專利名稱：：用于細(xì)胞信號(hào)途徑的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的全血制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣品制備領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及能夠用于采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法和圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測量的生物樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
：由于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法能夠區(qū)分異質(zhì)細(xì)胞群體中的亞群，所以其已成為臨床和基礎(chǔ)免疫學(xué)研究中不可缺少的工具。最近，在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法儀器和應(yīng)用方面獲得了重大進(jìn)展，使得能同時(shí)分析的參數(shù)的數(shù)目增加到十三個(gè)以上。隨著可使用參數(shù)的增多，研究者已開始基于表面表位染色來鑒別淋巴細(xì)胞樣品的更多非常明確的和生物學(xué)上感興趣的亞群。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法常規(guī)用于基于表面表型鑒別細(xì)胞群體以及也用于諸如細(xì)胞毒性、生存力和凋亡等的基于細(xì)胞的化驗(yàn)。得到普遍理解的是，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法提供了評(píng)估存在于諸如外周血等復(fù)雜群體中的細(xì)胞亞群的異質(zhì)性的能力。雖然表面染色可以是表征細(xì)胞的有效辦法，但它不能提供關(guān)于那些細(xì)胞對(duì)立即反映細(xì)胞內(nèi)事件的刺激的功能性響應(yīng)的信息。甚至在使用的標(biāo)記是細(xì)胞因子受體或者受體酪氨酸激酶的情況下，抗原的水平也不總是與對(duì)特定配體的細(xì)胞響應(yīng)相關(guān)。因此，已建立通過測量細(xì)胞內(nèi)表位細(xì)胞因子、DNA、mRNA、酶、激素受體、細(xì)胞周期蛋白的水平以及磷酸化信號(hào)分子的水平來表征細(xì)胞的方法。結(jié)果，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的研究應(yīng)用正逐漸地應(yīng)用于測量調(diào)節(jié)細(xì)胞過程和代表用于新型抗癌劑的重要治療靶的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。目前的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，例如蛋白翻譯后修飾的雙向SDS-PAGE和質(zhì)譜是非常強(qiáng)大的并已對(duì)許多細(xì)胞內(nèi)激活過程提供了有價(jià)值的見解。然而，由于細(xì)胞被溶解了，所以這些實(shí)驗(yàn)的讀出數(shù)據(jù)顯然是細(xì)胞群體間的蛋白激活狀態(tài)的平均值。通過這樣的平均化可掩蓋重要的生物事件，因?yàn)榧炔荒苁占后w里個(gè)別細(xì)胞中蛋白激活分布的信息，也不具有追溯性地分辨與活性蛋白的可檢測水平相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞群體的能力。因此，關(guān)于存在于所限定的細(xì)胞群體中和橫跨不同細(xì)胞子類型的免疫細(xì)胞群體變化的重要信息是不可檢測的，而且也不能為需要細(xì)胞溶解用于蛋白分析的方法所克服。最后，蛋白激活信號(hào)級(jí)聯(lián)必須在其生物背景既與人造物相關(guān)又不含有人造物時(shí)測量。最近開發(fā)的基于使用磷酸化態(tài)特異性抗體來分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的技術(shù)引起特別關(guān)注。多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析使得能夠使用細(xì)胞表面標(biāo)記辨別小型子群體——代表不同細(xì)胞亞群、分化態(tài)或激活態(tài)。同樣，表征信號(hào)事件的單細(xì)胞技術(shù)的使用提供了在單細(xì)胞水平上進(jìn)行多參數(shù)實(shí)驗(yàn)，以在所限定的淋巴細(xì)胞群體里鑒定特定分子的獨(dú)特信號(hào)結(jié)合點(diǎn)，以及通過關(guān)聯(lián)多種同時(shí)與信號(hào)級(jí)聯(lián)相關(guān)的活性激酶而獲得對(duì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)范圍的全面理解的能力。