使用時空轉(zhuǎn)換的成像流式細胞儀的制作方法
相關申請的交叉引用
本專利文件要求于2014年9月30日提交的標題為“使用時空轉(zhuǎn)換的成像流式細胞儀(imagingflowcytometerusingspatial-temporaltransformation)”的美國臨時專利申請第62/057,799號的權益和優(yōu)先權。將上述專利申請的全部內(nèi)容通過引用并入作為本申請公開內(nèi)容的一部分。
本專利文件涉及流式細胞術系統(tǒng)、裝置和過程。
背景
流式細胞術是一種用于測量和表征單個顆?；蚣毎募夹g。流式細胞儀可以包括與光學器件和/或電子器件耦合的流體系統(tǒng)，以分析移動通過流體系統(tǒng)的顆?；蚣毎奶匦?。
概述
描述了對通過流式細胞儀檢測到的信號進行時空轉(zhuǎn)換，以在流式細胞術中提供單個顆?；蚣毎膱D像的技術、系統(tǒng)和裝置。
在一個方面，用于在流式細胞術中使顆粒成像的方法包括：在攜帶含有顆粒的流體樣品的流體通道傳輸光束，使得所述光束被所述顆粒散射或引起來自所述流體通道中所述顆粒的熒光發(fā)射；在空間濾光器接收散射的光或熒光發(fā)射的光，所述空間濾光器包括具有多個孔的表面，所述孔以沿著與顆粒流相反的橫向方向和與顆粒流平行的縱向方向的模式布置，使得流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光；基于來自所述攜帶流體樣品的流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，編碼包括所述顆粒的時空信息的光信號；通過光檢測器檢測編碼的光信號；以及在與所述光檢測器通信的數(shù)據(jù)處理單元處理檢測到的光信號，以產(chǎn)生與流過所述流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括所述顆粒的物理特征的信息。
在一個方面，成像流式細胞儀系統(tǒng)包括：流體裝置，其被構造成包括基板和設置在所述基板上以沿著顆粒流方向攜帶含有顆粒的流體樣品的流體通道；光源，其用于在所述流體通道產(chǎn)生光束以照射所述流體樣品，其中當被所述光束照射時，光被所述顆粒散射或引起來自所述顆粒的熒光發(fā)射；光檢測器，其被布置在散射的光或熒光發(fā)射的光的光路中；濾光器，其位于所述光檢測器的成像平面，并且被構造成包括具有多個孔的表面，所述孔以沿著與所述顆粒流方向相反的橫向方向和與所述顆粒流方向平行的縱向方向的模式布置，使得流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光，其中所述濾光器可操作以基于來自所述攜帶流體樣品的流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，編碼包括所述顆粒的時空信息的光信號，使得編碼的光信號通過所述光檢測器被檢測到；以及與所述光檢測器通信的數(shù)據(jù)處理單元，所述數(shù)據(jù)處理單元處理所述編碼的光信號以產(chǎn)生與流過所述流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括所述顆粒的物理特征的信息。
在一個方面，用于編碼來自在流體通道中流動的顆粒的光信號的空間濾光器包括具有多個孔的基板，所述孔以沿著與在所述流體通道中流動的顆粒的顆粒流方向相反的橫向方向和與在所述流體通道中流動的顆粒的顆粒流方向平行的縱向方向的模式布置，其中所述空間濾光器可操作，以便當位于光束照射的所述流體通道的照射區(qū)域與光檢測器之間的光路時，編碼來自在所述流體通道中流動的顆粒的光信號，其中所述空間濾光器位于所述光檢測器的成像平面，其中所述空間濾光器可操作以便基于流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光，來編碼所述光信號，其中基于來自所述流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，所述編碼的光信號包括所述顆粒的時空信息。
本專利文件中描述的主題可以以提供以下特征中的一種或多種的具體方式實施。例如，本公開的系統(tǒng)、裝置和方法包括設計的空間濾光器和信號處理技術，以提供流式細胞儀成像能力。例如，本公開的技術可以提供在流式細胞儀中快速移動細胞的高品質(zhì)圖像，其為使用例如，能夠以與現(xiàn)有細胞儀完全兼容的方式獲得高通量的光電倍增管(pmt)檢測器獲得的，且可以采用所述光電倍增管(pmt)檢測器代替常規(guī)ccd或許多成像系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的任何百萬像素相機?？梢詰帽竟_的技術來將傳統(tǒng)的流式細胞儀以最低成本改造成成像流式細胞儀。使用本公開技術的示例性實施結果顯示，在微流體通道中以0.2m/s的速度行進的細胞的成像，對應于大約1，000個細胞/秒的通量。
附圖簡述
圖1a和1b顯示本公開技術的示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)的原理圖。
圖1c顯示成像流式細胞儀系統(tǒng)的示例性電子系統(tǒng)的框圖。
圖2a和2b顯示由光電倍增管(pmt)信號復原細胞圖像的數(shù)據(jù)圖和圖解。
圖3a-3c顯示呈現(xiàn)基于空間濾光器的流式細胞術成像和寬場熒光成像的比較的數(shù)據(jù)圖。
圖4顯示來自本公開的基于空間濾光器的成像流式細胞術的反向散射細胞圖像的示例性數(shù)據(jù)。
圖5a顯示成像流式細胞儀系統(tǒng)的示例性實施的費雷特(feret’s)直徑(也被稱為最大卡尺)的直方圖。
圖5b顯示圖5a的直方圖中，2μm至15μm的每個接收器(bin)的兩個示例性反向散射圖像。
圖6顯示使用相移空間濾光器(pssf)描述本公開技術的示例性成像流式細胞儀的圖解。
圖7顯示描述使用配置有調(diào)頻的空間濾光器的本公開技術的示例性成像流式細胞儀的圖解。
圖8顯示在通過示例性成像流式細胞術系統(tǒng)實施的流式細胞術中，以多色細胞成像為特征的示例性數(shù)據(jù)的圖像。
圖9顯示來自由本技術的示例性成像流式細胞術系統(tǒng)產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)的多功能輸出的原理圖。
圖10顯示通過將空間濾光器應用至常規(guī)流式細胞儀來呈現(xiàn)本技術的示例性成像流式細胞儀的設計和輸出的圖解和圖像。
圖11顯示使用空間頻率濾光器來復原細胞熒光圖像的呈現(xiàn)本技術的示例性成像流式細胞儀的設計和輸出的圖解和圖像。
圖12顯示可以并入具有最大兼容性的常規(guī)流式細胞儀中的多路復用空間頻率濾光器的示例性設計。
詳述
流式細胞術可以用于當細胞在液流中流動通過激發(fā)光束時，分析大量單細胞的多種物理特征。在一些應用中，流式細胞儀測量熒光和光散射，由其獲得關于單細胞的生物性質(zhì)和物理性質(zhì)的信息。雖然流式細胞儀由于其單細胞分辨率和高通量而具有大量統(tǒng)計的功效，但它們不能產(chǎn)生通過其它表征如顯微鏡提供的關于細胞形態(tài)或空間分辨率的信息。測定細胞形態(tài)和/或空間分辨率的能力將是流式細胞儀中有價值的特征。本公開的技術提供具有細胞成像能力的流式細胞儀。
描述了對通過流式細胞儀檢測到的信號進行時空轉(zhuǎn)換，以在流式細胞術中提供單個顆?；蚣毎膱D像的技術、系統(tǒng)和裝置。
本公開的技術包括使用設計的空間濾光器和數(shù)據(jù)處理技術，以提供流式細胞儀成像能力。例如，本公開的技術可以提供在流式細胞儀中快速移動的細胞的高品質(zhì)圖像，其為使用例如，能夠以與現(xiàn)有細胞儀完全兼容的方式獲得高通量的光電倍增管(pmt)檢測器獲得的，并且可以采用所述光電倍增管(pmt)檢測器代替常規(guī)ccd或許多成像系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的任何百萬像素相機?？梢詰帽竟_的技術來將傳統(tǒng)的流式細胞儀以最低成本改造成成像流式細胞儀。使用本公開技術的示例性實施結果顯示在微流體通道中以0.2m/s的速度行進的細胞的成像，對應于大約1,000個細胞/秒的通量。
本技術的背景和介紹
細胞成像和高通量單細胞分析是一些用于研究細胞和分子生物學以及醫(yī)學的基本技術。顯微鏡被認為是生物學和醫(yī)學中重要的成像工具，并且能夠產(chǎn)生帶有非凡細節(jié)的細胞圖像，例如，如來自細胞的具體大分子、細胞器或亞基的熒光圖像。然而，顯微鏡經(jīng)由相對低通量的成像產(chǎn)生信息?？紤]到生物對象如癌細胞和經(jīng)歷生命周期的不同階段的細胞的多樣化性質(zhì)，從非常大的細胞群(例如，數(shù)千至數(shù)百萬)的個體特性可以實現(xiàn)對細胞和組織特性的很大改進的理解。顯微鏡技術的有限通量已經(jīng)成為研究生物樣品的多樣化特性的障礙。
流式細胞術是支持非常高的通量分析的強大工具，使得能夠以數(shù)百個細胞/秒至超過100,000個細胞/秒的速度檢測單細胞特性。當液流中的每個細胞流動通過被光束如激光束照射的光學探詢區(qū)的區(qū)域時，流式細胞儀可以測量和分析細胞的多個物理參數(shù)，其包括細胞的相對大小、細胞核粒度和來自特定標志物或成分的熒光。然而，常規(guī)流式細胞儀不產(chǎn)生空間分辨率，因為顯微鏡不允許詳細研究在許多應用中所需要的細胞特性。作為說明性類比，流式細胞儀可以從一大群人中快速地區(qū)分男性和女性，而不能識別每個個體的面部特征，反之成像細胞儀可以揭示每個人的詳細面部特征，但不能對大量需要被研究的人足夠快地執(zhí)行該功能。
盡管有以上約束，但由于流式細胞儀的高通量、單細胞分辨率和與細胞分選能力的兼容性，流式細胞儀已經(jīng)被廣泛地用于生物醫(yī)學研究，并且在臨床中發(fā)揮越來越大的作用。然而，沒有高空間分辨率(其含有對診斷和細胞分析至關重要的有價值的表型和形態(tài)學信息)是當前流式細胞術技術的缺點，并且提供了將成像能力并入流式細胞術的強烈動機。流式細胞術可以從成像能力中獲益，該成像能力將以高通量區(qū)分在流體通道中探詢的顆?；蚣毎奶匦?。
