本發(fā)明涉及水產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法。

背景技術(shù)：

環(huán)己基氨基磺酸鈉俗稱(chēng)甜蜜素，易溶于水，是一種的低熱量人工合成甜味劑,不具有任何營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但其甜度可達(dá)到白糖50～60倍，同時(shí)兼?zhèn)溆兴L(fēng)味，以其低廉的價(jià)格和遠(yuǎn)超白糖的甜度，被廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、調(diào)味品、飲料、蜜餞等。近年來(lái)有關(guān)部門(mén)的市場(chǎng)流通食品監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)加工品中的環(huán)己基氨基磺酸鈉經(jīng)常被檢出。同時(shí)有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，環(huán)己基氨基磺酸鈉食用過(guò)量可能具有致癌性，在體內(nèi)會(huì)代謝為環(huán)己胺等，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)心血管系統(tǒng)和睪丸產(chǎn)生有毒害作用，因此在日本等國(guó)家的進(jìn)出口禁止列表里，已經(jīng)明確禁止環(huán)己基氨基磺酸鈉作食品添加劑來(lái)使用。我國(guó)食品添加劑相關(guān)的限量法規(guī)GB 2760中允許一定范圍內(nèi)的添加使用，故我國(guó)常因環(huán)己基氨基磺酸鈉遭遇技術(shù)壁壘，企業(yè)損失嚴(yán)重。

環(huán)己基氨基磺酸鈉檢測(cè)方法有紫外分光光度法、離子色譜法、氣相色譜法、液相色譜法等。其中，氣相色譜法是目前廣泛使用的方法，GB/T 5009.97-2003《食品中環(huán)已基氨基磺酸鈉的測(cè)定》其中第一法是氣相色譜法，此方法需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化步驟，前處理步驟繁瑣，使用大量的正己烷試劑，檢測(cè)效率較低。同時(shí)氣相色譜法中的衍生化也存在干擾現(xiàn)象，在分析富含蛋白、醇類(lèi)的基質(zhì)時(shí)，尤其是富含蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的水產(chǎn)加工品時(shí)，衍生化干擾較為嚴(yán)重，檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，不需要衍生，前處理步驟簡(jiǎn)單方便，大大縮短檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，包括如下步驟：

(1)樣品提取：稱(chēng)取5.00g樣品，置于50mL離心管中，加入20mL超純水，充分混合振蕩旋渦1min，然后超聲5min，離心，倒出上清液；殘?jiān)褂?5mL超純水重復(fù)上述操作提取、離心1次，合并上清液，準(zhǔn)確定容至50mL，得樣品提取液；

(2)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)：取樣品提取液1mL，經(jīng)0.22μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量，根據(jù)峰面積對(duì)環(huán)己基氨基磺酸鈉進(jìn)行定量。

作為優(yōu)選，步驟(1)中所述離心參數(shù)為：6000r/min離心5min。

作為優(yōu)選，液相色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，規(guī)格：2.1mm×50mm，粒徑1.7μm；流動(dòng)相：5mmol/L乙酸銨溶液-甲醇溶液；等度洗脫：流速0.3ml/min，柱溫40℃，樣品室溫度4℃，進(jìn)樣量10μL。

作為優(yōu)選，質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.5KV；錐孔電壓：40V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔氣流：50L/hr；碰撞電壓：30v；碰撞氣流量：0.22mL/min。

本發(fā)明的有益效果是：環(huán)己基氨基磺酸鈉在0.5-50ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.995以上，水產(chǎn)加工品樣品平均回收率在84％-107％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1％-8.2％之間，定量檢出限為0.01mg/kg，該方法高效、靈敏、準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是不同的流動(dòng)相色譜圖對(duì)比；注：1為5mM乙酸銨溶液-乙腈流動(dòng)相，2為5mM乙酸銨溶液-甲醇流動(dòng)相。

圖2是3種提取方式的比較。

圖3是標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖4空白樣品加標(biāo)色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，包括如下步驟：

(1)樣品提?。悍Q(chēng)取5.00g樣品，置于50mL離心管中，加入20mL超純水，充分混合振蕩旋渦1min，然后超聲5min，6000r/min離心5min，倒出上清液；殘?jiān)褂?5mL超純水重復(fù)上述操作提取、離心1次，合并上清液，準(zhǔn)確定容至50mL，得樣品提取液。

(2)液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)：取樣品提取液1mL，經(jīng)0.22μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量，根據(jù)峰面積對(duì)環(huán)己基氨基磺酸鈉進(jìn)行定量。

液相色譜條件為：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，規(guī)格：2.1mm×50mm，粒徑1.7μm；流動(dòng)相：5mmol/L乙酸銨溶液-甲醇溶液(40：60，V/V)；等度洗脫：流速0.3ml/min，柱溫40℃，樣品室溫度4℃，進(jìn)樣量10μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.5KV；錐孔電壓：40V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔氣流：50L/hr；碰撞電壓：30v；碰撞氣流量：0.22mL/min。

試驗(yàn)部分：

1材料與方法

1.1儀器與試劑

超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；高速離心機(jī)(德國(guó)貝克曼公司)；旋渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)；0.22μm濾膜(上海安譜)；超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