此外，將這些方法引入傳統(tǒng)臨床流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法方案中將對(duì)于包括選擇患者進(jìn)行高度特異性分子癌癥治療在內(nèi)的血液學(xué)惡性腫瘤分類以及對(duì)于監(jiān)測藥物對(duì)病人的效果具有廣泛應(yīng)用。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑顯示出在目前常規(guī)臨床應(yīng)用中不會(huì)遇到的技術(shù)問題。個(gè)別信號(hào)元件的磷酸化狀態(tài)在響應(yīng)特定激酶和磷酸酶時(shí)會(huì)快速發(fā)生改變，并因此在樣品保存和制備過程中發(fā)生人為改變。對(duì)激活或抑制輸入的細(xì)胞響往往比磷酸化態(tài)的穩(wěn)態(tài)測量具有更多信息。許多抗癌劑表現(xiàn)出對(duì)其分子靶的可逆結(jié)合。結(jié)果，藥效監(jiān)測只好測量全血樣品而不是分離的白細(xì)胞。最后，磷酸基(phospho)特異性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法在臨床環(huán)境中的已有的或潛在的應(yīng)用，包括表征免疫系統(tǒng)發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原特異性T-細(xì)胞應(yīng)答、藥物篩選以及疾病表型分析，必須考慮到磷酸化是指示信號(hào)蛋白活化態(tài)的暫時(shí)的可逆的事件。因此，需要開發(fā)能夠用于采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測量的生物樣品的制備方法，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測量是有力的并適用于普通臨床應(yīng)用且能俘獲代表信號(hào)蛋白激活態(tài)的磷酸化事件。本發(fā)明滿足了該要求并且還具有相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時(shí)激活態(tài)的能力檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本發(fā)明提供的方法使得可以快速固定含有紅細(xì)胞的生物樣品，以保證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表位和其他細(xì)胞內(nèi)蛋白表位保持在活化態(tài)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步使得可以溶解紅細(xì)胞，因此使其成為一種用于對(duì)生物樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液、以及其他含紅細(xì)胞樣品。本發(fā)明還提供了一種復(fù)原或“暴露”細(xì)胞內(nèi)抗原上由于固定樣品所需的交聯(lián)固定劑而導(dǎo)致隱蔽的表位。重要的是，本發(fā)明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基表位水平以確定疾病特異性特征。圖1提供用于計(jì)算WBC群體的費(fèi)歇爾距離(FisherDistance)的技術(shù)的圖例，所述技術(shù)采用光散射測量通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測量的全血樣品。圖2顯示在活化全血后不采用固定(上圖)或立即采用固定(下圖)的低滲溶解的影響。在改進(jìn)方法A(下圖)中樣品在RBC低滲溶解后立即固定。兩種方法均顯示出相似的磷酸基-ERK信噪比(S/N)。立即固定法一般提供更好的光散射群體分離度，但較低的CD3陽性T細(xì)胞百分比。圖3顯示不同去污劑對(duì)全血光散射測量的影響。所示使用TritonX-100處理的全血樣品數(shù)據(jù)代表了其他兩種去污劑。圖4顯示使用方法A(低滲溶解技術(shù))(上圖)制備的全血樣品結(jié)果與使用2％甲醛固定后用0.1％TritonX-100(下圖)制備的全血樣品結(jié)果的比較。此處所示的典型結(jié)果說明采用方法A，通過光散射得到的WBC群體分離度差，CD3染色強(qiáng)度較低但P-ERK信噪比較好。兩種方法的相似抗微管蛋白染色強(qiáng)度表明細(xì)胞內(nèi)區(qū)室對(duì)于兩種方法來說具有相似的易接近性。圖5顯示不同變性劑(行)和不同去污劑(TX-100，右圖；Brij-58，中圖；NP-40，左圖)對(duì)光散射測量、CD3表達(dá)和P-ERK染色強(qiáng)度的效果。