迄今為止，在該領域中唯一成功的努力是amnis/millipore研發(fā)的成像流式細胞儀(例如，imagestream)。與所有其它流式細胞儀顯著不同，amnis流式細胞儀依賴于具有大量像素的時間延遲和積分(tdi)高速電耦合裝置(ccd)相機，與利用光電倍增管(pmt)的高速和極好靈敏度的幾乎全部現(xiàn)今的流式細胞儀中使用的pmt不同。amnis系統(tǒng)比常規(guī)流式細胞儀昂貴地多，并且由于其獨特的操作要求和光學設計，尚未準備好整合細胞分選功能。因此，盡管流式細胞儀中強烈渴望這種吸引人的特征，但僅非常小數(shù)目(例如＜5％)的現(xiàn)今部署的流式細胞儀獲得成像能力。
本公開的技術包括為流式細胞儀提供成像能力的時空轉(zhuǎn)換技術。在一些實施方式中，例如，將特別設計的空間濾光器放置在流式細胞儀中的pmt檢測器的前面，以產(chǎn)生熒光或散射信號的時間波形。由空間濾光器編碼的該波形含有映射細胞信號的空間分布所需的所有信息，從而允許從時域波形構建細胞圖像。示例性設計與常規(guī)流式細胞儀的現(xiàn)有光學設計兼容，并且可以被容易地實施以使常規(guī)流式細胞儀以最低成本升級成為具有細胞成像能力的流式細胞儀。本文中實施并描述了本公開技術的示例性實施方式，其顯示本技術的示例性流式細胞儀裝置中a549人肺腺癌上皮細胞的單細胞圖像(例如，圖1a所示)。在此類實例中，細胞的流速為0.2m/s，對應于大約1，000個細胞/秒的通量。本公開的技術優(yōu)于現(xiàn)有的百萬像素成像裝置。例如，現(xiàn)今幾乎所有成像系統(tǒng)采用的基于ccd或cmos的技術需要相對長的積分時間(或曝光時間)來逐幀捕獲圖像，因此對高速行進的成像細胞具有速度限制。
在一個方面，在流式細胞儀中使顆粒成像的方法包括：在流體通道傳輸光束以照射含有顆粒的流體樣品，以影響由空間布置在流體通道附近的孔的模式接收的光(例如，散射或發(fā)射)，其中孔的模式包括被構造成形成布置在基板上的多個狹縫的基板，使得流過所述模式的孔的顆粒的不同部分將在不同時間通過不同的狹縫，并且散射光束以產(chǎn)生光散射信號或發(fā)射光(例如，熒光發(fā)射)以產(chǎn)生光發(fā)射信號，基于孔的模式來編碼來自光散射或發(fā)射信號的光信號，其中編碼的波形包括顆粒的空間和時間信息，以及檢測編碼的光信號以產(chǎn)生與所述顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)。
本技術的示例性實施方案
公開了本技術的成像流式細胞儀裝置、系統(tǒng)和方法的示例性實施方案。圖1a和1b顯示示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)100的圖解。系統(tǒng)100包括：含有微流體裝置或芯片101的流體系統(tǒng)，用于將細胞引入流體通道(例如，具有微米級尺寸的微流體通道)；光學系統(tǒng)，用于光信號的照射和檢測；以及電子系統(tǒng)120，用于數(shù)據(jù)采集和處理。成像流式細胞儀系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)包括：二向色鏡(dm)112、空間濾光器(sf)111、光源發(fā)射器(例如，激光)116；和一個或多個與電子系統(tǒng)120電連通的光電倍增管(pmt)114。
如圖1a的實例中所示，成像流式細胞術系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)被配置成，使得光源發(fā)射器116可操作以便在二向色鏡112b發(fā)射光，所述二向色鏡112b引導在微流體裝置101的流體通道中照射區(qū)域的光。例如，光源116可以包括激光，例如，半導體激光二極管或hg-arc燈，以及其它光源。成像流式細胞術系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)被配置成，使得空間濾光器111被布置在來自微流體裝置101的照射區(qū)域的反射光的光路中，以接收來自樣品的發(fā)射和/或散射光(例如，熒光發(fā)射和反向散射光)，以及基于空間濾光器111的開口模式來編碼所接收的光。在一些實施方式中，例如，光學系統(tǒng)可以包括物鏡117，其被配置在接收來自微流體裝置101的照射區(qū)域的反射光的光路中，以使反射光聚焦在空間濾光器111上。編碼的光從空間濾光器111傳遞至第二dm112a，其將在一個或多個光路中的編碼的光引導朝向?qū)拡鰺晒怙@微鏡配置中的pmt或多個單獨的pmt。在圖1a中示出的示例性實施方案中，第一pmt114a被布置在第一光路以接收在流體通道中流動的顆粒的熒光發(fā)射，以及第二pmt114b被布置在第二光路以接收在流體通道中流動的顆粒的反向散射信號。例如，成像流式細胞術系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)可以包括：在第一光路中的發(fā)射濾光器113和第一透鏡115a，以過濾編碼的熒光并使其聚焦至pmt114a中，以及在第二光路中的第二透鏡115b，以使編碼的反向散射光聚焦至pmt114b中。
圖1b顯示微流體裝置101的原理圖，所述微流體裝置101包括流體通道，在該流體通道中，懸浮的細胞或顆粒在通過鞘流控制的流體中被攜帶，從而在流體通道的中央勻速行進。微流體裝置101被構造成包括基板105，其上設置有流體通道以攜帶含有顆粒(例如，細胞)的流體樣品。在一些實施方式中，例如，基板105可以包括基板基底和與所述基底連接的整塊材料，其中所述整塊材料包括從與基底接觸的表面切出的流體通道。例如，基板可以包括聚二甲硅氧烷(pdms)材料。在一些實施方式中，例如，所述整塊材料可以包括pdms，且基板基底可以包括玻璃或其它剛性電絕緣材料以支承具有通道的整塊材料。在一些實施方式中，流體通道被構造成具有比微米級(例如，毫米)大的寬度和/或高度尺寸；然而在其它實施方式中，流體通道被構造成具有微米級(例如，微米)或更小(例如，納米)的寬度或高度尺寸。例如，以下實例將流體通道稱作微流體通道。在一些實施方式中，如圖1b的圖解中所示，微流體通道源于多個通道，例如，包括接收和攜帶含有顆粒的流體樣品的通道，以及一個或多個鞘通道。微流體裝置101的微流體通道被構造成傳輸由成像流式細胞術系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)接收的探測光，例如，如從激光116接收的激光。在一些實施方案中，例如，空間濾光器111可以被配置在照射區(qū)域的通道上方的微流體裝置101上。
空間濾光器111形成包含被布置成相對于微流體通道光學對準的開口模式的掩模。開口模式基于通過微流體通道傳輸?shù)奶綔y光和空間濾光器111的模式設計來編碼波形，來自其的波形可以使用本技術的數(shù)據(jù)處理技術進行解碼，以(i)光學檢測微流體通道中顆粒的物理特征(例如，位置、尺寸等)，以及(ii)形成包含該物理特征的顆粒的圖像。系統(tǒng)100的空間濾光器111的示例性空間濾光器設計，顯示在圖1a的圖解的右邊。空間濾光器的圖示描述一種設計的空間濾光器設計，其具有在x-方向(橫向于流動方向)和y-方向(縱向于流動方向)以一個緊接另一個的方式分開放置的10個100μm×1mm的狹縫。例如，圖1a中示出的示例性狹縫的100μm尺寸在x-方向；以及狹縫的1mm尺寸在y-方向。x-和y-方向被標記在圖1b中。可選地，例如，空間濾光器111可以在狹縫串聯(lián)的前面分別在x-和y-方向具有兩個100μm×1mm的狹縫，其中該示例性空間濾光器設計可以應用于精確計算每個細胞的細胞行進速度。在一個實例中，每個狹縫可以被配置成在縱向和橫向尺寸上分別具有特定的長度和寬度，使得每個狹縫定位于緊接其相鄰狹縫的縱向和橫向坐標以外的空間濾光器。在另一實例中，空間濾光器111可以包括開口模式，其中至少兩個開口具有相對于穿過微流體通道的流體流動方向的變化的縱向和橫向尺寸(例如，對角線)，使得編碼的波形攜帶包括顆粒在兩個維度中的位置信息。一些這樣的實例顯示在美國專利第9,074,978號中，將其通過引用整體并入作為本專利文件公開內(nèi)容的一部分。
圖1c顯示成像流式細胞儀系統(tǒng)100的示例性電子系統(tǒng)120的框圖。電子系統(tǒng)120包括數(shù)據(jù)處理和通信單元125，其包括處理器121(例如，如中央處理單元(cpu)或微控制器)，以處理通過成像流式細胞儀系統(tǒng)100的光學系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理和通信單元125包括與處理器121通信的存儲和/或緩沖數(shù)據(jù)的存儲器122。數(shù)據(jù)處理和通信單元125包括與處理器121通信的輸入/輸出(i/o)單元123，其提供與典型數(shù)據(jù)通信標準兼容的有線和/或無線接口(也被稱為通信接口)，用于將該計算機與其它計算機和計算機系統(tǒng)或外部接口、數(shù)據(jù)存儲源或顯示設備(例如，如圖1c中示出的顯示設備124)等通信。例如，存儲器122可以包括處理器可執(zhí)行代碼，其在由處理器121執(zhí)行時配置數(shù)據(jù)處理和通信單元125以進行各種操作，如接收信息、命令和/或數(shù)據(jù)，處理信息和數(shù)據(jù)，以及向另一實體或向用戶傳輸或提供信息/數(shù)據(jù)。例如，i/o單元123可以包括使用以下標準通信接口中的一個或多個來提供有線或無線通信的收發(fā)器，所述標準通信接口例如，包括但不限于：通用串行總線(usb)、ieee1394(firewire)、藍牙、藍牙低功耗(ble)、zigbee、ieee802.11(wi-fi)、無線局域網(wǎng)(wlan)、無線個人局域網(wǎng)(wpan)、無線廣域網(wǎng)(wwan0、wimax、ieee802.16(全球互通微波存取(wimax))、3g/4g/5g/lte蜂窩通信方法和并行接口等。在系統(tǒng)100的一些實施方式中，例如，數(shù)據(jù)處理和通信單元125可以與光學系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)通信，以存儲和管理與光學系統(tǒng)的操作相關的數(shù)據(jù)，例如，如參數(shù)、設置等。
