮制備的氯金酸和抗壞血酸的混合溶液滴加到工作區(qū)域，所述的氯金酸的濃度為12 mM，抗壞血酸的濃度為100 mM，在室溫下生長30 min后，用二次水清洗工作區(qū)域并在室溫下自然干燥30 min；
（4）取10 μL伴刀豆球蛋白A滴到步驟（3）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，在室溫下孵化30 min，用pH 7.4 PBS洗滌除去多余的伴刀豆球蛋白A后，滴加10 μL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特異性結(jié)合位點，利用pH 7.4 PBS洗滌后，繼續(xù)滴加10 μL不同濃度的MCF-7細胞，在37 ℃下孵化40 min，隨后用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的MCF-7細胞；
（5）將AgNPs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，首先合成AgNPs：制備20 mL硝酸銀和檸檬酸鈉的混合溶液，所述的硝酸銀和檸檬酸鈉的濃度均為0.25 mM且摩爾比為1:1，在磁力攪拌作用下，向混合液中加入0.6 mL新鮮制備的濃度為10 mM硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌30秒，獲得AgNPs溶液；然后在H1和H2上連接AgNPs：將H1和H2在溶解于pH 5.0的三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽中，靜置處理1 h，隨后將活化的H1和H2用C18分離填充柱脫鹽，并進行冷凍干燥，然后將冷凍干燥后的H1和H2溶解在1 mL pH 7.6 HEPES中，獲得的H1和H2濃度均為10 μM且摩爾比為1:1，繼續(xù)加入500 μL AgNPs，緩慢地震蕩5 min后，加入15 μL 濃度為0.5 M，pH 3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化5 min，隨后繼續(xù)加入15 μL 濃度為0.5 M pH 3.0的檸檬酸鹽緩沖溶液，在室溫下孵化25 min后，用pH 7.6 HEPES將混合液調(diào)節(jié)至中性，并用pH 7.6 HEPES離心洗滌5次，獲得H1-Ag和H1-Ag；最后進行多枝雜交鏈反應：將上述獲得H1-Ag和H1-Ag溶解在1 mL TM中，然后用PTC-200熱循環(huán)儀在95 oC加熱10 min，并在30 s 內(nèi)冷卻到4 oC，隨后加入100 μL捕獲MCF-7細胞的適配體鏈和引物鏈的混合液，所述的捕獲MCF-7細胞的適配體鏈和引物鏈的濃度均為5 μM且摩爾比為1:1，最后將獲得的混合液在37 oC反應12 h，獲得AgNPs修飾的多枝雜交鏈；取10 μL上述獲得的AgNPs修飾的多枝雜交鏈滴加到步驟（4）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，在37 oC孵化30 min后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的多枝雜交鏈；
（6）將GQDs修飾在步驟（5）中獲得的多枝雜交鏈上，首先合成GQDs:稱取2 g 檸檬酸，至于25 mL的小燒杯中，放在烘箱中于200 oC加熱30 min，待冷卻至室溫后，用濃度為1000 M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，獲得黃棕色的GQDs溶液；然后取10 μL上述獲得GQDs溶液滴加到步驟（5）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，在室溫下孵化2 h后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的GQDs；
（7）在步驟（6）中獲得的多枝雜交鏈上沉積AgNPs，首先將10 μL包含硝酸銀和抗壞血酸的銀沉積溶液滴加到步驟（6）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，所述的硝酸銀的濃度為0.5 mM，抗壞血酸的濃度為0.25mM，在室溫下，黑暗處孵化5 min后，用pH 7.4 PBS洗滌除去未反應的溶液；
（8）在步驟（7）中獲得的紙芯片的工作區(qū)域，滴加10 μL包含0.1 M K2S2O8的pH 7.4 PBS，在電壓范圍為0 ~ -1.6V進行ECL信號檢測，光電倍增管電壓為800 V，繪制ECL強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現(xiàn)對癌細胞的檢測。
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agg 63
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