圖6顯示不同甲醛固定劑濃度和溫育溫度對(duì)光散射測量、CD3表達(dá)和P-ERK染色強(qiáng)度的影響。圖7顯示不同TritonX-100濃度(圖從上至下，0.1％～1.0％)對(duì)光散射測量、CD3表達(dá)和P-ERK染色強(qiáng)度的影響。圖8顯示用于“暴露”的不同醇濃度(甲醇或乙醇)對(duì)光散射測量和對(duì)CD3表達(dá)的效果。在CD3染色前，成對(duì)樣品在每種醇濃度下溫育15分鐘，或在4℃保存過夜。圖9顯示不同細(xì)胞制備方法的效果比較，顯示全血溶解(頂行)、方法B(中行)、或方法B′(底行)對(duì)光散射測量、CD3表達(dá)和P-ERK水平的影響。圖10顯示不同WBC群體(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)的總偏差圖，所述總偏差圖由流式細(xì)胞計(jì)數(shù)光散射測量由三種不同技術(shù)(Q-PrepTM、方法B或方法B′)制備的全血樣品而確定。三種不同技術(shù)的值與使用LH-750TM分類細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)每個(gè)樣品得到的分類計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。圖11顯示根據(jù)不同WBC群體(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)的MFI(平均熒光強(qiáng)度)測量的總偏差估計(jì)值，所述不同WBC群體涉及三種不同技術(shù)(Q-PrepTM、方法B(“減化”)或方法B′(“完全”))制備的全血樣品。相對(duì)于針對(duì)所使用的6種不同CD標(biāo)記中的每一種進(jìn)行WBC群體計(jì)數(shù)的兩種方法間的平均值繪制近似容許限度圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時(shí)激活態(tài)的能力檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本發(fā)明提供的方法使得可以快速固定含有紅細(xì)胞的生物樣品，以保證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表位和其他細(xì)胞內(nèi)蛋白表位保持在活化態(tài)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步使得可以溶解紅細(xì)胞，因此使其成為一種用于對(duì)生物樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液、以及其他含紅細(xì)胞樣品。本發(fā)明還提供了一種復(fù)原或“暴露”細(xì)胞內(nèi)抗原上由于固定樣品所需的交聯(lián)固定劑而導(dǎo)致隱蔽的表位。重要的是，本發(fā)明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基-表位水平以確定疾病特異性特征。本發(fā)明提供的方法部分地基于如下發(fā)現(xiàn)，即采用全血樣品通過細(xì)胞計(jì)數(shù)分析研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可通過初始固定步驟完成，該固定步驟實(shí)現(xiàn)了保持細(xì)胞表位的激活態(tài)而不使得紅細(xì)胞對(duì)隨后的溶解不敏感。該發(fā)現(xiàn)克服了在傳統(tǒng)方法中遇到的問題，傳統(tǒng)方法在固定前通過密度梯度分離或溶解從樣品中移除紅細(xì)胞，由于處理時(shí)間延遲了固定，可導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)表位的去磷酸化。相反，通過提供快速固定含紅細(xì)胞生物樣品的方法使得可去除延遲固定的費(fèi)時(shí)的分離或溶解步驟，本發(fā)明的方法使得使用者可俘獲和測量處于其活化態(tài)的蛋白表位。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于全血固定、透化和紅細(xì)胞溶解的方法，該方法快速地固定細(xì)胞(作為初始步驟)，保持光散射測量，維持用于鑒別特定血液細(xì)胞群體的關(guān)鍵細(xì)胞表面表位，以及提供最佳的磷酸基-表位測量。本發(fā)明的方法目的在于制備用于細(xì)胞計(jì)數(shù)法測量細(xì)胞表位的生物樣品。細(xì)胞計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能根據(jù)細(xì)胞表面染色性質(zhì)區(qū)分細(xì)胞類型，所述細(xì)胞表面染色性質(zhì)例如T細(xì)胞的CD3、B細(xì)胞的CD19。