專利名稱：高分辨率流式細(xì)胞儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根據(jù)顆粒的特征高分辨率地區(qū)分和分離顆粒。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及高分辨率地將精子區(qū)分和分離成含X染色體的類群和含Y染色體的類群，或提高其同質(zhì)性。
背景技術(shù)：
隨著安全、可靠地將精子分離成富含X染色體的類群和富含Y染色體的類群的方法的發(fā)展，已經(jīng)在許多種哺乳動(dòng)物中有效地實(shí)現(xiàn)了性別預(yù)選。按照本文及以下各國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)，可以將含X染色體的精子與含Y染色體的精子分離開(kāi)來(lái)，所述國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)有例如WO98/34094、WO 99/33956、WO 99/42810、WO 00/06193、WO 01/40765、WO 01/85913、WO 02/43486、WO 02/43574，在此將其以參考的方式引入本文。
現(xiàn)在參考圖1和圖2，常規(guī)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀技術(shù)提供了顆粒或細(xì)胞源(1)，其用于安置或供應(yīng)顆粒或細(xì)胞(16)(其可以是精子或精細(xì)胞，精子頭部，常見(jiàn)的血細(xì)胞如白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板，或是罕見(jiàn)的細(xì)胞類型如母體血液循環(huán)中的胎兒細(xì)胞、帶有病毒的細(xì)胞、癌細(xì)胞等，以及細(xì)胞的一部分如細(xì)胞器、線粒體、單個(gè)染色體，以及可結(jié)合有生物學(xué)組分的人造顆粒如小珠、微球或納米球)，可以用至少一種熒光染料對(duì)這些顆?；蚣?xì)胞進(jìn)行染色以用于分析。通過(guò)將顆?；蚣?xì)胞(16)導(dǎo)入液流或鞘液(3)中而將顆?；蚣?xì)胞(16)導(dǎo)入噴嘴(2)中。液流(3)通常由某個(gè)流體源(4)供應(yīng)，由此當(dāng)顆粒或細(xì)胞源(1)將顆?；蚣?xì)胞(16)供入液流(3)時(shí)，它們一起流經(jīng)噴嘴(2)。
在此方式中，液流(3)構(gòu)成了顆?；蚣?xì)胞(16)的流體環(huán)境。由于以一定壓力將各種流體供給流式細(xì)胞儀，所以它們于噴嘴開(kāi)口(5)處排出噴嘴(2)。通過(guò)提供某種可由振蕩控制器(7)高度精確調(diào)控的振蕩器(6)，可在噴嘴(2)內(nèi)形成壓力波并傳遞給于噴嘴開(kāi)口(5)處排出噴嘴(2)的液流(3)。由于振蕩器(6)作用于鞘液(3)，于噴嘴開(kāi)口(5)下形成的液流(8)最終有規(guī)律地形成液滴(9)。由于顆?；蚣?xì)胞(16)為形成于噴嘴開(kāi)口之下的液流(8)所包圍，所以液滴(9)中可夾帶有各自分開(kāi)的顆?；蚣?xì)胞(16)。
由于液滴(9)可以?shī)A帶單個(gè)的顆?；蚣?xì)胞(16)，所以可采用流式細(xì)胞儀根據(jù)顆粒或細(xì)胞的特征分離這些顆?；蚣?xì)胞(16)。這通過(guò)使用顆粒或細(xì)胞傳感系統(tǒng)(10)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該顆粒或細(xì)胞傳感系統(tǒng)至少包括某種檢測(cè)器或傳感器(11)，其對(duì)包含于液流(8)中的顆?；蚣?xì)胞(16)產(chǎn)生響應(yīng)。顆?；蚣?xì)胞傳感系統(tǒng)(10)可以基于某一特征的相對(duì)存在或相對(duì)缺失而產(chǎn)生反應(yīng)，所述特征有例如與顆粒或細(xì)胞或它們的組分相結(jié)合的熒光染料，所述組分如DNA、脂類線粒體或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，所述熒光染料可以被產(chǎn)生照射光束的照射源如激光(12)所激發(fā)，顆?；蚣?xì)胞(16)可對(duì)所產(chǎn)生的照射光束產(chǎn)生響應(yīng)。
盡管每一種顆粒、細(xì)胞或它們的組分可用至少一種類型的熒光染料染色，但是根據(jù)所用特定類型熒光染料的可用結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，與各單個(gè)顆?；蚣?xì)胞(16)結(jié)合的熒光染料量是不同的。僅舉一例子來(lái)說(shuō)，對(duì)于精子來(lái)說(shuō)，Hoechst 33342染料結(jié)合位點(diǎn)的可利用率取決于各精子內(nèi)所含的DNA量。由于含X染色體的精子的DNA含量比含Y染色體的精子的DNA含量要高，因此，一種哺乳動(dòng)物的含X染色體精子可比同種哺乳動(dòng)物的相應(yīng)含Y染色體精子結(jié)合更多量的熒光染料。因此，測(cè)量所結(jié)合熒光染料在激發(fā)后所發(fā)射的熒光就能將含X染色體精子和含Y染色體精子區(qū)分開(kāi)來(lái)。
為了根據(jù)顆?；蚣?xì)胞的特征實(shí)現(xiàn)分開(kāi)或分離，發(fā)射光可由傳感器(11)接收并反饋到與液滴充電器相連的某種分離辨別系統(tǒng)(13)，所述充電器可根據(jù)液滴(9)內(nèi)所含顆粒或細(xì)胞(16)的特征使各液滴(9)帶上不同的電荷。通過(guò)這種方式，根據(jù)液滴(9)是否含有適當(dāng)?shù)念w?；蚣?xì)胞(16)，分離辨別系統(tǒng)(13)使靜電偏轉(zhuǎn)板(14)將所述液滴(9)偏轉(zhuǎn)。
結(jié)果，流式細(xì)胞儀通過(guò)將液滴(9)導(dǎo)向一個(gè)或一個(gè)以上的收集容器(15)中而使其中夾帶的單個(gè)顆?；蚣?xì)胞(16)得以分離。例如，當(dāng)分離辨別系統(tǒng)(13)根據(jù)含X染色體精子和含Y染色體精子的相對(duì)DNA含量不同而區(qū)別精子時(shí)，可使夾帶含X染色體精子的液滴帶上正電荷并由此偏轉(zhuǎn)到一個(gè)方向，而使夾帶含Y染色體精子的液滴帶上負(fù)電荷并由此偏轉(zhuǎn)到另一個(gè)方向，可使廢液流(其為未夾帶顆?；蚣?xì)胞(16)或夾帶有不需要或不能分選的細(xì)胞的液滴)不帶電荷，從而以未偏轉(zhuǎn)的液流加以收集。用一些常規(guī)流式細(xì)胞儀可以同時(shí)確定各種偏轉(zhuǎn)軌跡并進(jìn)行收集。
盡管在過(guò)去幾年中，用于細(xì)胞或顆粒分離的常規(guī)流式細(xì)胞儀得以改進(jìn)，但是對(duì)于常規(guī)流式細(xì)胞儀的分辨能力來(lái)說(shuō)仍存在顯著的問(wèn)題。
圖1所示常規(guī)流式細(xì)胞儀的一個(gè)顯著問(wèn)題在于，流體源(4)和相關(guān)的流體源導(dǎo)管(23)將流體(3)以基本上與噴嘴(2)內(nèi)的流體(3)流動(dòng)相垂直的方向?qū)雵娮?2)中。這兩個(gè)流動(dòng)方向可以使噴嘴(2)內(nèi)層流的形成擾亂、變形或遲滯。特別是當(dāng)定位、取向及顆粒間的分布對(duì)于單個(gè)顆?；蚣?xì)胞(16)的精確分析來(lái)說(shuō)很關(guān)鍵，以及要求單個(gè)液滴(9)正確夾帶單個(gè)顆?；蚣?xì)胞(16)時(shí)，那些相對(duì)于液流分子來(lái)說(shuō)較大的顆?；蚣?xì)胞(16)受可能產(chǎn)生渦流的流體運(yùn)動(dòng)的影響非常大，因此維持層流是很重要的一個(gè)方面，而這一點(diǎn)在常規(guī)流式細(xì)胞儀的設(shè)計(jì)中被忽視了。同樣值得注意的是，振蕩器(6)的主要功能是提供壓力波以形成單個(gè)的液滴(9)，該振蕩器(6)還會(huì)在噴嘴(2)內(nèi)產(chǎn)生壓力駐波，壓力駐波會(huì)影響層流的特征，尤其是噴嘴設(shè)計(jì)不恰當(dāng)時(shí)可導(dǎo)致諧波分散，如壓力搏動(dòng)或子振蕩。
圖1所示常規(guī)流式細(xì)胞儀的另一個(gè)顯著問(wèn)題是，細(xì)胞源(1)和噴嘴(2)之間的細(xì)胞源導(dǎo)管(17)不是直的。細(xì)胞源導(dǎo)管(17)中的顯著彎曲可使流體壓力隨細(xì)胞源導(dǎo)管的彎曲而發(fā)生變化，或可產(chǎn)生在橫截面上流速完全不同的液流。這一問(wèn)題可因細(xì)胞或碎片在細(xì)胞源導(dǎo)管(17)的彎曲處聚集而加劇。