環(huán)己基氨基磺酸鈉(純度≥99％，德國(guó)DR.Ehrensotorfer)；乙酸銨(純度99％)；甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；娃哈哈超純水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1儀器參數(shù)

1.2.1.1液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，規(guī)格：2.1mm×50mm，粒徑1.7μm；流動(dòng)相：5mM乙酸銨溶液-甲醇(體積分?jǐn)?shù))溶液(40：60，V/V)；等度洗脫：流速0.3ml/min，柱溫40℃，樣品室溫度4℃，進(jìn)樣量10μL。1.2.1.2質(zhì)譜條件參數(shù)

離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描(ESI-)；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.5KV；錐孔電壓：40V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔氣流：50L/hr；碰撞電壓：30v；碰撞氣流量：0.22mL/min。

1.2.2樣品提取

稱(chēng)取5.00g(精確到0.01g)樣品，置于50mL離心管中，加入20mL超純水，充分混合振蕩旋渦1min，然后超聲5min，經(jīng)6000r/min離心5min，倒出上清液。殘?jiān)褂?5mL超純水重復(fù)提取、離心1次，合并上清液，準(zhǔn)確定容至50.0mL。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1mm×50mm 1.7μm，流動(dòng)相比較了5mM乙酸銨溶液-甲醇組合和5mM乙酸銨溶液-乙腈組合，流速0.3ml/min等度洗脫分析試驗(yàn)，兩種不同的流動(dòng)相色譜圖對(duì)比見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示當(dāng)流動(dòng)相洗脫條件為5mM乙酸銨溶液-甲醇時(shí)，環(huán)己基氨基磺酸鈉峰與基質(zhì)中干擾峰完全分離效果最佳，分離度和響應(yīng)最好。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于環(huán)己基氨基磺酸鈉是鈉鹽，所以選用電噴霧電離的負(fù)離子掃描模式，5.0mg/L的環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液不通過(guò)液相色譜柱分離，而直接使用質(zhì)譜自動(dòng)注射器直接進(jìn)樣，對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，由于環(huán)己基氨基磺酸鈉結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，因此在分析尋找特征離子時(shí)需要較高的碰撞電壓。在摸索質(zhì)譜條件時(shí)，環(huán)己基氨基磺酸鈉的特征離子只有m/z＝178.0，同時(shí)選擇特征離子峰只得到m/z＝79.8一個(gè)碎片離子。最終確定質(zhì)譜參數(shù)為負(fù)離子模式全掃描與選擇離子分析，毛細(xì)管電壓3.5KV，錐孔電壓40V，離子源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：380℃，脫溶劑氣流量600L/hr，錐孔氣流50L/hr，碰撞電壓30v，碰撞氣流量0.22mL/min。得到特征離子峰[M-Na]-，選擇特征離子峰(定量離子和定性離子為同一個(gè))見(jiàn)表1。

表1環(huán)己基氨基磺酸鈉定量與定性離子信息

2.3提取方式的選擇

由于水產(chǎn)品樣品較為復(fù)雜，不同的提取方式對(duì)試驗(yàn)結(jié)果會(huì)有較大影響。本試驗(yàn)選用漩渦震蕩提取、超聲波提取和前兩者混合提取方式對(duì)水產(chǎn)加工品樣品中環(huán)己基氨基磺酸鈉進(jìn)行提取，每個(gè)提取方式做3個(gè)相同的樣品。試驗(yàn)結(jié)果表明，漩渦震蕩提取和超聲波提取相結(jié)合進(jìn)行提取，提取效果最佳，回收率最好，見(jiàn)圖2。因此選擇漩渦震蕩提取和超聲波提取混合提取作為樣品提取方式。

2.4線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度

配制環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為0.5、1.0、2.0、10、20、50ng/mL，在1.2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖3。以峰響應(yīng)為y值，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x值繪制曲線。線性關(guān)方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(S/N＝3)見(jiàn)表2。

選取不含有環(huán)己基氨基磺酸鈉的水產(chǎn)加工品(香酥小黃魚(yú))，分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，做6次平行，按照1.2.1和1.2.2進(jìn)行樣品前處理和色譜測(cè)定，計(jì)算回收率與精密度，結(jié)果見(jiàn)表2，空白樣品加標(biāo)色譜圖4。

表2線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度(n＝6)

3結(jié)論

水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定，無(wú)論采用氣相譜法還是液相色譜法，繁瑣的衍生化步驟必不可少。本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)加工品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的方法，水產(chǎn)加工品樣品經(jīng)超純水提取，離心定容，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定檢測(cè)，前處理步驟簡(jiǎn)單方便，大大縮短檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率，現(xiàn)已應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中，取得了良好的效果，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

利用本發(fā)明的方法檢測(cè)水產(chǎn)品加工品50份，包括頭足類(lèi)加工品10份、蝦類(lèi)加工品20份和魚(yú)類(lèi)加工品20份，其中3份檢測(cè)出環(huán)己基氨基磺酸鈉：頭足類(lèi)加工品中燒烤魷魚(yú)仔、魚(yú)類(lèi)加工品中香酥小黃魚(yú)和烤鰻，測(cè)得值分別為0.12g/kg，0.45g/kg,0.31g/kg，其余47份產(chǎn)品中均未檢出環(huán)己基氨基磺酸鈉。同采用GB/T5009.97-2003的方法檢測(cè)結(jié)果一致。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。