在本發(fā)明的方法使得可以保持用于檢測的細(xì)胞內(nèi)表位的同時(shí)，通過本發(fā)明方法也能實(shí)現(xiàn)維持區(qū)分細(xì)胞類型所必需的表面表位識(shí)別的重要目的。因此，本文所述的方法使得使用者可以保持用于細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測的表面和細(xì)胞內(nèi)表位的物理完整性。本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即特定的靶表位(例如包括p-ERK、p-STAT1和p-STAT5在內(nèi)的磷酸基特異性表位)的檢測可通過醇步驟得以優(yōu)化。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞生物樣品的方法，該方法為隨后的檢測保留了細(xì)胞內(nèi)蛋白表位。所述方法包括固定步驟，該固定步驟包括使所述樣品與固定劑接觸，該固定劑用量所達(dá)到的終濃度足以交聯(lián)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子；去污劑步驟，該去污劑步驟包括向生物樣品中加入去污劑，該去污劑用量所達(dá)到的終濃度足以溶解紅細(xì)胞并透化白細(xì)胞；以及標(biāo)記步驟，其中所述樣品與對(duì)一個(gè)以上表位具有特異性的可檢測結(jié)合劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞生物樣品的方法，該方法為隨后的檢測保留了細(xì)胞內(nèi)蛋白表位。所述方法包括固定步驟，該固定步驟包括使樣品與固定劑接觸，所述固定劑用量所達(dá)到的終濃度足以交聯(lián)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子。固定劑濃度可為大約0.1％～大約20％，大約0.5％～大約15％，大約1％～大約10％，大約1％～大約8％，大約1％～大約4％，大約1％～大約2％。所述固定劑可以濃縮液形式或者稀釋形式加入以得到所需濃度。所述固定劑可以是使用者希望的任何適當(dāng)試劑，例如甲醛或低聚甲醛，或福爾馬林。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞生物樣品并為隨后的檢測保留了細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的本發(fā)明方法還包括去污劑步驟，其中去污劑加入用量所達(dá)到的終濃度足以溶解紅細(xì)胞并透化白細(xì)胞。所述去污劑濃度可由使用者根據(jù)不同條件選擇并在以下范圍內(nèi)大約0.1％～大約8％，大約0.1％～大約7％，大約0.1％～大約6％，大約0.1％～大約5％，大約0.1％～大約4％，大約0.1％～大約3％，大約0.1％～大約2％，大約0.1％～大約1％。去污劑可根據(jù)多種因素進(jìn)行選擇，并可以是離子型或非離子型去污劑。去污劑優(yōu)選為選自非離子型去污劑。目前一種優(yōu)選去污劑是乙氧化辛基苯酚，其商業(yè)名為TritonX-100(SigmaT9284)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法采用TritonX-100進(jìn)行。用于本發(fā)明方法的適當(dāng)去污劑可透化細(xì)胞并保持表面表位的完整性。在本發(fā)明中有用的離子型去污劑還包括辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(以IgepalCA-630(SigmaN-6507)或NonidetP-40(NP-40)(Sigma)市售)、Brij-58和直鏈醇烷氧化物(以PlurafacA-38(BASF公司)或PlurafacA-39(BASF公司)市售)。在復(fù)雜的細(xì)胞群體中，例如在未稀釋的外周血、骨髓抽吸物和腹膜液中，在同一過程中通過表面標(biāo)記區(qū)分細(xì)胞亞群并檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸基-表位染色是有用的。本發(fā)明提供的用于制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞生物樣品并為隨后的檢測保留了細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的方法適用于將細(xì)胞內(nèi)表位檢測和細(xì)胞表面表位檢測相聯(lián)合。在本發(fā)明提供的方法中，細(xì)胞內(nèi)表位和細(xì)胞外表位均可保持完整，使之能通過細(xì)胞計(jì)數(shù)分析進(jìn)行隨后測量。