圖1所示常規(guī)流式細(xì)胞儀的第三個(gè)顯著問(wèn)題是細(xì)胞源導(dǎo)管(17)太長(zhǎng)。常規(guī)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞源導(dǎo)管(17)從細(xì)胞源(1)到顆粒或細(xì)胞注射入液流的位點(diǎn)(18)的長(zhǎng)度可超過(guò)4英寸。常規(guī)長(zhǎng)度的細(xì)胞源導(dǎo)管(17)可使細(xì)胞在細(xì)胞源導(dǎo)管中沉積或聚積，或是流經(jīng)細(xì)胞源導(dǎo)管時(shí)使渦流增加，從而使細(xì)胞群的表觀分辨率下降。
圖1所示常規(guī)流式細(xì)胞儀的第四個(gè)顯著問(wèn)題是，細(xì)胞源導(dǎo)管(17)尤其是細(xì)胞源導(dǎo)管的顆粒注射器(19)部分不能單獨(dú)地替換。這樣，細(xì)胞源導(dǎo)管(17)或顆粒注射器(19)部分發(fā)生障礙或性能不佳時(shí)，必須得替換掉整個(gè)噴嘴(2)和細(xì)胞源導(dǎo)管(17)及流式細(xì)胞儀的其他與噴嘴(2)不可分離地連接在一起的組件。
常規(guī)流式細(xì)胞儀的第五個(gè)顯著問(wèn)題是，可能有一個(gè)連接器(20)接到細(xì)胞源導(dǎo)管(17)的顆粒注射器(19)部分的入口末端，以將注射器部分(19)和細(xì)胞源導(dǎo)管(17)連接起來(lái)。即使零死體積的連接器或接頭也可使細(xì)胞源導(dǎo)管內(nèi)表面產(chǎn)生變形或不同心度，從而足以使顆?；蛩槠掣?、附著、貼著或以其他方式固定于連接器(20)的位置，導(dǎo)致在細(xì)胞源液流中傳輸?shù)臉悠啡洪g可能發(fā)生交叉污染，或?qū)е录?xì)胞源流體通路受到阻滯或其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
常規(guī)流式細(xì)胞儀的第六個(gè)顯著問(wèn)題是，細(xì)胞源導(dǎo)管(17)的內(nèi)表面或細(xì)胞源導(dǎo)管(17)的注射器(19)部分的內(nèi)表面粗糙或不平整，足以使細(xì)胞或顆?；旌先旱谋碛^分辨率下降。此問(wèn)題的一個(gè)方面是，所述使表面粗糙或不平整的表面部分有時(shí)可從細(xì)胞源導(dǎo)管的內(nèi)表面脫落下來(lái)并可停留在流動(dòng)通道內(nèi)。有時(shí)，可以導(dǎo)致細(xì)胞源導(dǎo)管(17)受到阻滯或造成堵塞。此問(wèn)題的另一方面是，顆粒與細(xì)胞源導(dǎo)管的粗糙或不平整部分相互作用，使液流的速度不均衡，從而引起使細(xì)胞群的表觀分辨率下降的偏轉(zhuǎn)力或渦流。
常規(guī)流式細(xì)胞儀的第七個(gè)顯著問(wèn)題是噴嘴(2)的橫截面積太大。噴嘴(2)的橫截面積越大，則泡沫或碎片或顆粒(16)可在其上面粘附的面積以及與噴嘴裝置內(nèi)流體動(dòng)態(tài)相互干擾的面積越大，而且穩(wěn)定于噴嘴(2)內(nèi)的壓力駐波和次諧壓力波也越復(fù)雜。
常規(guī)流式細(xì)胞儀的第八個(gè)顯著問(wèn)題是，噴嘴(2)的主體包括第一噴嘴體元件(21)和第二噴嘴體元件(22)。這樣就會(huì)使噴嘴內(nèi)表面發(fā)生的變形或粗糙，從而足以使液流的層流受到干擾或消失，使得常規(guī)流式細(xì)胞儀的分辨能力下降；或者如果第一噴嘴體元件(21)和第二噴嘴體元件(22)的兩種制造材料具有不同的彈性，則它們可以從振蕩器(6)各自傳遞不同次諧波特征的壓力波，這樣會(huì)使顆粒流動(dòng)通路的臨界區(qū)域的層流在即將噴出噴嘴(2)之前在出口(5)處發(fā)生變形。
常規(guī)流式細(xì)胞儀的第九個(gè)顯著問(wèn)題是，難以精確測(cè)量顆?；蚣?xì)胞內(nèi)的DNA，所述顆?；蚣?xì)胞如哺乳動(dòng)物活精子，該哺乳動(dòng)物活精子因DNA含量上的已知差異，其結(jié)合的熒光染料的量也不同，但是變異系數(shù)也很大，這使得測(cè)量結(jié)果不明顯。例如，如Johnson等，《Theriogenology(動(dòng)物生殖學(xué))》，Vol.52，No.81326(1999)所揭示的，與Y染色體大小對(duì)活精子總DNA的影響相比，X染色體大小對(duì)活精子總DNA的影響由具體哺乳動(dòng)物中X染色體和Y染色體的大小差別以及DNA的真正含量(所有其他染色體的數(shù)目和大小)所決定。具體來(lái)說(shuō)，(X-Y)/X在人類中為2.8％，兔為3.0％，公豬(豬)為3.6％，公馬(馬)為3.7％，公牛(牛)為3.8％，狗為3.9％，公羊(羊)為4.2％，栗鼠高達(dá)7.5％。但是Welch等揭示，用常規(guī)方法分析精子，差異系數(shù)(CV)在0.9％時(shí)相當(dāng)好，甚至可以高達(dá)1.97％(Welch等，《Theriogenology(動(dòng)物生殖學(xué))》，Vol.52，No.81348(1999))。因此，尤其是對(duì)于諸如(X-Y)/X數(shù)值為2.8％這樣非常低的人類等物種來(lái)說(shuō)，使CV降到小于1％非常關(guān)鍵，如果可能的話優(yōu)選使之盡可能接近零。本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所用的分辨率的定義指，根據(jù)從各單個(gè)精子所得的測(cè)量值與一已知值的接近程度，某裝置將精子分辨成兩個(gè)精子群的能力，其主要的負(fù)面決定性因素為所分析群體的高CV。
本發(fā)明解決了常規(guī)流式細(xì)胞儀裝置在以下方面的分辨率低的各種問(wèn)題根據(jù)顆粒特征，將流動(dòng)可分離的顆粒或細(xì)胞(16)、細(xì)胞尤其是精子分離成富集群，或者對(duì)于精子而言，將其分離成富含X染色體精子群及富含Y染色體精子群。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的是提供分辨率得以提高的流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀可以使所分離的群體的同質(zhì)性得以提高，所述群體根據(jù)一種或一種以上的顆粒性質(zhì)進(jìn)行分離。
本發(fā)明此目的的第一方面是將來(lái)自流體源(4)的流體導(dǎo)入噴嘴(2)中，所述的導(dǎo)入方式使噴嘴(2)內(nèi)液流(3)的層流的形成減少了擾亂、湍動(dòng)、變形或遲滯，或是利用核心流來(lái)形成層流，所述核心流含有于注射位點(diǎn)(18)處導(dǎo)入噴嘴的顆粒或細(xì)胞(16)。
本發(fā)明此目的第二方面是在細(xì)胞源(1)和注射位點(diǎn)之間提供細(xì)胞源液流，該液流相對(duì)于細(xì)胞源導(dǎo)管(17)內(nèi)細(xì)胞源液流的截面保持面積速度基本不變，或是基本消除了由于細(xì)胞源中的弧度、變形或彎曲而帶來(lái)的細(xì)胞源液流速度的變化，或減少了細(xì)胞源導(dǎo)管(17)內(nèi)的障礙、阻塞或顆粒聚積或集中的區(qū)域。
本發(fā)明此目的第三方面是提供可調(diào)節(jié)的細(xì)胞源液流結(jié)構(gòu)，對(duì)于特定種類的顆?；蛱囟愋偷念w粒差別特性來(lái)說(shuō)，對(duì)于從細(xì)胞源(1)到注射位點(diǎn)(18)的顆粒(16)的流體，所述細(xì)胞源液流結(jié)構(gòu)提供了一致的細(xì)胞源液流流量。
本發(fā)明此目的第四方面是提供可調(diào)節(jié)的同軸液流，對(duì)于特定種類顆?；蛱囟愋偷念w粒差別特性來(lái)說(shuō)，所述同軸液流提供了一致性更高的核心流，該核心流含有在噴嘴開(kāi)口(5)下所形成的液流(8)中的顆粒(16)。
本發(fā)明此目的第五方面是提供可替換的細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的顆粒注射器部分(31)。
本發(fā)明此目的第六方面是除去接在細(xì)胞源導(dǎo)管(17)的注射器部分(19)入口末端的連接器(20)。
本發(fā)明此目的第七方面是消除或顯著減少細(xì)胞源導(dǎo)管(17)內(nèi)壁的粗糙或不平整。
本發(fā)明此目的第八方面是提供連續(xù)而完整的整體噴嘴，從而實(shí)質(zhì)上消除或減少噴嘴內(nèi)部圓形橫截面的不同心度，或?qū)嵸|(zhì)上消除或減少噴嘴內(nèi)表面的變形。
本發(fā)明另一重要目的是提供可在整個(gè)流式分選過(guò)程中維持哺乳動(dòng)物精子更大存活力的精子分離裝置或方法。
本發(fā)明的其他重要目的在下面的發(fā)明描述和附圖中自然得以明確。