在圖1a的成像流式細胞儀的示例性操作中，例如，將懸浮顆粒(例如，細胞)引入微流體通道，并通過鞘流在流體動力學上聚焦，例如，確保細胞在流體通道的中心勻速行進。來自樣品的熒光發(fā)射和反向散射光由寬場熒光顯微鏡配置中兩個單獨的pmt檢測。在該示例性操作中，細胞在微流體裝置的微流體通道中流動，例如，微流體裝置可以由結合至玻璃基底的軟模制pdms制成。為了適應微流體裝置的幾何形狀，通過放置在50×物鏡前面的微型45度二向色鏡(dm)(na＝0.55，工作距離＝13mm)，將激光束引入流體通道中的光學探詢位置。45度二向色鏡的尺寸足夠小，以允許反向散射光(相對于正常入射光147°至168°)繞過二向色鏡并進入物鏡。將本公開的空間濾光器，例如，如具有圖1a中示出的模式的sf，插入在光學系統(tǒng)的圖像平面處的檢測路徑中。來自行進細胞(或顆粒)的熒光和反向散射光均由物鏡收集，并通過濾光器，然后到達它們各自的pmt檢測器。另一個二向色鏡(dm)通過其光譜分離光，以將期望的發(fā)射頻帶按路線發(fā)送至適當?shù)膒mt。每個pmt的輸出被發(fā)送到計算機系統(tǒng)并被處理，以由熒光和反向散射生成細胞圖像。雖然圖1a中描述的示例性系統(tǒng)僅顯示一個用于熒光信號檢測的pmt，但應理解可以添加更多的pmt，以及如果必要的話，更多的激發(fā)激光束，以產(chǎn)生如在任何常規(guī)流式細胞儀中的多色熒光信號。
從光強度分布復原細胞圖像。本公開的技術包括對檢測到的信號進行時空轉(zhuǎn)換的技術，其可以以下述關系表示：
s(t)＝∫x，y細胞(x，y-mvt)·f(x，y)·i(x，y)dxdy(1)
其中s(t)是測量的pmt信號，“細胞”是二維細胞(或顆粒)熒光或散射強度分布，f(x，y)是空間濾光器的特征函數(shù)，i(x，y)是激光照射的強度分布，y是細胞行進方向，x是橫向方向，以及m是與流式細胞儀有關的光學系統(tǒng)的放大因數(shù)。
當細胞(或顆粒)在微流體通道中以速度或速度v行進時，投射到空間濾光器上的圖像以有效速度mv行進。為簡化求解方程式(1)中細胞的數(shù)學過程，例如，f(x，y)可以被選擇為方程式(3)中代表的一系列矩形函數(shù)，以及i(x，y)可以被選擇為來自均勻強度的激光束的常數(shù)。
其中x＝1，2，...，n是空間濾光器中的行數(shù)，l是傳輸熒光或散射光的矩形狹縫的長度。例如，方程式(1)可以被改寫為：
例如，可以通過使用方程式(3)的時間導數(shù)求解“細胞”
假設細胞方向在如此短的時間間隔內(nèi)不變化，方程式(4)可以表示為如下：
為獲得方程式5，使用的是y′＝y(tǒng)-mvt。當細胞大小未超過狹縫長度l時，在特定的時間間隔內(nèi)
檢測到的光信號包括基于顆粒通過通道時在每個狹縫的特定時間和空間位置的編碼信息。由于成像流式細胞儀系統(tǒng)100可以測量微流體裝置101的微流體通道中流動的顆粒的速度(v)，已知光學系統(tǒng)(m)的放大倍數(shù)，以及基于預定狹縫的幾何形狀已知狹縫的特征函數(shù)f(x，y-mvt)，可以通過用已知的特征函數(shù)f(x，y-mvt)對測量的信號進行去卷積來計算顆粒(例如，生物細胞)上每個點產(chǎn)生的信號。計算的來自顆粒(例如，細胞)的“局部化信號”基本上是顆粒的“圖像”。例如，如果測量的信號來自光散射，則信號處理之后的重構圖像是“散射圖像”，其中“亮區(qū)域”是最強散射效率的區(qū)域。例如，如果測量的信號由熒光(例如，熒光標記的蛋白)產(chǎn)生，則重構圖像是“熒光圖像”，顯示標記蛋白的局部分布和濃度分布。例如，如果熒光標記的蛋白是膜蛋白，則圖像的輪廓給出的是細胞形狀和大小。另一方面，如果細胞核被熒光標記，則構建的圖像變成細胞核的圖像。通過實施本技術的數(shù)據(jù)(圖像)處理方法，可以產(chǎn)生所有這些不同類型的圖像，其代表這些顆粒(例如細胞)的不同性質(zhì)，并且這些產(chǎn)生的圖像也可以被疊加以產(chǎn)生流動顆粒(例如，細胞)的高信息含量的圖像。
在一些實施方案中，例如，數(shù)據(jù)處理方法包括在至少兩個維度上確定顆粒的位置或速度。數(shù)據(jù)處理方法包括確定空間濾光器的特征函數(shù)(例如，f(x，y-mvt))，其中所述特征函數(shù)包括與模式的孔的尺寸和布置相關的參數(shù)。數(shù)據(jù)處理方法包括確定與顆粒的一個或多個部分(例如，細胞區(qū)域)相關的局部信號，以產(chǎn)生與顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)。例如，數(shù)據(jù)處理方法可以通過使用確定的特征函數(shù)對顆粒信號進行去卷積來確定局部信號數(shù)據(jù)，其中顆粒信號包括所檢測到的光信號、所確定的位置或速度、在空間濾光器聚焦所接收的發(fā)射和/或散射光的光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)。
通常，空間濾光器被設計成使得在圖像平面處，來自顆粒(例如，細胞)的不同部分的熒光將在不同時間通過不同的狹縫。因此，來自pmt的熒光信號的波形包括在時域中分離的模式序列，并且時域中信號的每個部分對應于細胞(或顆粒)的每個特定狀態(tài)(regime)產(chǎn)生的熒光(發(fā)射和/或散射)信號。在接收每個狹縫上的光強度分布之后，可以通過將所有的分布拼接在一起構建整個細胞的細胞圖像。
在一些實施方式中，例如，細胞圖像構建的數(shù)據(jù)處理技術可以包括以下表達式：
其中i是構建的細胞圖像的行數(shù)，j是列數(shù)，n是來自一行的pmt信號的數(shù)字采樣點的數(shù)目，si(t)是代表細胞的第i行的光強度的pmt信號，以及細胞i(j)是對應于測試中細胞的第i行和第j列的光強度。
例如，在系統(tǒng)100中采用50×物鏡(m＝50)的實施方式中，濾光器設計允許使用方程式(6)中所述的本公開數(shù)據(jù)處理算法構建20μm×20μm的行進細胞的熒光或散射圖像。本公開技術的數(shù)據(jù)處理技術提供最小量的計算，并且適合于高通量、基于實時圖像的細胞分類和分選。
本技術包括在流式細胞儀中使顆粒(例如，細胞)成像的高通量、實時方法，其可以被用于顆粒或細胞分類和/或分選。該方法可以包括將含有顆粒(例如，細胞)的流體樣品轉(zhuǎn)移到流體裝置(例如，裝置101)的流體通道中。該方法包括在攜帶含有顆粒(例如，細胞)的流體樣品的流體通道傳輸來自光發(fā)射器(例如，激光116)的光束，使得光束受到流體通道中顆粒的影響(例如，散射)和/或影響流體通道中的顆粒(例如，引起其熒光發(fā)射)。該方法包括在空間濾光器(例如，空間濾光器111)接收散射或熒光發(fā)射的光(例如，通過經(jīng)由物鏡117的聚焦)。例如，空間濾光器包括具有預定幾何形狀并且布置在空間濾光器上的多個孔(例如，狹縫)的表面，其中孔的模式沿著與顆粒流相反的橫向方向和與顆粒流平行的縱向方向，使得流過孔的模式的顆粒(例如，任何顆粒)的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光，例如，其可以產(chǎn)生攜帶關于顆粒信息的光散射或發(fā)射信號。該方法包括基于來自攜帶流體樣品的流體通道的至少一些所接收的散射光，來編碼包含所述顆粒的時空信息的光信號。該方法包括通過光檢測器(例如，一個或多個pmt114)檢測編碼的光信號。該方法包括處理檢測到的光信號以產(chǎn)生與流過流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括顆粒的物理特征的信息。例如，在確定的圖像數(shù)據(jù)中顆粒的物理特征可以包括：顆粒的尺寸(例如，至少兩個維度)、顆粒的空間特征或幾何形狀(例如，至少兩個維度)、顆粒的內(nèi)部特征或結構的位置和/或濃度(例如，至少兩個維度)，例如細胞器，如細胞核、線粒體或細胞中的寄生物質(zhì)(例如，病毒、毒素或其它非天然物質(zhì))。
所述方法的實施方式可以包括以下特征中的一種或多種。在一些實施方式中，例如，所述方法還包括基于所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)形成顆粒的圖像，其中所述圖像包括顆粒的物理特征的視覺呈現(xiàn)。在所述方法的一些實施方式中，例如，隨著顆粒在流體通道中流動，處理檢測到的光信號是實時的。在所述方法的一些實施方式中，例如，處理檢測到的光信號包括：在至少兩個維度上確定顆粒的位置或速度；確定空間濾光器的特征函數(shù)，所述特征函數(shù)包括與模式的孔的尺寸和布置相關的參數(shù)；以及通過用確定的特征函數(shù)對顆粒信號進行去卷積，來確定與顆粒的一個或多個部分相關的局部信號以產(chǎn)生與顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中顆粒信號包括所檢測到的光信號、所確定的位置或速度、在空間濾光器聚焦所接收的散射的光或熒光發(fā)射的光的光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)。在一些實施方式中，例如，所述方法還包括基于顆粒的確定的物理特征分選顆粒。例如，在所述方法的一些實施方式中，孔的模式包括兩個或更多個分開放置的狹縫，使得相對于流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)和與所述縱向方向垂直的橫向方向(x-方向)，相鄰狹縫位于狹縫的覆蓋區(qū)之外。例如，在所述方法的一些實施方式中，孔的模式包括10個100μmx1mm的狹縫。例如，在所述方法的一些實施方式中，孔的模式包括狹縫組，其中每組狹縫包括三個平行的狹縫陣列，其在流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)為移動的、空間分開的和非重疊的。例如，在所述方法的一些實施方式中，光束包括激光束。例如，在所述方法的一些實施方式中，光檢測器包括光電倍增管(pmt)。例如，在所述方法的一些實施方式中，光檢測器包括多個pmt，其中編碼的光信號被分離成對應于多個pmt的多個光路。