例如，典型T細(xì)胞標(biāo)記(包括例如CD4、CD3、CD62L和CD8)的表面檢測能與細(xì)胞內(nèi)表位檢測相聯(lián)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括進(jìn)一步的醇步驟，該醇步驟包括將生物樣品與醇接觸，該醇的用量所達(dá)到的終濃度足以暴露在固定步驟中因?yàn)榻宦?lián)而失去的細(xì)胞表位。如這里所述，醇步驟可保留大部分的細(xì)胞外表位并可由使用者根據(jù)需要保留的表位調(diào)節(jié)溫育長短、溫度和濃度。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解對(duì)于涉及多參數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的臨床應(yīng)用，期望能為檢測而暴露和保留與特定生物標(biāo)記有關(guān)的細(xì)胞外表位的亞群，所述特定生物標(biāo)記可包括例如CD3、CD35、HLADR、CD4、HLADP、HLDDQ、CD5、CD10、CD1Ia、CD29、CD32、CD36、CD38、CD40、CD45、CD49、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD71、CD83、CD85i(ILT2)、CD85j(ILT3)、CD85f(ILT-4)、CD86、CD87、CD99、CD103、CD116、CD126、CD135、CD206、CD208(DC-LAMP)、b2-微球蛋白、cBc12、CCR5、CXCR4、HLAABC、L25、MPO、CD3、CD79，以及表面CD2、CD4、CD8、CD1Ib、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、D23、CD24、CD25、CD28、CD33、CD34、CD35、CD41、CD42b、CD61、CD62L、CD64、CD65、CD66b、CD69、CD72、CD94、CD106、CD122、CD138、CD154、CD158a、CD161、NKbI以及可以根據(jù)使用者的目選擇的在本領(lǐng)域已知的其他表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)其他多種變量選擇最終醇濃度，所述變量包括例如，溫育時(shí)間、溫度和旨在暴露和測量的特定表位。最終醇濃度可以為大約25％～大約75％，大約30％～大約70％，大約35％～大約65％，大約40％～大約60％，大約45％～大約55％。所述醇還可選自由乙醇和甲醇構(gòu)成的組。如果需要，丙酮在醇步驟中可替代醇。樣品可與醇或丙酮在以下溫度接觸，所述溫度例如大約-30℃，大約-20℃，大約-10℃，大約-5℃，大約0℃，大約4℃，大約6℃，大約8℃，或者有利于暴露細(xì)胞內(nèi)表位而不降低細(xì)胞表面表位的反應(yīng)性的任何其他溫度。如果需要，通過本發(fā)明方法制備的生物樣品可以在醇步驟后保存在低于凝固點(diǎn)的溫度，例如保存在大約-40℃，在大約-30℃，在大約-20℃，在大約-10℃，在大約-5℃，并能保持光散射特征和細(xì)胞外表位的完整性，而不降低其易接近性或不改變細(xì)胞內(nèi)表位的激活態(tài)長達(dá)2個(gè)月的時(shí)間。應(yīng)當(dāng)理解，信號(hào)損失的百分比涉及多種因素，包括例如所剩水分的百分比和靶表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述樣品可以保存在大約-20℃達(dá)2天以上、3天以上、5天以上、10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、20天以上、30天以上、40天以上、50天以上、60天以上。磷酸基-表位在醇中的穩(wěn)定性根據(jù)本領(lǐng)域所理解的多種因素變化，所述因素例如所剩水分在樣品中的百分比和靶表位。因此，本發(fā)明方法提供了磷酸基-表位在醇中的穩(wěn)定性并使得生物樣品的長期保存期在分析前保持達(dá)幾天至2～3周或者更長時(shí)間。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，制備含紅細(xì)胞的生物樣品以用于包括例如病毒粒子、免疫球蛋白、雌激素受體、細(xì)胞因子以及特定細(xì)胞內(nèi)蛋白等表位的測量。應(yīng)當(dāng)理解靜態(tài)蛋白分子的染色可使得能在長期實(shí)驗(yàn)里觀察細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)。本發(fā)明的方法使得細(xì)胞外標(biāo)記與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件相關(guān)聯(lián)，或者信號(hào)事件之間相互關(guān)聯(lián)，使不同時(shí)監(jiān)測單個(gè)細(xì)胞里的事件就不可能觀察到的免疫細(xì)胞作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性得以理解。