圖1為常規(guī)流式細(xì)胞儀的示意圖。
圖2為常規(guī)流式細(xì)胞儀的示意圖。
圖3為本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀的一個(gè)具體實(shí)施方案。
圖4對(duì)常規(guī)流式細(xì)胞儀的噴嘴裝置(圖4a)和常規(guī)流式細(xì)胞儀的注射器部分(圖4b)與本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀中相應(yīng)的噴嘴裝置(圖4c)和本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀中分辨率增強(qiáng)的注射器部分(圖4d)進(jìn)行比較。
圖5對(duì)利用常規(guī)流式細(xì)胞儀處理牛精子核樣品所得的分辨率(圖5a)和利用本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀處理同樣的牛精子核樣品所得的分辨率(圖5b)進(jìn)行比較，兩者速率均為每秒25,000次事件。
圖6對(duì)用常規(guī)流式細(xì)胞儀以每秒50,000次事件的速率處理牛精子核樣品所得的分辨率(圖6a)和用本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀以每秒60,000次事件的速率處理同樣的牛精子核樣品所得的分辨率(圖6b)進(jìn)行比較。
圖7對(duì)用常規(guī)流式細(xì)胞儀以每秒100,000次事件的速率處理牛精子核樣品所得的分辨率(圖7a)和用本發(fā)明中分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀以每秒110,000次事件的速率處理同樣的牛精子核樣品所得的分辨率(圖7b)進(jìn)行比較。
圖8為本發(fā)明的顆粒注射器的一個(gè)具體實(shí)施方案。
圖9為本發(fā)明的內(nèi)部噴嘴體的一個(gè)具體實(shí)施方案。
圖10為本發(fā)明的外部噴嘴體的一個(gè)具體實(shí)施方案。
圖11為圖10所示本發(fā)明的外部噴嘴體具體實(shí)施方案的截面B-B。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及一種高分辨率的流式細(xì)胞儀，在根據(jù)各種細(xì)胞或顆粒的個(gè)別特性或其組合來(lái)將混合的細(xì)胞群、精子群或顆粒群相互分離的時(shí)候，該流式細(xì)胞儀可增強(qiáng)分辨能力。
同樣，盡管本發(fā)明提供了分離精子或分離?；蝰R的完整活精子的具體實(shí)施例，但是應(yīng)理解，所述分辨率得以增強(qiáng)的技術(shù)可以應(yīng)用于各種類型的流動(dòng)可分離顆粒的分離，所述流動(dòng)可分離顆粒包括但不限于以各種方式收集、處理或儲(chǔ)存的細(xì)胞、精子或精子核。
還應(yīng)當(dāng)理解，含X染色體的精子群和含Y染色體的精子群包括由精子經(jīng)流式分離或分選所得的富含群體，所述精子得自哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體，這些哺乳動(dòng)物包括但不限于人類；其他哺乳動(dòng)物有例如牛科、馬科、鹿科、ovids、犬科、貓科、羊、豬或駱駝；海洋動(dòng)物如鯨目動(dòng)物(各種鯨或海豚)；尤其包括瀕臨滅絕的哺乳動(dòng)物；和以下種屬的特定個(gè)體動(dòng)物學(xué)樣本、稀有或珍貴樣本以及提供動(dòng)物養(yǎng)殖、獸群管理系統(tǒng)、人工授精方案、低溫儲(chǔ)存中所用精子的哺乳動(dòng)物樣本；或是例如由Wilson，D.E.和Reeder，D.M.，《Mammal Species of the World(世界哺乳動(dòng)物物種)》，Smithsonian InstitutionPress，(1993)所列的哺乳動(dòng)物，在此將其以參考的方式引入本文。
列出此動(dòng)物清單是為了示例可以獲得精子的從大量不同的哺乳動(dòng)物，或其精子可用本文所述的分辨率得以增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀的發(fā)明進(jìn)行流式分選的大量不同的哺乳動(dòng)物，而不是將所述分辨率得以增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀的發(fā)明局限于分析或流式分離任一特定的顆?；騺?lái)自特定類型哺乳動(dòng)物或單個(gè)哺乳動(dòng)物的精子。
用本文所述分辨率得以增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀的發(fā)明所獲得的細(xì)胞、精子或顆粒可以應(yīng)用于包括但不限于人工授精方案的各種用途或產(chǎn)品中；或作為商用方法的一部分，所述的商用方法有例如專利合作條約申請(qǐng)PCT/US01/18879或PCT/US99/17165所述的方法；或在專利合作條約申請(qǐng)PCT/US98/27909所述低劑量授精方案中使用；或用于如專利合作條約申請(qǐng)PCT/US01/45237所述包括人類在內(nèi)的動(dòng)物的卵母細(xì)胞體外受精，在此將上述所提及的各申請(qǐng)或文獻(xiàn)以參考的方式引入本文。
術(shù)語(yǔ)“純度”應(yīng)理解為具有特定差別特征或所需特征組合的被分離精子群的百分?jǐn)?shù)。例如，當(dāng)精子群根據(jù)含X染色體而不含Y染色體進(jìn)行分離時(shí)，純度為90％的含X染色體精子群包括其中有90％的精子個(gè)體含有X染色體的精子群，而該精子群中的10％有可能含有Y染色體。同樣，就根據(jù)本發(fā)明而產(chǎn)生的含X染色體精子群或含Y染色體精子群的純度來(lái)說(shuō)，可以具有比常規(guī)流式分離裝置更高的純度，或可具有以下純度約70％～99％，或者可選自90％～約100％、約91％～約100％、約92％～約100％、約93％～約100％、約94％～約100％、約95％～約100％、約96％～約100％、約97％～約100％、約98％～約100％、約99％～約100％。
重要的是，盡管本說(shuō)明書(shū)包括本發(fā)明的大量實(shí)施方案，其中一些可包括分離的含X染色體和含Y染色體的精子群，而且盡管本說(shuō)明書(shū)還進(jìn)一步公開(kāi)了分辨率增強(qiáng)的精子分離裝置或方法如何增強(qiáng)混合精子群的分辨率的具體方面，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的基本思想可應(yīng)用于具有類似或不同顆粒差別特征或事件差別特征的其他類型的顆粒或事件。應(yīng)理解本發(fā)明可應(yīng)用于各種情況，包括分辨光生信號(hào)的微小差別的能力需要增強(qiáng)的情況。
另外，盡管本公開(kāi)內(nèi)容描述了將含X染色體的精子與含Y染色體的精子進(jìn)行流式分離的裝置和方法的實(shí)施方案，但對(duì)本發(fā)明這些實(shí)施方案的描述并不意味著將本發(fā)明的范圍縮小到僅限于精子的流式分離，或僅限于分辨率高的或分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀精子分離系統(tǒng)，而是指這些實(shí)施方案是以可行的方式示例性說(shuō)明本發(fā)明的基本思想，以便其可應(yīng)用于多種顆?；蛴猛局小?br> 現(xiàn)主要參見(jiàn)圖3，本發(fā)明可包括至少一個(gè)流體源導(dǎo)管(23)，該流體源導(dǎo)管將流體源流(24)相對(duì)于噴嘴(25)內(nèi)流動(dòng)的液流(26)成一定角度導(dǎo)入分辨率增強(qiáng)的噴嘴(25)，該噴嘴(25)通過(guò)細(xì)胞傳感系統(tǒng)(13)來(lái)增強(qiáng)顆粒的分辨率。導(dǎo)入的角度可根據(jù)所要區(qū)分的顆粒群類型的不同而不同。就本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，流體源導(dǎo)管(23)可以將流體源流(24)以與分辨率增強(qiáng)的噴嘴(25)的中心縱軸成約0度～約45度的角度導(dǎo)入。對(duì)于本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，多個(gè)流體源導(dǎo)管(23)可以將多個(gè)流體源流(24)導(dǎo)入分辨率增強(qiáng)的噴嘴(25)。