示例性實施方式
通過模擬和實施來進行示例性實施方式以證明該方法，其中細胞圖像被用作測試中的細胞，并且細胞以0.24m/s的速度行進通過照射光束斑點。圖2a和2b顯示由pmt信號復原細胞圖像的數(shù)據(jù)圖和圖解。圖2a顯示示例性模擬結果：時域光強度信號、用于模擬的原始細胞圖像和對應的復原圖像。圖2a中示出的示例性比例尺是5μm。通過空間濾光器上狹縫的熒光，以500khz的速率被采樣。例如，原始細胞圖像、以及通過空間濾光器的時域輸出信號和使用示例性數(shù)據(jù)處理技術和算法復原的細胞圖像顯示于圖2a中。與原始細胞圖像相比，例如，來自模擬的復原圖像顯示相同的特征。注意，例如，復原的圖像包括約1.5μm的分辨率，并且圖像模糊主要是由于采樣率限制和光衍射。
在示例性實施方式中，一旦將細胞注入微流體通道中，在圖像平面插入雙狹縫濾光器以確定細胞行進速度，然后應用上述空間濾光器。通過閾值化pmt讀出捕獲每個細胞的時域信號。圖2b顯示示例性實驗結果：來自用celltracecfse染色的a549細胞的熒光的時域pmt輸出信號，以及通過分割和拼接光強度分布來復原的熒光圖像。尺寸標注在圖中。圖2b顯示典型的pmt信號的實驗結果和使用方程式(6)由pmt信號構建的熒光細胞圖像。例如，x-(橫向)方向上復原的圖像的空間分辨率取決于空間濾光器上狹縫的數(shù)目，以及y-(細胞行進)方向上復原的圖像的空間分辨率取決于采樣率和細胞流速。在該示例性實施方式中，例如，使用50×/0.55na物鏡、用于獲取pmt信號的500khz采樣率和0.2m/s的細胞行進速度，y-方向上像素的有效尺寸確定為0.4μm(例如，
所述成像流式細胞儀系統(tǒng)僅使用單個pmt代替像素化ccd就能進行快速熒光成像。
圖3a-3c顯示呈現(xiàn)基于空間濾光器的流式細胞術成像和寬場熒光成像的比較的數(shù)據(jù)圖。在這些示例性數(shù)據(jù)中，所有圖像均為用celltracecfse染色的a549人肺腺癌上皮細胞。圖3a描述代表以20cm/s的速度流動的細胞的示例性成像流式細胞儀重構的熒光圖像的數(shù)據(jù)圖。圖3b描述代表靜止的a549細胞的寬場熒光圖像的數(shù)據(jù)圖。圖3c顯示代表性靜止的a549細胞的共聚焦顯微鏡圖像，例如，其中使用的物鏡為63×/1.30。對于圖3a、3b和3c，將所有圖像的尺寸剪裁為20μmx20μm；并且示例性比例尺為5μm。
圖3a的數(shù)據(jù)圖顯示在微流體通道中以0.2m/s流動的熒光標記的a549細胞的代表性熒光圖像，產(chǎn)生約1，000個細胞/s的通量。為了比較，圖3b的數(shù)據(jù)圖顯示在至少50ms曝光時間下，用ccd相機通過熒光顯微鏡捕獲的載玻片和蓋玻片之間的靜止的熒光標記的a549細胞的圖像。圖3c的數(shù)據(jù)圖顯示來自通過共聚焦顯微鏡的相同批次的圖像。所得的來自成像流式細胞儀的圖像顯得類似于來自熒光顯微鏡的靜止細胞的圖像，即使在成像流式細胞儀中，細胞以0.2m/s的速度行進，并且產(chǎn)生細胞圖像的信號通過與常規(guī)流式細胞儀兼容的設置和配置中單個pmt檢測。
表1顯示通過示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)和熒光顯微鏡獲得的細胞圖像的尺寸和形狀描述符的比較?；趶拿拷M隨機挑選的100個細胞熒光圖像，例如，通過成像流式細胞儀復原的圖像中測量的細胞大小、圓度和固體性，與通過熒光顯微鏡拍攝的圖像高度一致，除了被定義為擬合橢圓的長軸與短軸比率的縱橫比。成像流式細胞儀與熒光顯微鏡之間的細胞縱橫比的明顯差異，可以歸因于由流體動態(tài)剪切應力引起的細胞變形，攜帶關于細胞剛度、生物學意義的性質(zhì)的信息。
表1.
反向散射圖像。本公開的時空轉(zhuǎn)換技術不限于特定的信號模式。在下文中，顯示了該方法能夠?qū)晒鈭D像與反向散射圖像組合。通過示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)捕獲的反向散射圖像，揭示作為用于諸如疾病診斷、細胞分類和細胞周期監(jiān)測的應用的有效標志物的細胞核獨特性質(zhì)。具有較高濃度大分子的細胞組分，表現(xiàn)出比背景高的折射率。當細胞被可見光照射時，這些折射率變化將使光散射。散射區(qū)域的尺寸和折射率分布決定散射光的角分布。大多數(shù)人類癌癥起源于上皮細胞，因此反向散射圖像可能潛在地有益于早期癌癥和上皮內(nèi)腫瘤變化的診斷。為證明用于細胞核監(jiān)測的反向散射成像功能的可行性，使用成像流式細胞儀測試經(jīng)歷不同生命周期的a549細胞。
為了觀察不同階段的細胞，用抑制劑培養(yǎng)a549細胞以在不同的發(fā)育階段使其停止生長。絲裂霉素被用于使g1期的細胞停止生長，其中細胞的生物合成活性被激活以形成下一階段(s期)所必需蛋白。另外，諾考達唑被用于在g2/m期，更具體地在前中期停滯a549細胞。在前中期被停滯，核膜分解，并且細胞核的成分分布在細胞質(zhì)內(nèi)。沒有由核膜限制的明確界定的細胞核，細胞通常在光散射中具有較強但沒有明確界定的輪廓。
圖4顯示來自本公開的基于空間濾光器的成像流式細胞術的反向散射細胞圖像的示例性數(shù)據(jù)。示例性圖像為用celltracecfse染色的，以20cm/s的速度流動的a549人肺腺癌上皮細胞。圖4的圖塊(a)顯示停滯在g1期(頂部的兩個，標記的圖像401和402)和前中期g2/m(底部的兩個，標記的圖像406和407)的停滯細胞的靜止細胞的代表性共聚焦圖像。圖4的圖塊(b)顯示g1(頂部兩行，標記的圖像421、422、423、426、427和428)和g2/m(底部兩行，標記的圖像431、432、433、436、437和438)停滯細胞的代表性成像流式細胞儀圖像。熒光圖像顯示于左列，反向散射圖像顯示于中間列，以及疊加圖像顯示于右列。圖4的圖塊(b)中的熒光圖像、反向散射圖像和這兩個圖像的疊加，代表如圖1a中示出的示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)100中的行進細胞(例如，0.2m/s)。
通過兩個系統(tǒng)獲得的圖像顯示以下一般特性：在g1期停滯的細胞具有來自細胞核的明確界定的散射中心。相比之下，因為核酸和蛋白質(zhì)的濃度較高在前中期的細胞顯示整體較強的散射強度，但由于沒有核膜而無明確界定的散射中心。
為體現(xiàn)在特定階段停滯的細胞內(nèi)散射細胞組分的體積，圖4的圖塊(c)中顯示在熒光圖像上疊加反向散射圖像的三維輪廓圖。圖4的圖塊(c)顯示g1(頂部，標記的圖像441和442)和g2/m(底部，標記的圖像446和447)停滯細胞的熒光(綠色網(wǎng)狀物)和反向散射(射流表面)圖像的疊加的三維圖。所有圖像的尺寸剪裁為20μmx20μm，所有的比例尺為5μm。此外，來自時空轉(zhuǎn)換方法的反向散射圖像和共聚焦圖像顯示一致的亞細胞特征：g1期的細胞具有密集的散射中心；以及前中期的細胞具有更分散的散射區(qū)域。
對于傳統(tǒng)的流式細胞術，例如，直方圖為一種提供關于細胞群或亞群的信息的常見方式。與直方圖相關的參數(shù)包括熒光或散射強度。然而，如果測試中的每個單細胞的圖像可用于流式細胞術測試，則將更有信息量，使得做出關于門控的決定可以不再“無視”樣品屬性。而且，不僅可以量化光強度，而且可以基于測試中細胞的可用圖像進行許多形態(tài)學測量。
圖5a和5b顯示在g1期和g2/m期停滯的細胞的反向散射圖像的差異。圖5a和5b的所有數(shù)據(jù)和圖像為以0.2m/s的速度流動的a549細胞。為比較在g1和g2/m期停滯的細胞的反向散射圖像，圖5a顯示費雷特直徑(也被稱為最大卡尺)的直方圖。圖5a的直方圖中的嵌入圖包括示出費雷特直徑的定義(沿對象邊界的任何兩點之間的最長距離)的箭頭。例如，測量來自各組的300個細胞圖像。以藍色條(條形圖對的左條)顯示的g1細胞，顯示出具有大約3至4μm的費雷特直徑。以紅色條(條形圖對的右條)顯示的g2/m細胞，顯示出具有較大的費雷特直徑。代替純數(shù)字表達，圖5b顯示直方圖中2μm至15μm的每個接收器的兩個示例性反向散射圖像。在圖5b中，熱色條代表0至255的強度。所有細胞反向散射圖像的所有尺寸為20μmx20μm；并且示例性比例尺為5μm。
本技術的示例性實施方案
在一些實施方式中，例如，圖1a中示出的空間濾光器的示例性設計可以伴隨有的200μm長的激光照射狀態(tài)，由于濾光器在細胞流動方向(y-方向)的總長度而限制該裝置的通量和靈敏度。為減少在第一個細胞離開濾光器區(qū)域之前，第二個細胞進入該區(qū)域時在顆粒流發(fā)生的重合事件的概率，以降低的樣品密度操作。注意，例如，延長的照射區(qū)域(例如，由于長濾光器)也可能降低熒光強度并影響系統(tǒng)的靈敏度。
存在若干方法來克服上述具有改進的空間濾光器設計的約束。一種此類設計為相移空間濾光器(pssf)，其可以顯著縮短整個濾光器長度來實現(xiàn)增強的通量和靈敏度。
相移空間濾光器。圖6顯示本公開的成像流式細胞儀系統(tǒng)600的另一示例性實施方案。系統(tǒng)600包括系統(tǒng)100的特征，但系統(tǒng)600包括在光學系統(tǒng)布置中的示例性相移空間濾光器(pssf)611而非空間濾光器111。空間濾光器611包括狹縫組，其中每組狹縫包括多個平行的狹縫陣列，其共有相同的周期，并且在細胞行進方向(縱向或y-方向)移動。圖6中示出的示例性空間濾光器611包括每組三個平行的狹縫陣列：陣列1、陣列2和陣列3。以使所有狹縫在y-方向上空間分離(非重疊)的方式設計相移。因此，當細胞行進通過濾光器區(qū)域時，pmt記錄來自細胞的熒光通過多于一個/不到一個狹縫時所有的光強度變化。然后，可以如下導出來自細胞的光強度分布：
其中g為從細胞進入側(cè)至細胞離開側(cè)觀察到的組數(shù)，h為一組中的列數(shù)，n為來自一組的pmt信號的數(shù)字采樣點的數(shù)目，sg(t)為代表來自第g組細胞的光強度的pmt信號剪裁，以及細胞g(h)為對應于目標細胞的第g組和第h列的光強度。