雖然本文就細(xì)胞內(nèi)磷酸基-表位進(jìn)行舉例證明，但是本發(fā)明的方法同樣可用于制備目的在于測量其他翻譯后修飾的生物樣品，所述翻譯后修飾包括例如泛素化、糖基化、甲基化、乙?；?、棕櫚酰化，或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。因此，本發(fā)明使得能檢測細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的非磷酸基表位，進(jìn)一步擴(kuò)展了所述方法的用途。使用者可根據(jù)所研究的特定細(xì)胞事件選擇經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合劑。本發(fā)明提供的方法能對(duì)具體時(shí)間段里的途徑和途徑特異性方式進(jìn)行檢測，這是以前不能獲得的。雖然多種細(xì)胞內(nèi)表位可被選擇用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析，但是應(yīng)當(dāng)理解使用者可優(yōu)化并修改本文提供的方法以適用于被研究的特定表位，其中考慮的因素包括例如定位、構(gòu)象/結(jié)構(gòu)、抗體易接近性以及表位的穩(wěn)定性。本文提供的方法一般可用于多色、多參數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。磷酸化是指示信號(hào)蛋白激活態(tài)的瞬時(shí)、可逆事件。因此，通過使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定蛋白質(zhì)的磷酸化態(tài)，可以確定響應(yīng)諸如細(xì)胞因子或生長因子等特定刺激所使用的何種信號(hào)級(jí)聯(lián)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)和被轉(zhuǎn)錄的下游目標(biāo)。此外，對(duì)比病態(tài)細(xì)胞和健康樣品可容易地鑒別出異常信號(hào)事件，該事件是對(duì)癌癥和免疫疾病進(jìn)行表型分類的有用特征。因此，在診斷環(huán)境中，本發(fā)明的方法可用于制備生物樣品以用于根據(jù)例如磷酸基-蛋白狀態(tài)等病理學(xué)人體樣品的診斷性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析。在另外的應(yīng)用中，本發(fā)明的方法可用于制備用于從分子庫篩選原代細(xì)胞群體的生物樣品以發(fā)現(xiàn)激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)的新型抑制劑和激活劑。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞的生物樣品并為隨后的檢測保留了細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的本發(fā)明方法還在涉及免疫系統(tǒng)表征的應(yīng)用中有用，所述免疫系統(tǒng)表征包括例如免疫細(xì)胞發(fā)育(通過監(jiān)測發(fā)育中T細(xì)胞、B細(xì)胞或其他譜系特定細(xì)胞的磷酸基-識(shí)別標(biāo)記以將細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)與細(xì)胞分化階段相關(guān)聯(lián))；免疫疾病狀態(tài)概況(包括將四倍體染色與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)評(píng)估相聯(lián)合以研究病毒和/或細(xì)菌感染中抗原特異性T細(xì)胞，并可潛在用于監(jiān)測淋巴細(xì)胞亞群在急性和慢性感染情況下的響應(yīng))；監(jiān)測患病鼠類模型或患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞群體，例如血液白血病或諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病以將磷酸基-識(shí)別標(biāo)記和疾病表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)；不能通過傳統(tǒng)生化技術(shù)分析的罕見細(xì)胞群體的生化識(shí)別標(biāo)志，所述細(xì)胞群體包括樹狀細(xì)胞、幼稚和記憶效應(yīng)細(xì)胞、干細(xì)胞；細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的多維評(píng)估以理解細(xì)胞功能；鑒別不同信號(hào)級(jí)聯(lián)間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)閾和聯(lián)系；監(jiān)測病毒感染細(xì)胞的被改變的功能和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；以及表征免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子和細(xì)胞外刺激的響應(yīng)模型。