還是主要參見(jiàn)圖3，本發(fā)明還可包括在細(xì)胞源導(dǎo)管(28)內(nèi)速度對(duì)稱的細(xì)胞源液流(27)。速度對(duì)稱的細(xì)胞源液流提供了具有以下速度的細(xì)胞源液流(27)，該速度在穿過(guò)細(xì)胞源液流(27)的垂直截面上基本達(dá)到對(duì)稱，這種對(duì)稱可包括與接近或處于細(xì)胞源導(dǎo)管(28)內(nèi)表面處的速度下降相關(guān)的預(yù)期的對(duì)稱，而且避免或減少穿過(guò)細(xì)胞源液流(27)垂直截面的速度不對(duì)稱。為了形成細(xì)胞源液流(27)的速度對(duì)稱，本發(fā)明的某些實(shí)施方案可使用一種基本為直線的細(xì)胞源導(dǎo)管(28)。直線細(xì)胞源導(dǎo)管(28)給細(xì)胞源液流(27)提供了一條基本上沒(méi)有弧度、彎曲或回折的直線形流動(dòng)通路，或者比常規(guī)技術(shù)更為筆直的流動(dòng)通路，而細(xì)胞源液流(27)流過(guò)這種具有弧度、彎曲或回折的流動(dòng)通路時(shí)，會(huì)使細(xì)胞源液流(27)的一部分速度下降或一部分速度升高。同樣，與常規(guī)技術(shù)相比，速度對(duì)稱的細(xì)胞源液流(27)給下列如圖1所示常規(guī)類型細(xì)胞源液流(29)所帶來(lái)的問(wèn)題提供了解決方案。
現(xiàn)主要參見(jiàn)圖1所示的常規(guī)技術(shù)，當(dāng)液流速度不對(duì)稱時(shí)，導(dǎo)入細(xì)胞液源液流(29)的細(xì)胞可分別以不同的速率穿行，由細(xì)胞源(1)進(jìn)入常規(guī)細(xì)胞源液流(27)的顆粒的起始分布受到影響，導(dǎo)致注射位點(diǎn)(18)處存在的細(xì)胞分布顯著不同，從而可影響顆粒群的表觀分辨率。
對(duì)于常規(guī)技術(shù)的具體問(wèn)題，細(xì)胞源導(dǎo)管(17)可能有例如90°的彎曲，迫使常規(guī)細(xì)胞源液流(29)對(duì)小半徑的弧度或彎曲發(fā)生響應(yīng)。在這些回折處，在細(xì)胞源液流(29)的整個(gè)截面區(qū)域或其中一部分，細(xì)胞源液流(29)的速度可能突然下降。在小內(nèi)徑的彎曲處細(xì)胞源流(29)的速度下降，對(duì)于鄰近較大外徑的液流的速度下降而言，其下降將顯著減少。在一些情況下這會(huì)造成顆粒在細(xì)胞源導(dǎo)管(17)內(nèi)的弧度或彎曲處堆積或聚積，從而進(jìn)一步加劇細(xì)胞源液流(29)內(nèi)的不對(duì)稱，并進(jìn)一步干擾注射位點(diǎn)(18)處的顆粒遞送分布。有時(shí)侯，這些顆?？梢允辜?xì)胞源液流(29)的流動(dòng)部分或完全中斷，導(dǎo)致流式分離過(guò)程完全失敗。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案可以單獨(dú)包括或與本發(fā)明其他方面一起包括一個(gè)在細(xì)胞源液流(27)和細(xì)胞源導(dǎo)管(28)內(nèi)部之間的低阻力界面。對(duì)于諸如塑料或金屬等材料，所述低阻力界面可以包括拋光的或使之變光滑的細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的內(nèi)表面?？梢詫?nèi)表面拋光或使之變光滑，直到所觀察到的分辨率增量提高到最大值或所需的值。此外，可通過(guò)替換用于制造細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的材料來(lái)實(shí)現(xiàn)所述界面的低阻力或變形。例如，玻璃管或Telfon管可取代金屬或其他類型的塑料管。還可通過(guò)對(duì)細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的內(nèi)表面進(jìn)行化學(xué)處理來(lái)獲得低阻力細(xì)胞源導(dǎo)管(28)。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，塑料或玻璃材料可以例如硅烷化，而金屬可進(jìn)一步用酸洗液來(lái)使之鈍化。
還是主要參見(jiàn)圖3，本發(fā)明的實(shí)施方案可包括具有可調(diào)節(jié)的同軸液流特性的細(xì)胞源液流(27)。由于顆粒的分辨率可依賴于諸如以下操作參數(shù)所產(chǎn)生的液流特征溫度、液流速度、液流壓力、液流在其中流動(dòng)的導(dǎo)管的構(gòu)造、液流中的顆粒的注射位點(diǎn)以及注射入液流中的顆粒的類型等，因此為了獲得、維持或增強(qiáng)顆粒群的分辨率，控制液流特征很重要。同樣，細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的直徑或長(zhǎng)度、注射位點(diǎn)(30)在細(xì)胞源液流(27)的噴嘴(25)內(nèi)的位置，可以單獨(dú)或共同影響顆粒群的分辨率。
在本發(fā)明的一些具體方案中，顆粒注射器(31)可以具有選擇性可變調(diào)節(jié)元件(35)，該可變調(diào)節(jié)元件(35)可以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)或改變噴嘴開(kāi)口(5)與顆粒注射器(31)在液流(26)中的位置之間的距離，顆粒注射器(31)在該位置將來(lái)自細(xì)胞源(1)的顆粒(16)夾帶入液流(26)。在從第一套操作條件變?yōu)榈诙撞僮鳁l件時(shí)，無(wú)論操作條件的改變是否包括鞘液、精子種類、溫度、液流壓力、液流溫度或其他變化，顆粒注射器(31)的選擇性可變調(diào)節(jié)均可改變液流特性，以便補(bǔ)償所述操作條件的變化。重要的是，根據(jù)細(xì)胞的特征，通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒注射器(31)和噴嘴開(kāi)口(5)之間的距離可以使分辨率得到提高。如圖5～7所示，對(duì)于精子來(lái)說(shuō)，利用本發(fā)明可以提高根據(jù)含有X染色體或含有Y染色體來(lái)分離精子的分辨率。
為了調(diào)節(jié)注射位置(30)，可以通過(guò)各種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)顆粒注射器(31)的選擇性可變調(diào)節(jié)。首先，如圖3b所示，嚙合于顆粒注射器(31)和噴嘴體(25)之間的一對(duì)匹配的螺旋絲(36)可以對(duì)顆粒注射器(31)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)，從而改變注射位點(diǎn)(30)的位置。其次，如圖3c所示，可通過(guò)提供可滑動(dòng)接合(37)而在顆粒注射器(31)和噴嘴體(25)之間實(shí)現(xiàn)可調(diào)的接合。第三，如圖3、4d和8a所示，多個(gè)可交換顆粒注射器(31)可以具有替代的長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度由與噴嘴體(25)相匹配的銷接制動(dòng)器(38)所確定。
現(xiàn)主要參見(jiàn)圖3和圖4，本發(fā)明可進(jìn)一步包括整體噴嘴(25)(圖4d)。與圖1和圖4a所示的噴嘴(2)不同，本發(fā)明可以消除在匹配兩個(gè)或兩個(gè)以上的分離的噴嘴元件時(shí)所產(chǎn)生的不同心度，所述分離的噴嘴元件如圖1和圖4b所示的第一噴嘴元件(21)和第二噴嘴元件(22)。
還是主要參見(jiàn)圖3和圖4，本發(fā)明可進(jìn)一步包括壓力套管連接器(32)，以取代常規(guī)技術(shù)中的連接器(20)。壓力套管連接器(32)的一個(gè)具體方案可包括細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的終末端，細(xì)胞源導(dǎo)管(28)具有足夠的回彈性來(lái)與顆粒注射器(31)的管相配合。本發(fā)明的此具體方案可包括細(xì)胞源導(dǎo)管，該細(xì)胞源導(dǎo)管包含Silastic或其他具有Silastic樣性質(zhì)的材料，或者細(xì)胞源導(dǎo)管(28)具有足夠的彈性，如Teflon，或足夠的回彈性，如Tygon，從而與顆粒注射器(31)的管的外表面相配合。