在獲得一組細胞狀態(tài)的光強度分布之后，可以通過如下將強度值分配給對應行來重構細胞圖像：
細胞i(j)＝細胞g(3*c+i)c＝0，1，2，...常數(shù)(9)
其中i為第g組內(nèi)的行數(shù)，并且j為一行中的列數(shù)。
使用該方法，通量可以比先前討論的空間濾光器高三倍，因為一組中存在三行狹縫。所需的照射區(qū)域也可以通過相同因子收縮，產(chǎn)生3x高的有效激光強度以增強系統(tǒng)的靈敏度。
具有調(diào)頻的空間濾光器。減少空間濾光器長度的另一方法為調(diào)頻。圖7顯示描述使用具有調(diào)頻的空間濾光器配置的本公開技術的示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)700的圖解。如同系統(tǒng)100，系統(tǒng)700包括含有微流體裝置或芯片101的流體系統(tǒng)，其用于將細胞引入細胞微流體通道；包括具有調(diào)頻的空間濾光器組的光學系統(tǒng)，其用于光信號的照射和檢測；以及電子系統(tǒng)120，其用于數(shù)據(jù)采集和處理。成像流式細胞儀系統(tǒng)700包括：二向色鏡(dm)112b、兩個空間濾光器(sf1和sf2)711a和711b、光學光源發(fā)射器(例如，激光116)和光電倍增管(pmt)114。如圖7的實例中所示，成像流式細胞術系統(tǒng)700的光學系統(tǒng)被配置成使得激光116可操作以便在二向色鏡112b發(fā)射光，所述二向色鏡112b引導微流體裝置101的微流體通道中照射區(qū)域的光。成像流式細胞術系統(tǒng)700的光學系統(tǒng)被配置成使得第一空間濾光器(sf1)711a被布置在來自微流體裝置101的照射區(qū)域的反射光的光路中，以接收來自樣品的散射光(例如，熒光發(fā)射和反向散射光)，以及基于空間濾光器711a的開口模式在時間和/或空間上編碼接收的光。在一些實施方式中，例如，系統(tǒng)700的光學系統(tǒng)可以包括物鏡117，其被配置在接收來自微流體裝置101的照射區(qū)域的反射光的光路中，以將反射光聚焦在空間濾光器711a上。例如，用于空間濾光器(sf1)711a的掩模設計位于檢測路徑中的圖像平面處。在該實例中，空間濾光器711a包括三組狹縫，例如，以其中一個狹縫在x和y-方向均緊接另一狹縫的的方式分開放置的四個100μmx1mm狹縫的三個重復。編碼的光從空間濾光器711a傳遞至光學系統(tǒng)的諧振掃描器(rs)719，其可以被配置成垂直掃描(例如，在10khz)?？臻g編碼的光從rs719提供給第二空間濾光器(sf2)711b以編碼光信號的頻率。示例性空間濾光器(sf2)711b顯示于圖7中，其具有含有三個不同周期的三個平行的狹縫陣列，例如，其中一組具有40個周期，一組具有80個周期，以及另一個具有120個周期。兩個空間濾光器711a和711b在光學系統(tǒng)的光路中對準，使得一個濾光器的三個狹縫組被相應地投射到另一濾光器的三個狹縫組。光學系統(tǒng)被配置成包括第二dm112a，其接收來自第二空間濾光器(sf2)711b的編碼的光，并將編碼的光引導至與電子系統(tǒng)120電連通的pmt114(或多個單獨的pmt)。在圖7中示出的示例性實施方案中，當pmt115收集通過這樣的光學系統(tǒng)的光時，在該實例中所得的光強度信號是在400khz、800khz和1.2mhz調(diào)制的三個信號的疊加。電子系統(tǒng)120被配置成處理由pmt114提供的數(shù)據(jù)信號。例如，在對所得信號進行傅里葉變換之后，可以通過對具有已知載波頻率的信號進行帶通濾波處理來恢復每四行的光強度分布，然后可以使用本公開的數(shù)據(jù)處理算法來獲得每行細胞圖像。在使用熒光光信號的光學系統(tǒng)的實施方式中，例如，成像流式細胞術系統(tǒng)700的光學系統(tǒng)可以包括在光路中的發(fā)射濾光器113和透鏡115，以將編碼的熒光過濾和聚焦至pmt114中。
多通道光電探測器陣列。在本公開技術的一些實施方式中，本公開的成像流式細胞儀系統(tǒng)可以利用多陽極pmt作為光學系統(tǒng)中的光檢測器。多陽極pmt相當于在單個外殼中并入多個pmt。由于常規(guī)的pmt為零維檢測器，其中強度的空間信息丟失，并且被攔截全部二次電子的一個大的陽極合并，多陽極pmt提供一維信息-沿x或y-方向的強度的空間信息。通過使用多陽極pmt代替單通道pmt，構建的細胞圖像的分辨率可以根據(jù)多陽極pmt具有的通道數(shù)目立即增加多倍。利用這樣的光電探測器與以上討論的三個空間濾光器設計中的任一個兼容，以提供較高的圖像分辨率和/或較高的系統(tǒng)通量。
具有2個熒光色的細胞圖像的示例。進行本發(fā)明的成像流式細胞術技術的示例性實施方式，以顯示流式細胞術應用中的多色細胞成像。在示例性實施方式中，用celltracecfse(例如，520nm發(fā)射)對mda-mb-231人乳腺癌細胞進行染色，以及用1μm羧化修飾的熒光珠(例如，630nm發(fā)射)標記細胞，以獲得使用本公開技術的示例性成像流式細胞儀系統(tǒng)的圖像。圖8顯示使用本公開的成像流式細胞術技術的雙色細胞圖像。圖8的圖像中的示例性比例尺為5μm。圖像顯示1.0至1.5μm空間分辨率，其中圖像以所述顆粒的多色內(nèi)部特征及其在細胞中的空間分布為特征。
公開了使傳統(tǒng)的流式細胞儀能夠捕獲在液流中以高速行進的細胞的熒光和反向散射圖像的時空轉(zhuǎn)換技術。本公開技術的圖像質(zhì)量與使用ccd或cmos相機的靜止細胞的常規(guī)熒光顯微鏡成像的圖像質(zhì)量相當。由本公開的系統(tǒng)產(chǎn)生的空間分布反向散射圖，不僅揭示相同類型細胞的共同性，而且顯示它們的不均一性，其通過相同細胞類型經(jīng)歷不同生命周期來例示。由于設計的簡單性和使用pmt(例如，而非ccd)來構建細胞圖像，本公開的方法可以將現(xiàn)有的流式細胞儀轉(zhuǎn)化或改造成具有單細胞成像能力的系統(tǒng)。雖然在示例性實施方式中使用的示例性裝置和系統(tǒng)顯示兩個參數(shù)(例如，單色熒光和反向散射)的成像結果，但本公開的技術可以應用于利用另外的二向色鏡和pmt產(chǎn)生多種熒光顏色的細胞圖像。此外，本公開的技術可以以較高的流體流速工作，用于利用高速電子數(shù)據(jù)采集電子器件實現(xiàn)更高的空間分辨率和通量。
一些示例性實施方式的示例性材料和方法
微流體裝置制造。使用聚二甲硅氧烷(pdms)復制成型方法制造示例性實施方式中使用的示例性微流體裝置。通過反應離子蝕刻(rie)方法制造si模具主體。在autocad(autodesk，inc.)中繪制微流體通道，并且使用負性光致抗蝕劑(nr9-1500py，futurrex，inc.)進行光刻定義，所述負性光致抗蝕劑在隨后的干蝕刻過程期間用作蝕刻掩模。使用電感耦合等離子體(icp)反應離子蝕刻(icprie；plasmalab100，oxfordinstruments)在室溫蝕刻4-英寸硅晶片以達到75μm的深度。由o2和sf6氣體的混合物點燃的等離子體進行蝕刻和側(cè)壁鈍化，產(chǎn)生光滑和垂直的通道壁。通過三氯硅烷(tciinc.)的氣相沉積，使si模具主體硅烷化以促進pdms脫模。復制品通過以下制備：鑄造pdms(sylgard184，dowcorning)，在si模具主體將基料與固化劑以標準的10∶1的比例混合。在烘箱中于65℃熱固化3小時之后，將pdms層剝離模具，并且對入口和出口穿孔。用uv/臭氧處理脫模的pdms層和玻璃晶片的表面，以促進它們的共價鍵合而形成成像流式細胞儀實驗的微流體通道。
光學系統(tǒng)。在示例性實施方式中使用的示例性光學系統(tǒng)，使用25mw488-nm單模光纖耦合激光器(例如，ftec2，blueskyresearch)，其具有高斯能量分布的圓形光束形狀。使用頂帽光束整形器(osela，inc.)將高斯光束轉(zhuǎn)化成均勻的頂帽分布，其照射100μm(x-方向)x350μm(y-方向)的區(qū)域。通過50×，0.55na物鏡(mituyoyo)收集通過具有500nm截止波長(thorlabs)的微型二向色鏡的熒光和散射光。通過pmt(h9307-02，hamamatsu)獲得每個通道中的光強度信號，并使用labview進行記錄。將保存的原始數(shù)據(jù)在實施上述算法的計算機上的matlab中處理。
空間濾光器的制造。在aotocad中繪制空間濾光器的設計，并以20,000個點/英寸(dpi)將其打印至透明掩模。將負性光致抗蝕劑(nr9-1500py，futurrex，inc.)層在6-英寸玻璃晶片上以3,000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)旋轉(zhuǎn)。將晶片在150℃于熱板上加熱3分鐘，然后通過透明掩模將其暴露于uv光(evg620nt，evgroup)。uv暴露后，將晶片在100℃烘烤另外3分鐘，然后在rd6(futurrex，inc.)中顯影12秒。將200nm厚的鋁膜濺射到玻璃晶片上。在金屬剝離之后，形成空間濾光器的模式，并且將玻璃晶片切成15mmx15mm的小塊。為幫助保持流式細胞儀系統(tǒng)中的空間濾光器，將具有10個1mmx100μm狹縫的空間濾光器安裝至通過3d打印方法制造的樣品架上。
細胞樣品的制備。從培養(yǎng)物收獲a549人肺腺癌上皮細胞樣品，并用在大約492nm和517nm分別具有激發(fā)峰和發(fā)射峰的celltracecfsecellproliferationkit(lifetechnologies)對其進行標記。在4％甲醛中孵育20min之后，洗滌a549細胞并將其重懸于磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中。在每個成像實驗之前，將懸液在pbs中稀釋至200個細胞/μl的濃度。為在g1期停滯a549細胞，將溶解在dmem中的絲裂霉素(10μg/ml)與0.5％fbs和1％ps混合并添加至培養(yǎng)基中，然后在實驗前將細胞孵育3小時。為在g2/m期停滯細胞，將在dmem中的50ng/ml諾考達唑與0.5％fbs和1％ps混合后添加至培養(yǎng)基，并將細胞培養(yǎng)16小時。用pbs洗滌在設計階段停滯的細胞，并將其懸浮在4％甲醛中。將細胞懸液在室溫保持20分鐘之后，將樣品以1000rpm離心10min，并小心地棄去細胞懸液的上清液。在用pbs洗滌留在管中的樣品后，將固定的細胞重懸于pbs中至200個細胞/μl的濃度。