現(xiàn)主要參見(jiàn)圖4a至圖4d，其對(duì)常規(guī)的噴嘴裝置(圖4a和4b)和本發(fā)明的噴嘴裝置(圖4c和圖4d)進(jìn)行了比較。比較圖1與圖3以及圖4b與圖4d可以理解，常規(guī)技術(shù)需要在細(xì)胞源(1)和注射位點(diǎn)(1 8)之間使用較長(zhǎng)的流動(dòng)通路(見(jiàn)圖4b中較長(zhǎng)的顆粒注射器管)，并且在流體源和注射位點(diǎn)(18)之間使用較長(zhǎng)的液流通路(3)。常規(guī)技術(shù)所使用的較長(zhǎng)流動(dòng)通路導(dǎo)致了如圖5a、6a和7a所示的使不同細(xì)胞群分辨率下降的操作條件，與此相對(duì)的是，本發(fā)明使用較短的流動(dòng)通路導(dǎo)致了如圖5b、6b和7b所示的使不同細(xì)胞群分辨率提高的操作條件。
對(duì)于本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，可通過(guò)縮短細(xì)胞源(1)和注射位點(diǎn)(30)之間的細(xì)胞源導(dǎo)管(28)的總長(zhǎng)度來(lái)縮短細(xì)胞液流(27)的長(zhǎng)度，直到分辨率提高到最高為止。細(xì)胞源(1)和注射位點(diǎn)(30)之間的距離可以被制成顯著短于常規(guī)技術(shù)的長(zhǎng)度，如圖4c和4d所示，其長(zhǎng)度可短于4英寸。
對(duì)于本發(fā)明流式細(xì)胞儀的具體配置以及所要分離的顆粒群類型來(lái)說(shuō)，可以單獨(dú)或聯(lián)合使用本發(fā)明的不同實(shí)施方案以提高顆粒群、細(xì)胞群或精子群之間的分辨率。具體地說(shuō)，對(duì)于如圖5b、圖6b和圖7b所示的本發(fā)明用于分離牛精子的實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，使用自細(xì)胞源(1)至注射位點(diǎn)(30)之間流動(dòng)通路更短但保持注射位點(diǎn)(30)與噴嘴開(kāi)口(5)距離不變的連體噴嘴(25)，可以顯著提高含X染色體的精子群(39)與含Y染色體的精子群(40)之間的分辨率。但是，此實(shí)施例并不是在分析精子時(shí)將本發(fā)明可調(diào)節(jié)注射位點(diǎn)(30)限制于分辨牛精子群所用的位置。對(duì)于本發(fā)明分析其他種類哺乳動(dòng)物物種精子的實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，注射位點(diǎn)可以離噴嘴開(kāi)口更近或更遠(yuǎn)，以提高分辨率或初步分辨精子群。
再次主要參見(jiàn)圖4，本發(fā)明可以包括噴嘴(25)內(nèi)的面積縮小的液流(26)。對(duì)于本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，可將噴嘴(2)內(nèi)液流的常規(guī)截面積(如圖4a和4b所示)充分縮小，例如可如圖4c和圖4d所示那樣縮小。對(duì)于本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，當(dāng)與圖4a和4b所示作為尺度的常規(guī)技術(shù)(Cytomation SX MoFlo噴嘴)相比較時(shí)，液流(26)截面積可縮小到常規(guī)液流(33)的截面積的四分之一至六分之一，或更小。另外，對(duì)于本發(fā)明如圖4c和4d所示的某些實(shí)施方案，可將常規(guī)噴嘴(2)的長(zhǎng)度充分縮短，以提供更短的液流流動(dòng)通路。具體地說(shuō)，對(duì)于牛精子的流式分離來(lái)說(shuō)，圖4c所示為液流截面積縮小為約占常規(guī)技術(shù)的液流截面積的五分之一。
現(xiàn)主要參見(jiàn)圖5、6和7，其示范了本發(fā)明用于區(qū)分含X染色體的牛精子核和含Y染色體的牛精子核的分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀的實(shí)例之一。
本發(fā)明分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀按如下條件設(shè)置液流壓50.0psi(磅/平方英尺)噴嘴開(kāi)口 70μm激光功率 150mW光電倍增管電壓220/230V標(biāo)準(zhǔn)品新鮮公牛精子核樣品 Equinox批號(hào)19901
但是使用30～40psi的較低液流壓也可獲得基本上相同的結(jié)果，并提高精子的生育力。
由圖5、圖6和圖7可以理解，將常規(guī)技術(shù)(圖5a、圖6a和圖7a)和本發(fā)明高分辨率流式細(xì)胞儀(圖5b、圖6b和圖7b)以每秒約25,000次事件、每秒約50,000～約60,000次事件或每秒約100,000～約110,000次事件這三個(gè)不同事件速度所取得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。當(dāng)用熒光染料染色的精子發(fā)出可檢測(cè)的熒光發(fā)射時(shí)就記錄為一次事件。事件的速度越快，則通常根據(jù)所檢測(cè)熒光發(fā)射的強(qiáng)度不同來(lái)區(qū)分精子越困難。對(duì)于所有的事件速率來(lái)說(shuō)，利用本文所述的高分辨率流式細(xì)胞儀發(fā)明可以更好地區(qū)分含X染色體的牛精子核群和含Y染色體的牛精子核群的混合群。
現(xiàn)主要參見(jiàn)圖8～11，這些圖顯示了本發(fā)明實(shí)施方案的組件。圖8顯示了長(zhǎng)度縮短、可替換的顆粒注射器(31)的具體方案，所述顆粒注射器(31)具有與噴嘴體(25)相匹配的銷接制動(dòng)器和帶斜面的尖端(41)。對(duì)于本發(fā)明的一些實(shí)施方案來(lái)說(shuō)，顆粒注射器的直徑可為約1毫米～約2毫米，孔內(nèi)徑約0.2毫米～約0.3毫米。帶斜面的尖端可以與垂直于顆粒注射器縱軸的平面相交成約84度，斜面的末端寬度約為0.5毫米～約0.7毫米。銷接制動(dòng)器(38)可包括平臺(tái)(42)，以使旋轉(zhuǎn)方向一致。
圖9和圖10顯示了通過(guò)平臺(tái)銷接以便以滑動(dòng)方式支撐和固定顆粒注射器(31)的內(nèi)部噴嘴體(43)的具體方案。內(nèi)部噴嘴體(43)插入如圖10所示的外部噴嘴體(44)中。外部噴嘴體還包括至少一條來(lái)自流體源(45)的流動(dòng)通路(圖10所示的本發(fā)明實(shí)施方案中顯示2條)，并且可將該外部噴嘴體設(shè)置為用壓力接頭或防漏接頭將流體源導(dǎo)管與外部噴嘴體(44)相連。
圖11提供了附加的圖11a和圖11b，其中附加的圖11a顯示外部噴嘴體(44)的截面B-B，其顯示鞘液通路的具體結(jié)構(gòu)，圖11b提供了所述外部噴嘴體的透視圖。
由圖4c、圖4d、圖9和圖11可以理解，整體噴嘴(25)與外部噴嘴體(44)接合，并可用固定環(huán)(45)固定到位。本發(fā)明的噴嘴裝置可用于取代圖1、圖2、圖4a及圖4b所示的常規(guī)噴嘴，以提供如圖6b、圖7b和圖8b所示的增強(qiáng)的分辨率。
對(duì)于不對(duì)稱的顆粒類型如精子來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的噴嘴裝置可以使噴嘴體中的不對(duì)稱顆粒更好的取向，從而在進(jìn)行分析時(shí)提供更好的一致性，尤其是當(dāng)所述分析包括測(cè)定所發(fā)射的熒光的量或細(xì)胞量(volume)時(shí)更是如此。
另外，根據(jù)所分析的顆粒、細(xì)胞或精子的類型，可在每秒20,000次事件～100,000次事件這樣非常高的事件速度實(shí)現(xiàn)分辨率的提高。結(jié)果在每秒內(nèi)有更多數(shù)量的精子可以得以分離、分選、收集或回收。該方法可以在每個(gè)單位時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)更多的產(chǎn)品，并減少了單位生產(chǎn)成本，這是由于流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分選儀可占生產(chǎn)分離顆粒的總體成本中的很大一部分。
當(dāng)本發(fā)明的噴嘴裝置采用低壓液流操作時(shí)，甚至在高于每秒1000次分選的分選速度下，所收集的經(jīng)分離或經(jīng)分選的精子可具有強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)力、存活力和生育力(精子生育力特征)，而且對(duì)于某些類型的精子來(lái)說(shuō)，這些經(jīng)分離或經(jīng)分選的精子具有與從精液中新鮮收集的精子基本相同的精子生育力特征。
因?yàn)槔迷搰娮祗w裝置可以獲得高的分辨率，所以即使是分選速度高于常規(guī)噴嘴所能達(dá)到的速度，所分選的顆粒的純度也可得以提高。
本發(fā)明的噴嘴裝置較少發(fā)生顆粒注射器(31)的部分或完全阻塞的情況。因此，不能操作典型流式細(xì)胞儀或細(xì)胞分選器的時(shí)間較少。
在注射管發(fā)生阻塞的情況下，本發(fā)明的噴嘴裝置允許快速移去注射管而不必將整個(gè)噴嘴裝置拆開(kāi)或卸下來(lái)。然后可以很容易地對(duì)注射管進(jìn)行檢查、清洗和重新安裝，使得此類清洗工作帶來(lái)的停工期短得多，從而使分選儀器有更多時(shí)間用于生產(chǎn)。
本發(fā)明的噴嘴裝置還允許由不熟練(或半熟練)的操作工來(lái)清洗注射管，而不需要熟練的檢修員。這就是意味著可以減少排除注射管部分或完全阻塞故障的勞動(dòng)力成本，也意味著操作工可以立即排除這類故障而不必浪費(fèi)時(shí)間去尋找合適的維修人員。
本發(fā)明的噴嘴裝置可使操作工觀察到分離分辨率的下降并立即加以修正。使用常規(guī)噴嘴裝置時(shí)，部分阻塞不會(huì)使儀器發(fā)生中止，但是阻塞逐步增加，可導(dǎo)致儀器在多個(gè)小時(shí)、多天或甚至多個(gè)星期內(nèi)分辨能力慢慢喪失，而在分辨率變差的噴嘴在運(yùn)行的整段時(shí)間內(nèi)，儀器通常產(chǎn)出純度低得多的產(chǎn)品，尤其是在需要以低得多的分選速度運(yùn)行時(shí)可產(chǎn)出的產(chǎn)品量更少(產(chǎn)率下降)。實(shí)際上，經(jīng)常是在熟練技術(shù)人員更換或清洗噴嘴并即刻發(fā)現(xiàn)有所改善時(shí)，操作工才會(huì)注意到這種產(chǎn)率下降。
注射管可以很容易地加以替換，使得注射管可以是一次性使用或只使用一段非常短時(shí)間的管子。在流式細(xì)胞儀的一些用途中，如分選諸如人胚胎細(xì)胞、人精子、人骨髓細(xì)胞之類的材料時(shí)，需要使用復(fù)雜、冗長(zhǎng)的CIP(原位清洗)方案來(lái)確保消除樣品間的交叉污染，如果用以下方案替換CIP過(guò)程，那就方便和有益了，所述方案為替換所有與樣品接觸的部分，這需要替換樣品注射管。
本發(fā)明的注射管更短，噴嘴也更小，這樣可以防止在檢查或裝配過(guò)程中該管發(fā)生某種變形，例如彎曲，并使該管在噴嘴內(nèi)更難自由移動(dòng)(振動(dòng))。這樣就可使注射管的尖端更靠近噴嘴內(nèi)的所需注射位點(diǎn)，減少注射管在特定噴嘴幾何結(jié)構(gòu)中諧波共振的數(shù)量和振幅。
本發(fā)明中直線形的注射管可以使注射管可深、可淺地插入噴嘴內(nèi)，從而使用戶可調(diào)節(jié)樣品被注射入液流的位點(diǎn)與噴嘴開(kāi)口位點(diǎn)之間的確切距離。可以通過(guò)觀察分辨率數(shù)據(jù)來(lái)影響注射管在噴嘴內(nèi)的定位的確定(反饋控制環(huán)路)，于是，當(dāng)儀器操作的其他方面或樣品發(fā)生改變時(shí)，可以確定可動(dòng)態(tài)變化的注射點(diǎn)位置。
大部分噴嘴裝置均為昂貴的組件，通常是由產(chǎn)商小量生產(chǎn)，他們不能制造出完全相同的亞組件。因此，在實(shí)踐中，必須仔細(xì)測(cè)試每一噴嘴裝置，如果不精確的話需要重新制造甚或丟棄。本發(fā)明簡(jiǎn)化了噴嘴裝置的許多部件，有助于更可靠地生產(chǎn)噴嘴裝置的各種亞組件，并使得注射管很容易地得以替換，而更換注射管正是噴嘴工作狀態(tài)不好的較常見(jiàn)原因之一。所有這些均可以降低制造成本，更有效地利用各部件，由此又可以降低一個(gè)或一個(gè)以上生產(chǎn)儀器的維護(hù)成本，所述生產(chǎn)儀器的生產(chǎn)設(shè)置為每天24小時(shí)、每周7天(24/7)運(yùn)轉(zhuǎn)。
本發(fā)明還可包括利用本發(fā)明任意實(shí)施方案所分離或處理的精子而產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胚胎或哺乳動(dòng)物；或可包括根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案所分離的精子而產(chǎn)生的性別預(yù)先選定的哺乳動(dòng)物胚胎或哺乳動(dòng)物；或可包括利用根據(jù)本發(fā)明制備的精子授精樣品所產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胚胎或哺乳動(dòng)物，所述精子授精樣品具有富含X染色體的精子群或富含Y染色體的精子群；或根據(jù)本發(fā)明任意實(shí)施方案所產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物胚胎或哺乳動(dòng)物，其中精子授精樣品中的精子數(shù)量少于給該特定種類哺乳動(dòng)物授精的典型精子用量。
從上文中可以很容易地理解，本發(fā)明的基本思想可以用不同途徑來(lái)具體實(shí)施。本發(fā)明涉及高分辨率的精子處理系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括技術(shù)和裝置，其中的一些實(shí)施方案用于提供高分辨率或分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，該流式細(xì)胞儀系統(tǒng)可用于各種顆粒、細(xì)胞或精子，所述的技術(shù)和裝置用來(lái)根據(jù)選定顆粒的特征將所述顆粒高分辨率地分開(kāi)并分離成富含群體。
在此申請(qǐng)中，通過(guò)所述各種裝置所得的部分結(jié)果和應(yīng)用中的固有步驟公開(kāi)了各種精子處理技術(shù)。它們只是利用所述目標(biāo)裝置的自然結(jié)果。另外，盡管公開(kāi)了一些裝置，但是應(yīng)該理解，這些裝置不僅實(shí)現(xiàn)了某些方法，而且這些裝置可以以多種方式加以變更。重要的是，如前所述，所有這些方面應(yīng)理解為包括于本公開(kāi)內(nèi)容中。
這份臨時(shí)申請(qǐng)中所包括的討論，其目的是為了提供基本的描述。讀者應(yīng)當(dāng)清楚，具體的討論可能并未明確地描述所有可能的實(shí)施方案，許多替代方案是隱含的。它也可能沒(méi)有充分地解釋本發(fā)明的普遍性質(zhì)，也可能沒(méi)有明確地顯示各個(gè)性質(zhì)或元件實(shí)際上如何代表大量不同功能或大量替代方案或等同元件。同樣，這些也隱含地包括在本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容中。當(dāng)從裝置術(shù)語(yǔ)的角度描述本發(fā)明時(shí)，裝置的每一元件隱含地執(zhí)行一種功能。裝置權(quán)利要求不僅可包括所述的裝置，還可以包括用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明及每個(gè)元件所執(zhí)行的功能的方法或過(guò)程的權(quán)利要求。所有描述及術(shù)語(yǔ)均并非是對(duì)權(quán)利要求范圍的限制，權(quán)利要求的范圍包含在整個(gè)專利申請(qǐng)中。
同時(shí)應(yīng)當(dāng)理解的是，可以進(jìn)行各種變更而不會(huì)背離本發(fā)明的本質(zhì)。這些變更也隱含地包括在本說(shuō)明中。它們?nèi)詫儆诒景l(fā)明的范圍。廣泛的公開(kāi)內(nèi)容包括于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容之內(nèi)，其中包括已經(jīng)展示的顯式實(shí)施方案、大量隱含的替代實(shí)施方案及廣泛的方法或過(guò)程等，當(dāng)撰寫(xiě)完整專利申請(qǐng)的權(quán)利要求時(shí)可以依賴這些公開(kāi)內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)申請(qǐng)人以后(在所需最后期限之前提交)根據(jù)此臨時(shí)提交文件欲提交專利時(shí)，所述語(yǔ)言變更和廣泛的權(quán)利要求將會(huì)完成。隨后提交的完整專利申請(qǐng)將會(huì)要求對(duì)權(quán)利要求的基礎(chǔ)進(jìn)行審查，所述權(quán)利要求的基礎(chǔ)與申請(qǐng)人權(quán)益所認(rèn)為的一樣廣泛，并將其設(shè)計(jì)為產(chǎn)生獨(dú)立覆蓋本發(fā)明許多方面及作為一個(gè)綜合系統(tǒng)的專利。