細胞形態(tài)學特征的測量。來自成像流式細胞儀的輸出圖像代表20μmx20μm的區(qū)域；來自熒光顯微鏡(bz-9000，keyence)的細胞熒光圖像也被剪裁至相同面積。例如，為測量由成像流式細胞儀復原的，以及通過熒光顯微鏡拍攝的兩個細胞圖像的形態(tài)學特征，使用imagej處理所有圖像。將包含來自每個系統(tǒng)的100個圖像的兩個圖像序列導入到imagej。在將測量設置為包括區(qū)域和形狀描述符之后，使用命令“分析顆?！币詼y量共存的閾值圖像?；趤碜詉magej的結果計算表1中的平均值和標準差。對于反向散射圖像的費雷特直徑測量，使用imagej中的相同方法分析來自各個g1停滯細胞和g2/m停滯細胞的300個圖像。例如，為避免由于不連貫模式而導致的一個圖像的多次測量，尤其是在g2/m停滯細胞的反向散射圖像中，將包括g1和g2/m細胞圖像兩者在內(nèi)的所有圖像平滑兩次并同時閾值化，并且僅記錄每個圖像中最大的費雷特直徑。
示例性應用
本公開技術的應用期望為通過使本文公開的示例性裝置和系統(tǒng)成為便攜式的、負擔得起的和使用方便的，來使常規(guī)和基于圖像的細胞-分選流式細胞術成為日常的實驗室工具。在一些實施方式中，例如，在流式細胞術應用期間，本公開技術的簡單的空間-頻率濾光器可以與流式細胞儀(例如，常規(guī)流式細胞術傳感器)一起使用以編碼圖像信息。在針對新興市場的應用，如干細胞研究中，例如，迫切需要開發(fā)和得到負擔得起的、用戶-友好的系統(tǒng)，其也可以生成針對更復雜分析的圖像。
流式細胞術允許快速分析成千上萬個細胞的特性，如大小(，前向散射)、粗糙度(側(cè)向散射)和一種或多種熒光標志物的強度。然而，由于細胞快速移動通過光學檢測區(qū)，圖像信息難以獲得。目前，存在一些技術上復雜的成像流式細胞儀，但它們比常規(guī)流式細胞儀復雜和昂貴得多，因此很少購買或使用。此外，由于將細胞分選與現(xiàn)今的成像流式細胞術結合的技術復雜性，已知的成像流式細胞儀不具有分選細胞的能力。在收集圖像信息時常規(guī)流式細胞術特性快速表征細胞的能力，將使得能夠進行另外重要的表型細胞特征，如細胞溶質(zhì)相對于核蛋白的表達/定位的位置，以促進生物醫(yī)學發(fā)現(xiàn)；并且這些能力期望由本技術的成像流式細胞術系統(tǒng)、裝置和方法提供。
本公開的技術提供在利用光檢測器(例如光電倍增管pmt)測量之前，通過使來自細胞的熒光發(fā)射通過空間多路復用和/或空間頻率多路復用濾光器，來構建行進顆粒(例如，細胞)的圖像的系統(tǒng)、裝置和方法。例如，pmt可以在高頻下操作，然后可以用濾光器的預定空間和頻率特性對其輸出進行去卷積，以構建對大多數(shù)應用具有足夠(例如2μm或更小)分辨率的細胞圖像。本公開的技術可以僅使用濾光器作為另外的硬件來實施，以提供具有細胞成像能力的任何流式細胞儀。本技術的光學空間和/或空間頻率濾光器可以例如，利用光刻掩模技術以低成本容易地大批量制備；并且本公開的技術期望應用于新的流式細胞儀或甚至改造現(xiàn)有的流式細胞儀以獲得實質(zhì)的性能升級。此外，用于產(chǎn)生行進細胞的熒光圖像的本公開技術的相同原理，也可以被實施以產(chǎn)生未標記細胞的光散射(例如，反向散射)圖像。使用該方法，可以第一次對行進的未標記細胞細胞的內(nèi)部結構(例如，細胞核)成像，這是目前任何流式細胞儀不具備的獨特且可用的能力。
圖9顯示來自本技術的示例性成像流式細胞術系統(tǒng)產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)的多功能輸出的原理圖。例如，常規(guī)流式細胞儀由于細胞在檢測區(qū)的快速移動而缺乏定義空間信息的能力。此外，例如，細胞的表型特性可以用常規(guī)顯微鏡揭示，但不允許高通量細胞分析或分選。圖9的圖解示出通過使用空間和/或空間頻率濾光器來編碼圖像信息以產(chǎn)生編碼信號的示例性流式細胞術方法，所述編碼信號可以由數(shù)據(jù)處理算法轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生圖像數(shù)據(jù)并渲染圖像，其將顆粒的物理特征，例如，諸如細胞特征，如細胞質(zhì)與細胞核染色區(qū)分開來。此外，本公開的技術可以以使細胞能夠同時成像和分選的微流體分選流式細胞儀來實施。
在一些實施方式中，例如，光學空間和/或空間頻率濾光器可以放置在一個或多個光電倍增管(pmt)檢測器的前面。示例性濾光器可以包括在每列狹縫中的具有周期性結構(例如，空間頻率)的狹縫矩陣。來自行進細胞的熒光或散射信號在到達pmt之前通過該濾光器。然后，來自pmt的所得信號由濾光器調(diào)制的多路復用信號組成。pmt信號的時域和傅立葉域分析產(chǎn)生對應于由細胞的不同區(qū)域產(chǎn)生的熒光的唯一時間和頻率特征的信號。然后，可以應用本公開的數(shù)學算法來解碼不同特征的信號，并構建整個細胞的熒光圖像。對于用不同熒光團標記的細胞，可以疊加每種顏色的熒光圖像以產(chǎn)生熒光圖像。此外，例如，對于未標記細胞細胞，可以從用于wbc分類或細胞周期檢測的散射(例如，反向散射)信號獲得其內(nèi)部(例如細胞核)結構圖像。所得的圖像顯得與用熒光顯微鏡觀察到的靜態(tài)細胞的圖像類似，即使在流式細胞儀中，細胞實際上以幾米/秒的速度行進，并且圖像僅通過幾個pmt(每個pmt一種顏色)而非像素化的高速成像器被檢測到。本公開的技術期望提供重大突破，其可以潛在地變革流式細胞術領域，并且其對基礎生物醫(yī)學研究和臨床應用的影響和衍生可能是巨大的。
圖10包括通過將空間濾光器應用至常規(guī)流式細胞儀來呈現(xiàn)本技術的示例性成像流式細胞儀的設計和原理的圖解和圖像。為了說明的目的，假設在流動室中以速度“v”行進的細胞具有三個離散的熒光點，如圖10中所示。例如，任何流式細胞儀的光學設計可以被認為是將熒光發(fā)射(在二向色鏡和其它光學組件之后)投射到光電倍增管(pmt)上的聚焦系統(tǒng)。在此處，可以將空間濾光器放置在pmt前面的圖像平面處，如圖10的圖塊a示出的。然后，利用通過光學器件確定的放大因數(shù)(例如，50×的放大因數(shù))在空間濾光器的平面上形成細胞的熒光圖像。當細胞以速度“v”在通道中行進時，投影到空間濾光器上的圖像以mv的有效速度行進，其中m是放大因數(shù)。例如，將空間濾光器設計為使得細胞的不同部分將在不同時間通過不同狹縫(例如，相對于圖10中示出的示例性空間濾光器，首先是上部，然后是中部，最后是底部)。因此，來自pmt的熒光信號的波形包括在時域中分離的模式序列，其中信號的每個部分與細胞的對應狀態(tài)的熒光相關。圖10中示出的表還顯示，該特定實例中的強度分布如何與波形中的特征時間相關。在更一般的情況下，例如，可以通過取波形的時間導數(shù)來獲得對應于每個狹縫的熒光強度分布。例如，圖10的圖塊a中的示意圖示出，使用本公開技術的示例性空間濾光器和例如可以在常規(guī)流式細胞儀中發(fā)現(xiàn)的pmt來重構行進細胞的熒光圖像。在圖塊a的左邊，細胞進入檢測區(qū)并在此被激光照射而發(fā)射熒光。發(fā)射光通過模式化濾光器并隨著時間的推移產(chǎn)生來自pmt的相應的電壓變化。因為濾光器的模式為已知的，當細胞的特定特征通過濾光器并產(chǎn)生pmt電壓變化時，數(shù)據(jù)處理單元實施圖像數(shù)據(jù)處理方法(例如，利用基于濾光器特性的算法)以產(chǎn)生圖像數(shù)據(jù)，并且在一些實施方式中，以重構圖像。圖10的圖塊a還顯示，使用本公開技術的基于示例性空間濾光器設計的數(shù)據(jù)處理方法的包含原始熒光標記的細胞(左)和重構細胞圖像(右)的圖像。
例如，可以基于以下實例進行空間濾光器圖像重構。在每個狹縫區(qū)上的熒光分布被復原之后，可以通過將所有熒光分布拼接在一起來構建整個細胞的熒光圖像。復原圖像的空間分辨率取決于例如狹縫的數(shù)目、每個狹縫的寬度和/或光學器件?？梢詫崿F(xiàn)在單數(shù)(singular)微米中(例如，2μm或更少)的空間分辨率，其適用于大多數(shù)應用。注意，在基于流式細胞儀系統(tǒng)的因素的一些實施方式中，空間濾光器設計可限制裝置通量和靈敏度，因為濾光器在細胞流動方向上的總長度需要在降低的樣品密度下操作以保持重合事件的頻率較低。當?shù)谝粋€細胞離開濾光器區(qū)域之前，第二個細胞進入該區(qū)域，就發(fā)生重合事件。在一些實施方式中，對應于長濾光器的延長的激發(fā)區(qū)域，也可能降低熒光強度并影響系統(tǒng)的靈敏度。因此，空間濾光器設計可以包括空間頻率濾光器。
圖11的圖塊a顯示使用空間頻率濾光器來復原細胞熒光圖像的另一示例性設計。該空間頻率濾光器包括平行的狹縫陣列，并且每個狹縫具有唯一值周期性的周期性結構。當細胞行進通過濾光器狀態(tài)時，熒光分布被顯示為搭載于特征性載波頻率上的卷積調(diào)幅信號。以這種方式，由細胞的每個熒光狀態(tài)產(chǎn)生的信號通過特定的載波頻率編碼。在解調(diào)之后，可以獲得細胞的熒光強度分布。圖11的圖塊b顯示從頻率濾光器之后的信號復原的細胞圖像，其中10個載波頻率已經(jīng)被用于將細胞切成10行。注意，例如，雖然圖像質(zhì)量受到不同頻率組件間的串擾和檢測器的帶寬的限制，但可以解析細胞內(nèi)的局部熒光特征。
圖12顯示可以并入具有最大兼容性的常規(guī)流式細胞儀中的多路復用空間頻率濾光器的示例性設計。圖12中示出的示例性濾光器設計包括三列狹縫，并且每列狹縫具有限定四個載波頻率的四個周期性結構(包括通過打開的狹縫限定的基帶)。在圖12的該實例中，檢測到的pmt波形相當于圖10和圖11中波形的疊加。例如，在時域和頻域解調(diào)之后，可以獲得整個細胞的熒光分布。與純的空間濾光器方法相比，實現(xiàn)相同圖像分辨率所需的濾光器的長度減少4×。因此，激光激發(fā)區(qū)和熒光收集區(qū)的長度從240μm降低至60μm。這與常規(guī)流式細胞儀的光學設計兼容(例如，具有60μmx20μm的光束斑，其中沿流動方向為60μm)。例如，僅使用三種不同的頻率(不包括基帶(例如，零頻率))，因此與頻率濾光器設計相比，pmt的采樣率和帶寬大大降低。
實施例
以下實施例示出了本技術的數(shù)個實施方案?？梢栽谝韵铝谐龅膶嵤├盎蛘咭韵铝谐龅膶嵤├?，呈現(xiàn)本技術的其它示例性實施方案。
在本技術的實施例(實例1)中，用于在流式細胞術中使顆粒成像的方法包括：在攜帶含有顆粒的流體樣品的流體通道傳輸光束，使得所述光束被所述顆粒散射或引起來自所述流體通道中所述顆粒的熒光發(fā)射；在空間濾光器接收散射或熒光發(fā)射的光，所述空間濾光器包括具有多個孔的表面，所述孔以沿著與顆粒流相反的橫向方向和與顆粒流平行的縱向方向的模式布置，使得流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光；基于來自所述攜帶流體樣品的流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，編碼包括所述顆粒的時空信息的光信號；通過光檢測器檢測編碼的光信號；以及在與所述光檢測器通信的數(shù)據(jù)處理單元處理檢測到的光信號，以產(chǎn)生與流過所述流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括所述顆粒的物理特征的信息。
實例2包括實例1所述的方法，其還包括基于所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)形成所述顆粒的圖像，其中所述圖像包括所述顆粒的物理特征的視覺呈現(xiàn)。
實例3包括實例1所述的方法，其中當所述顆粒在所述流體通道中流動時，處理所述檢測到的光信號是實時的。
實例4包括實例1所述的方法，其中處理所述檢測到的光信號包括：在至少兩個維度上確定所述顆粒的位置或速度；確定所述空間濾光器的特征函數(shù)，所述特征函數(shù)包括與所述模式的孔的尺寸和布置相關的參數(shù)；以及通過用確定的特征函數(shù)對顆粒信號進行去卷積，來確定與所述顆粒的一個或多個部分相關的局部信號以產(chǎn)生與所述顆粒相關的所述圖像數(shù)據(jù)，其中所述顆粒信號包括所檢測到的光信號、所確定的位置或速度、在所述空間濾光器聚焦所接收的散射的光或熒光發(fā)射的光的光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)。
實例5包括實例1所述的方法，其還包括基于所述顆粒的確定的物理特征分選所述顆粒。
實例6包括實例1所述的方法，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)中所述顆粒的物理特征包括以下中的至少一種：所述顆粒的尺寸、所述顆粒的空間特征或幾何形狀、或所述顆粒的內(nèi)部特征的位置或濃度。
實例7包括實例1或6所述的方法，其中所述顆粒包括生物細胞。
實例8包括實例7所述的方法，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括所述生物細胞中的內(nèi)部細胞器、細胞核或寄生物質(zhì)的熒光模式的空間分布數(shù)據(jù)。
實例9包括實例1所述的方法，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括由于所述顆粒的形狀和密度分布引起的所述顆粒的散射模式數(shù)據(jù)。
實例10包括實例1所述的方法，其中所述孔的模式包括兩個或更多個分開放置的狹縫，使得相鄰的狹縫位于狹縫的在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)和與所述縱向方向垂直的橫向方向(x-方向)的覆蓋區(qū)之外。
實例11包括實例10所述的方法，其中所述孔的模式包括10個100μmx1mm的狹縫。
實例12包括實例1所述的方法，其中所述孔的模式包括狹縫組，其中每組狹縫包括兩個或更多個平行的狹縫陣列，其在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)為移動的、空間分開的和非重疊的。
實例13包括實例1所述的方法，其還包括通過位于所述光路和所述光檢測器的成像平面中的第二濾光器來編碼所述光信號中的頻率信息，所述第二濾光器包括頻率調(diào)制孔的模式，所述頻率調(diào)制孔包括具有存在間隔的平行的狹縫陣列的兩組或更多組狹縫，以便相對于各組產(chǎn)生不同的周期。
實例14包括實例1所述的方法，其中所述光束包括激光束。
實例15包括實例1所述的方法，其中所述光檢測器包括一個或多個光電倍增管(pmt)。
在本技術的實例(實例16)中，成像流式細胞儀系統(tǒng)包括：流體裝置，其被構造成包括基板和設置在所述基板上的流體通道，以沿著顆粒流方向攜帶含有顆粒的流體樣品；光源，其用于在所述流體通道產(chǎn)生光束以照射所述流體樣品，其中當被所述光束照射時，光被所述顆粒散射或引起來自所述顆粒的熒光發(fā)射；光檢測器，其被布置在散射或熒光發(fā)射的光的光路中；濾光器，其位于所述光檢測器的成像平面并且被構造成包括具有多個孔的表面，所述孔以沿著與所述顆粒流方向相反的橫向方向和與所述顆粒流方向平行的縱向方向的模式布置，使得流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光，其中所述濾光器可操作以基于來自所述攜帶流體樣品的流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，編碼包括所述顆粒的時空信息的光信號，使得編碼的光信號通過所述光檢測器被檢測到；和與所述光檢測器通信的數(shù)據(jù)處理單元，所述數(shù)據(jù)處理單元處理所述編碼的光信號，以產(chǎn)生與流過所述流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)包括所述顆粒的物理特征的信息。
實例17包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)據(jù)處理單元被配置成處理所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)以生成所述顆粒的圖像，其中所述圖像包括所述顆粒的物理特征的視覺呈現(xiàn)。
實例18包括實例16所述的系統(tǒng)，在所述數(shù)據(jù)處理單元被配置成通過以下來處理所述編碼的光信號以產(chǎn)生所述圖像數(shù)據(jù)：在至少兩個維度上確定所述顆粒的位置或速度；確定所述濾光器的特征函數(shù)，所述特征函數(shù)包括與所述模式的孔的尺寸和布置相關的參數(shù)；以及通過用確定的特征函數(shù)對顆粒信號進行去卷積，來確定與所述顆粒的一個或多個部分相關的局部信號以產(chǎn)生與所述顆粒相關的所述圖像數(shù)據(jù)，其中所述顆粒信號包括所檢測到的光信號、所確定的位置或速度、在所述空間濾光器聚焦所接收的散射的光或熒光發(fā)射的光的光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)。
實例19包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)可操作以基于所述顆粒的確定的物理特征分選所述顆粒，其中所述流體裝置包括在所述流體通道的第一區(qū)域之后的所述流體通道的第二區(qū)域處的致動器，其中所述光束被照射時，與所述數(shù)據(jù)處理單元通信的所述致動器接收命令來根據(jù)所確定的物理特征分選所述顆粒。
實例20包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)中所述顆粒的物理特征包括以下中的至少一種：所述顆粒的尺寸、所述顆粒的空間特征或幾何形狀、或所述顆粒的內(nèi)部特征的位置或濃度。
實例21包括實例16或20所述的系統(tǒng)，其中所述顆粒包括生物細胞。
實例22包括實例21所述的系統(tǒng)，其中所述生物細胞的內(nèi)部特征包括所述細胞的細胞器或非天然物質(zhì)。
實例23包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)據(jù)處理單元包括輸入/輸出單元，其可操作以與外部計算機系統(tǒng)對接，從而向所述外部計算機系統(tǒng)提供所產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)并接收來自所述外部計算機系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。
實例24包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述數(shù)據(jù)處理單元駐留在外部計算機系統(tǒng)上。
實例25包括實例24所述的系統(tǒng)，其中所述外部計算機系統(tǒng)包括個人計算機、平板電腦、智能手機或可佩戴通信裝置。
實例26包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述濾光器的孔的模式包括兩個或更多個分開放置的狹縫，使得相鄰的狹縫位于狹縫的在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)和與所述縱向方向垂直的橫向方向(x-方向)的覆蓋區(qū)之外。
實例27包括實例26所述的系統(tǒng)，其中所述孔的模式包括10個100umx1mm的狹縫。
實例28包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述濾光器的孔的模式包括狹縫組，其中每組狹縫包括兩個或更多個平行的狹縫陣列，其在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)為移動的、空間分開的和非重疊的。