而且，本發(fā)明及權(quán)利要求的每個(gè)不同元件還可以用多種方式獲得。本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)理解為包括每一個(gè)這樣的變化，不論它是任意的裝置的實(shí)施方案、方法或過(guò)程的實(shí)施方案的變更，還是甚至僅僅是其中任意元件的變更。特別是，應(yīng)該理解，由于本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容涉及本發(fā)明的元件，每個(gè)元件的文字可以用等同的裝置術(shù)語(yǔ)或方法術(shù)語(yǔ)來(lái)表達(dá)——甚至僅僅是相同的功能或結(jié)果。應(yīng)認(rèn)為這些等同的、更廣泛的甚至是更上位的術(shù)語(yǔ)包含于各元件或動(dòng)作的描述中。當(dāng)需要對(duì)本發(fā)明所包括的隱含的廣泛范圍進(jìn)行明確時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)可加以替換。僅舉一個(gè)例子來(lái)說(shuō)，應(yīng)該理解的是，所有的動(dòng)作均可以用執(zhí)行該動(dòng)作的裝置或促使產(chǎn)生該動(dòng)作的元件來(lái)表達(dá)。類似地，每一公開(kāi)的物理元件應(yīng)理解為包含了對(duì)所述物理元件執(zhí)行的動(dòng)作的公開(kāi)。就此最后一方面來(lái)說(shuō)，僅舉一個(gè)例子，“流式分選儀”的公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)理解為包含了“流式分選”動(dòng)作的公開(kāi)內(nèi)容，無(wú)論其是否明確討論過(guò)；反過(guò)來(lái)說(shuō)，當(dāng)有“流式分選”動(dòng)作的有效公開(kāi)時(shí)，這樣的公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)理解為包括了“流式分選儀”，甚至包括了“流式分選裝置”的公開(kāi)。這些變化及替代術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為明確包括在說(shuō)明書(shū)內(nèi)。
本專利申請(qǐng)中提及的任何法律、法令、規(guī)章或準(zhǔn)則的條款，或此專利申請(qǐng)中提及的專利、出版物或其他參考文獻(xiàn)均以參考的方式引入本文。另外，對(duì)于所用的每一術(shù)語(yǔ)，應(yīng)當(dāng)理解，除非其在本申請(qǐng)中的應(yīng)用與通用詞典中的解釋不一致，否則應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，本文引入了通用詞典中對(duì)各條術(shù)語(yǔ)的定義。在此以參考的方式引入例如《Random House Webster’s UnabridgedDictionary(蘭登書(shū)屋韋氏大詞典)》第二版的所有定義、替代術(shù)語(yǔ)和同義詞。最后，以參考方式引入該臨時(shí)專利申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)列表中所列出的所有文獻(xiàn)或其他與該申請(qǐng)同時(shí)提交的信息聲明均在此附上，并以參考的方式引入；但是，對(duì)于上述每一項(xiàng)來(lái)說(shuō)，這些以參考方式引入的信息或聲明可被認(rèn)為與此/這些發(fā)明的專利權(quán)不一致，很清楚這樣的聲明不能認(rèn)為是本申請(qǐng)人所做出的。
因此，應(yīng)理解為申請(qǐng)人至少主張如下權(quán)利i)本文所公開(kāi)和描述的各種精子處理裝置；ii)所公開(kāi)和描述的相關(guān)方法；iii)這些裝置和方法的類似、等同甚至是隱含的變化；iv)可以完成所公開(kāi)和描述的所示各個(gè)功能的替代設(shè)計(jì)；v)完成每一所示功能的替代設(shè)計(jì)和方法，其為隱含的完成所公開(kāi)和描述的功能的替代設(shè)計(jì)和方法；vi)作為分開(kāi)的和獨(dú)立的發(fā)明所顯示的各個(gè)性質(zhì)、元件及步驟；vii)由所公開(kāi)的不同系統(tǒng)或組分而改進(jìn)的申請(qǐng)；viii)由此類系統(tǒng)或元件所生成的最終產(chǎn)品；以及ix)基本在上文中并參考任何所附實(shí)施例所描述的方法和裝置，x)所公開(kāi)元件的各種組合及排列，及xi)從屬于每個(gè)或其中任何一個(gè)獨(dú)立權(quán)利要求或概念的每個(gè)從屬的潛在的從屬權(quán)利要求或概念。就這點(diǎn)上，應(yīng)理解的是出于實(shí)踐的原因及為了避免增加數(shù)以百計(jì)權(quán)利要求的可能性，申請(qǐng)人最終僅提交了具有最初的從屬權(quán)利要求的權(quán)利要求。支持應(yīng)當(dāng)被理解為達(dá)到有關(guān)新實(shí)體法規(guī)(newmatter laws)所要求的程度，以便能夠在一項(xiàng)獨(dú)立權(quán)利要求或概念之下增加各種的從屬權(quán)利要求或其他要素，作為任何其他獨(dú)立權(quán)利要求或概念的從屬權(quán)利要求或要素，上述法規(guī)包括但不限于《歐洲專利公約》第123條(2)款和美國(guó)專利法35 USC 132或其他此類法律。而且，如果使用或當(dāng)使用表示轉(zhuǎn)接關(guān)系的措詞“包含”時(shí)，根據(jù)習(xí)慣上對(duì)權(quán)利要求的解釋，使用該詞是為了保持本文權(quán)利要求為“開(kāi)放式”。因此，除非上下文需要，術(shù)語(yǔ)“包含”或諸如“包括“或“含有”等變化形式應(yīng)理解為，它們意指包括所聲明的要素或步驟或者要素或步驟的組，而不排除任何其他的要素或步驟或者要素或步驟的組。這樣的術(shù)語(yǔ)應(yīng)以其最廣泛的形式來(lái)解釋，以使申請(qǐng)人獲得法律許可的最廣泛的范圍。
權(quán)利要求
1.一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，該方法包括以下步驟a.從哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體獲取精子；b.在注射位點(diǎn)將所述精子注入液流中；c.在所述液流中形成大量液滴；d.在所述大量液滴的一部分液滴中夾帶所述精子中的一個(gè)精子；e.分析所述大量液滴的所述部分液滴中的精子；f.根據(jù)至少一種精子特征區(qū)分所述精子，從而產(chǎn)生兩個(gè)精子群；g.調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)，以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率。
2.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體選自牛、馬、羊、犬、貓、豬、海洋動(dòng)物或鹿。
3.如權(quán)利要求1所述流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述液流包含鞘液。
4.如權(quán)利要求3所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述鞘液包括選自含檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或HEPES緩沖液的鞘液。
5.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述從哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體獲取精子的步驟包括獲取第一種哺乳動(dòng)物的精子和獲取第二種哺乳動(dòng)物的精子；所述調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括確定第一注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率，所述第一注射位點(diǎn)為所述第一種哺乳動(dòng)物的所述精子在所述液流中的第一位置，以及確定第二注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率，所述第二注射位點(diǎn)為所述第二種哺乳動(dòng)物的所述精子在所述液流中的第二位置。
6.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括調(diào)節(jié)顆粒注射器將所述精子導(dǎo)入所述液流的位置。
7.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述調(diào)節(jié)顆粒注射器將所述精子導(dǎo)入所述液流的位置的步驟包括，在所述顆粒注射器和噴嘴體之間提供可調(diào)節(jié)的滑動(dòng)連接。
8.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述調(diào)節(jié)顆粒注射器將所述精子導(dǎo)入所述液流的位置的步驟包括，操控位于所述顆粒注射器和噴嘴體之間的一對(duì)匹配的螺旋絲。
9.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括，用第二顆粒注射器取代所述顆粒注射器以改變所述精子被注射入所述液流中的所述注射位點(diǎn)與所述液流所流經(jīng)的所述噴嘴開(kāi)口之間的距離。
10.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括，調(diào)節(jié)所述精子被注射入所述液流中的所述注射位點(diǎn)與所述液流所流經(jīng)的噴嘴開(kāi)口之間的距離。
11.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述液流具有液流特征；并且其中，調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括，根據(jù)所述液流特征調(diào)節(jié)所述精子的所述注射位點(diǎn)。
12.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中所述液流具有改變的液流特征；并且其中，調(diào)節(jié)所述精子在所述液流中的所述注射位點(diǎn)以提高所述至少兩個(gè)精子群的分辨率的步驟包括，根據(jù)所述改變的液流特征調(diào)節(jié)所述精子的所述注射位點(diǎn)。
13.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，該方法還包括將所述精子分離成第一精子群和第二精子群的步驟。
14.如權(quán)利要求1所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其中根據(jù)至少一種精子特征區(qū)分所述精子從而產(chǎn)生兩個(gè)精子群的步驟包括，根據(jù)性別特征區(qū)分所述精子，其中所述第一精子群含有X染色體，所述第二精子群含有Y染色體。
15.一種流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀包括a.液流；b.所述液流在其中流動(dòng)的噴嘴體；c.所述液流噴出所述噴嘴的噴嘴開(kāi)口；d.顆粒源；e.與所述顆粒源流控相連的顆粒注射器，該顆粒注射器在所述液流中的一個(gè)位置摻入至少一個(gè)顆粒；和f.選擇性的可變調(diào)節(jié)元件，該選擇性的可變調(diào)節(jié)元件用以改變所述噴嘴開(kāi)口和所述液流內(nèi)所述位置之間距離，所述顆粒注射器在所述位置摻入所述至少一個(gè)顆粒。
16.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述顆粒包括細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述顆粒包括精子。
18.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述精子從哺乳動(dòng)物的雄性個(gè)體獲得，所述哺乳動(dòng)物選自牛、馬、羊、犬、貓、豬、海洋動(dòng)物或鹿。
19.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件包括位于所述顆粒注射器和所述噴嘴之間的可調(diào)節(jié)的滑動(dòng)接合，所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件用以改變所述噴嘴開(kāi)口和所述液流內(nèi)所述位置之間距離，所述顆粒注射器在所述位置摻入所述至少一個(gè)顆粒。
20.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件包括接合于所述顆粒注射器和所述噴嘴之間的一對(duì)匹配的螺旋絲，所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件用以改變所述噴嘴開(kāi)口和所述液流內(nèi)所述位置之間距離，所述顆粒注射器在所述位置摻入所述至少一個(gè)顆粒。
21.如權(quán)利要求15所述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，其中所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件用以改變所述噴嘴開(kāi)口和所述液流內(nèi)所述位置之間距離，所述顆粒注射器在所述位置摻入所述至少一個(gè)顆粒，所述選擇性的可變調(diào)節(jié)元件包括用第二顆粒注射器取代所述顆粒注射器，所述第二顆粒注射器在所述液流的第二個(gè)位置摻入所述所述至少一個(gè)顆粒。
22.一種流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀包括a.液流；b.所述液流在其中流動(dòng)的噴嘴體；c.所述液流噴出所述噴嘴的噴嘴開(kāi)口；d.顆粒源；e.與所述顆粒源流控相連的顆粒注射器，該顆粒注射器在所述液流中的選擇性可變位置摻入至少一個(gè)顆粒。
23.一種流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀包括a.液流；b.所述液流在其中流動(dòng)的噴嘴體；c.所述液流噴出所述噴嘴的噴嘴開(kāi)口；d.顆粒源；e.與所述顆粒源流控相連的顆粒注射器，該顆粒注射器在所述液流中的一個(gè)位置摻入來(lái)自所述顆粒源的至少一個(gè)顆粒，其中調(diào)節(jié)所述顆粒注射器而使噴嘴開(kāi)口與所述液流內(nèi)所述位置之間的距離發(fā)生改變，所述顆粒注射器在該位置摻入所述至少一個(gè)顆粒。
24.一種流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀包括a.液流；b.所述液流在其中流動(dòng)的噴嘴體；c.所述液流噴出所述噴嘴的噴嘴開(kāi)口；d.顆粒源；e.將所述顆粒源與所述噴嘴流控相連的導(dǎo)管；f.與所述導(dǎo)管相連的顆粒注射器，該顆粒注射器在所述液流的一個(gè)位置摻入至少一個(gè)顆粒；g.選擇性的可變調(diào)節(jié)元件，該選擇性的可變調(diào)節(jié)元件用以改變所述噴嘴開(kāi)口和所述液流內(nèi)所述位置之間距離，所述顆粒注射器在該位置摻入所述至少一個(gè)顆粒。
25.一種流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀包括a.具有噴嘴開(kāi)口的噴嘴體；b.在所述噴嘴內(nèi)可調(diào)節(jié)位置的顆粒注射器，通過(guò)調(diào)節(jié)所述顆粒注射器的位置使所述顆粒注射器的注射位點(diǎn)與所述噴嘴開(kāi)口之間的距離發(fā)生改變。
26.一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，該方法包括下列步驟a.在噴嘴中產(chǎn)生液流；b.從噴嘴開(kāi)口噴出所述液流；c.確定所述液流中的顆粒注射位點(diǎn)與所述噴嘴開(kāi)口之間的距離；d.在所述注射位點(diǎn)將細(xì)胞摻入所述液流中；e.調(diào)節(jié)顆粒注射器在所述噴嘴內(nèi)的位置；f.根據(jù)細(xì)胞的至少一個(gè)特征分析所述細(xì)胞；g.調(diào)節(jié)顆粒注射器在所述噴嘴內(nèi)的位置。
全文摘要
一種高分辨率的顆粒區(qū)分處理和分離系統(tǒng)，該系統(tǒng)根據(jù)所選顆粒的特征提供增強(qiáng)的顆粒分辨率。具體地說(shuō)，本系統(tǒng)可包括分辨率增強(qiáng)的流式細(xì)胞儀。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可包括至少一個(gè)流體源導(dǎo)管(24)，其可將流體源流(24)以一定角度導(dǎo)入分辨率增強(qiáng)的噴嘴(25)中，所述角度可通過(guò)細(xì)胞傳感系統(tǒng)(13)使顆粒的分辨率增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1685226SQ03819362
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2003年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月15日
發(fā)明者肯尼思·M·埃文斯 申請(qǐng)人:Xy公司