實例29包括實例16所述的系統(tǒng)，其還包括位于所述光路和所述光檢測器的成像平面中的第二濾光器，所述第二濾光器包括頻率調(diào)制孔的模式，所述頻率調(diào)制孔包括具有存在間隔的平行的狹縫陣列的兩組或更多組狹縫，以便相對于各組產(chǎn)生不同的周期。
實例30包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述光源包括激光，并且所述光束包括激光束。
實例31包括實例16所述的系統(tǒng)，其中所述光檢測器包括一個或多個光電倍增管(pmt)。
在本技術的實例(實例32)中，用于編碼來自在流體通道中流動的顆粒的光信號的空間濾光器包括具有多個孔的基板，所述孔以沿著與在所述流體通道中流動的顆粒的顆粒流方向相反的橫向方向和與在所述流體通道中流動的所述顆粒的顆粒流方向平行的縱向方向的模式布置，其中所述空間濾光器可操作以便當位于光束照射的所述流體通道的照射區(qū)域與光檢測器之間的光路時，編碼來自在所述流體通道中流動的顆粒的光信號，其中所述空間濾光器位于所述光檢測器的成像平面，其中所述空間濾光器可操作以便基于流經(jīng)所述模式的孔的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的孔，并在與所述孔相關的位置散射光束或發(fā)射熒光，來編碼所述光信號，其中基于來自所述流體通道的至少一些所接收的散射的光或發(fā)射的熒光，所述編碼的光信號包括所述顆粒的時空信息。
實例33包括實例32所述的空間濾光器，其中由所述濾光器編碼的所述光信號的時空信息，提供包括所述顆粒的物理特征的數(shù)據(jù)，其能夠被處理以產(chǎn)生與流過所述流體通道的顆粒相關的圖像數(shù)據(jù)，其中所述圖像數(shù)據(jù)通過以下來產(chǎn)生：在至少兩個維度上確定所述顆粒的位置或速度；確定所述空間濾光器的特征函數(shù)，所述特征函數(shù)包括與所述模式的孔的尺寸和布置相關的參數(shù)；以及通過用確定的特征函數(shù)對顆粒信號進行去卷積，來確定與所述顆粒的一個或多個部分相關的局部信號以產(chǎn)生與所述顆粒相關的所述圖像數(shù)據(jù)，其中所述顆粒信號包括所檢測到的光信號、所確定的位置或速度、在所述空間濾光器聚焦所接收的散射的光或熒光發(fā)射的光的光學系統(tǒng)的放大倍數(shù)。
實例34包括實例32所述的空間濾光器，其中所述孔的模式包括兩個或更多個分開放置的狹縫，使得相鄰的狹縫位于狹縫的在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)和與所述縱向方向垂直的橫向方向(x-方向)的覆蓋區(qū)之外。
實例35包括實例34所述的空間濾光器，其中所述孔的模式包括10個100μmx1mm的狹縫。
實例36包括實例32所述的空間濾光器，其中所述濾光器的孔的模式包括兩組或更多組狹縫，其中每組狹縫包括兩個或更多個平行的狹縫陣列，其在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)為移動的、空間分開的和非重疊的。
實例37包括實例36所述的空間濾光器，其中所述空間濾光器還包括位于所述光路和所述光檢測器的成像平面中的第二濾光器，所述第二濾光器包括頻率調(diào)制孔的模式，所述頻率調(diào)制孔包括具有存在間隔的平行的狹縫陣列的兩組或更多組狹縫，以便相對于各組產(chǎn)生不同的周期。
實例38包括實例37所述的空間濾光器，其中所述第二濾光器包括三個組，其中第一組的狹縫以第一周期間隔開，第二組的狹縫以第一周期的倍數(shù)間隔開，以及第三組的狹縫以第一或第二周期的倍數(shù)間隔開。
在本技術的實例中(實例p1)，在流式細胞儀中使顆粒成像的方法包括：傳輸光束通過空間布置在流體通道附近的孔的模式，以照射含有顆粒的流體樣品，其中所述孔的模式包括基板，其被構造成形成布置在所述基板上的多個狹縫，使得流過所述孔的模式的顆粒的不同部分在不同時間通過不同的狹縫，并使所述光束散射以產(chǎn)生光散射信號；通過光檢測器檢測至少一些光散射信號；以及基于光散射信號來編碼包含所述顆粒的時空信息的波形。
實例p2包括實例p1所述的方法，其中所述孔的模式包括兩個或更多個分開放置的狹縫，使得相鄰的狹縫位于狹縫的在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)和與所述縱向方向垂直的橫向方向(x-方向)的覆蓋區(qū)之外。
實例p3包括實例p3所述的方法，其中所述孔的模式包括10個100μmx1mm的狹縫。
實例p4包括實例p1所述的方法，其中所述孔的模式包括狹縫組，其中每組狹縫包括三個平行的狹縫陣列，其在所述流體通道中顆粒流的縱向方向(y-方向)為移動的、空間分開的和非重疊的。
實例p5包括實例p1所述的方法，其中所述光束包括激光束。
實例p6包括實例p1所述的方法，其中所述光檢測器包括一個或多個光電倍增管(pmt)。
實例p2包括實例p1所述的方法，其還包括處理所述編碼的波形以確定所述顆粒的物理特征；以及形成包括所述物理特征在內(nèi)的所述顆粒的圖像。
實例p7包括實例p1所述的方法，其中所述顆粒包括細胞。
本專利文件中描述的主題和功能操作的實現(xiàn)可以在各種系統(tǒng)、數(shù)字電子電路、或計算機軟件、固件或硬件中實施，包括本說明書中公開的結構及其結構等同物，或它們中的一種或多種的組合。本說明書中描述的主題的實現(xiàn)可以以一種或多種計算機程序產(chǎn)品實施，所述計算機程序產(chǎn)品即在有形和非暫時性計算機可讀介質(zhì)上編碼的計算機程序指令的一個或多個模塊，用于通過數(shù)據(jù)處理設備執(zhí)行或來控制數(shù)據(jù)處理設備的操作。計算機可讀介質(zhì)可以為機器可讀存儲裝置、機器可讀存儲基板、存儲裝置、影響機器可讀傳播信號的物質(zhì)組成或它們中的一種或多種的組合。術語“數(shù)據(jù)處理設備”涵蓋用于處理數(shù)據(jù)的所有設備、裝置和機器，其包括例如可編程處理器、計算機或多個處理器或計算機。除了硬件之外，設備可以包括為討論中的計算機程序創(chuàng)建執(zhí)行環(huán)境的代碼，例如，構成以下的代碼：處理器固件、協(xié)議棧、數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)、操作系統(tǒng)或它們中的一種或多種的組合。
計算機程序(也被稱為程序、軟件、軟件應用、腳本或代碼)可以以任何形式的編程語言編寫，所述編程語言包括編譯或解釋語言，并且可以以任何形式部署，包括作為獨立程序或作為模塊、組件、子程序或適用于計算環(huán)境中的其它單元。計算機程序不一定對應于文件系統(tǒng)中的文件。程序可以存儲在保存其它程序或數(shù)據(jù)(例如，在標記語言文件中存儲的一個或多個腳本)的文件的一部分中，存儲在專用于所討論的程序中的單個文件中，或存儲在多個協(xié)調(diào)文件(例如，存儲一個或多個模塊、子程序或部分代碼的文件)中。可以將計算機程序部署為在一個或多個計算機上執(zhí)行，所述計算機位于一個地點或分布在多個地點，并且通過通信網(wǎng)絡互連。
本說明書中描述的過程和邏輯流程可以由執(zhí)行一個或多個計算機程序的一個或多個可編程處理器進行，以通過對輸入數(shù)據(jù)進行操作并生成輸出來執(zhí)行功能。該過程和邏輯流程也可以通過專用邏輯電路，例如，fpga(現(xiàn)場可編程門陣列)或asic(專用集成電路)執(zhí)行，并且設備也可以以專用邏輯電路，例如，fpga(現(xiàn)場可編程門陣列)或asic(專用集成電路)實施。
適用于執(zhí)行計算機程序的處理器包括例如通用和專用微處理器兩者，以及任何種類的數(shù)字計算機的任何一個或多個處理器。通常，處理器從只讀存儲器或隨機存取存儲器或兩者接收指令和數(shù)據(jù)。計算機的基本元件為用于執(zhí)行指令的處理器和一個或多個用于存儲指令和數(shù)據(jù)的存儲裝置。通常，計算機也包括，一個或多個用于存儲數(shù)據(jù)的大容量存儲裝置(例如，磁盤、磁光盤或光盤)，或可操作地耦合以從一個或多個用于存儲數(shù)據(jù)的大容量存儲裝置(例如，磁盤、磁光盤或光盤)接收數(shù)據(jù)或向其傳輸數(shù)據(jù)或兩者。然而，計算機本來不需要這樣的裝置。適用于存儲計算機程序指令和數(shù)據(jù)的計算機可讀介質(zhì)，包括所有形式的非易失性存儲器、介質(zhì)和存儲裝置，其包括例如半導體存儲裝置，例如，eprom、eeprom和閃存裝置。處理器和存儲器可以由專用邏輯電路補充，或并入其中。
預期說明書中所述的實施方案和實施方式以及附圖被認為是示例性的，其中“示例性的”意為一個實例。如本文所用，單數(shù)形式“一個/種(a/an)”也旨在包括復數(shù)形式，除非上下文另有明確指明。另外，“或者”的使用可以包括“和/或”，除非上下文另有明確指明。
雖然本專利文件含有許多細節(jié)，但這些不應被解釋為對任何發(fā)明范圍的限制或?qū)λ蟊Ｗo的范圍的限制，而是針對特定發(fā)明的具體實施方案的特征的描述。在單獨實施方案的上下文中，在本專利文件中描述的某些特征也可以在單個實施方案中組合實施。相反地，在單個實施方案的上下文中描述的多種特征，也可以在多個實施方案中分開實施，或者以任何合適的子組合實施。此外，雖然上文將特征描述成以某些組合起作用，且甚至最初這樣要求，但來自要求保護的組合的一個或多個特征可以在一些情況中從組合中脫離，并且要求保護的組合可以針對子組合或子組合的變型。
類似地，當附圖中以特定次序描繪操作時，這不應被理解為需要以所示的特定次序或按依次順序來實施所述操作，或?qū)嵤┤渴境龅牟僮鱽磉_到期望結果。此外，本專利文件中描述的實施方案中的各種系統(tǒng)組件的分離，不應被理解為在所有實施方案中均要求這樣的分離。
僅描述了一些實施方式和實施例，并且可以基于本專利文件中描述和示出的，可以進行其它實施方式、改進和變型。
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