用于制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的本發(fā)明方法還在涉及藥效學(xué)監(jiān)測和藥物篩選的應(yīng)用中有用，所述藥物篩選包括例如為快速鑒別靶激酶的特異性抑制劑/調(diào)節(jié)劑進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)激酶篩選；在原代細(xì)胞中進(jìn)行藥物篩選以測定亞群特異性功效和副作用；通過同時(shí)分析多條細(xì)胞內(nèi)途徑證實(shí)化合物專一性的靶點(diǎn)；監(jiān)測特定化合物在藥物治療過程中對(duì)感興趣的細(xì)胞群體的效果而進(jìn)行臨床試驗(yàn)；通過將細(xì)胞內(nèi)生化差異與其它臨床參數(shù)相關(guān)聯(lián)而鑒別激酶上的磷酸基-表位(作為疾病進(jìn)程的診斷標(biāo)志)；以及在接種程序中進(jìn)行磷酸基-表位分析以監(jiān)測細(xì)胞水平的功效。如上所述，本發(fā)明的方法具有制備用于藥效學(xué)概況分析的生物樣品的用途。例如，磷酸基-特異性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法可用于通過疾病信號(hào)狀態(tài)和對(duì)特定化合物的響應(yīng)來對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)行概況分析。磷酸基-表位識(shí)別標(biāo)志與疾病進(jìn)程間的關(guān)系可用于根據(jù)處于疾病早期或晚期的患者個(gè)體調(diào)整療法的研究。例如，多種酪氨酸激酶受體，包括FIt-3、PDGF-R、EGF-R和HER2，已經(jīng)與白血病和乳腺癌的疾病嚴(yán)重性和預(yù)后相關(guān)聯(lián)，并且是藥物治療的靶點(diǎn)(Drevs等，CurrDrugTargets4113-21，2003；Fjallskog等，ClinCancerRes91469-73，2003)。在本領(lǐng)域中已知多種細(xì)胞內(nèi)分子是分裂活躍的癌癥的指示，例如p53和周期蛋白(如Tashiro等，CancerRes63424-31，2003，和Kmet等，Cancer97389-404，2003所述)。盡管cDNA微陣和蛋白質(zhì)矩陣提供關(guān)于分子豐度的信息，但是這些分析并沒有提供關(guān)于活化態(tài)的信息。以低濃度存在的蛋白如果具有組成型活性則能在疾病進(jìn)程中起重要作用，這是只能由磷酸基特異性分析才能表征的特征。因此，本發(fā)明提供的用于制備含紅細(xì)胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的方法賦予使用者將蛋白質(zhì)水平和其在特定疾病狀態(tài)中的活性相關(guān)聯(lián)的能力。如本文所述，本發(fā)明提供的方法具有在各種臨床環(huán)境中的用途，包括例如，腫瘤塊的檢測、活組織檢查和得自組織的樣品的分析(基于制備用于細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的含紅細(xì)胞的生物樣品的能力)。通過允許使用者對(duì)異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行概況分析，并隨后分析在臨床試驗(yàn)前和臨床試驗(yàn)過程中療法的功效和專一性，所述方法已擴(kuò)展了在癌癥和免疫系統(tǒng)疾病的研究和治療中的用途。隨著為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法發(fā)展并驗(yàn)證出更多的磷酸基-表位特異性抗體，可以篩選生物樣品以發(fā)現(xiàn)用于藥物開發(fā)以及對(duì)特定疾病致病原因的進(jìn)一步研究的可能線索。根據(jù)其對(duì)含紅細(xì)胞的生物樣品，包括未稀釋的外周血的適用性，本發(fā)明的方法使得能保持和分析直接取自患者的生物樣品中的磷酸基-表位水平以確定疾病特異性特征。本發(fā)明提供的方法還具有在臨床環(huán)境中的用途，包括例如，監(jiān)測患者個(gè)體例如在慢性骨髓性白血病(CML)中對(duì)分子導(dǎo)向療法的反應(yīng)性；監(jiān)測在全血或骨髓樣品中GleevecTM抑制STAT5的磷酸化的能力，這作為藥物體內(nèi)活性的標(biāo)志以預(yù)測藥效在臨床上明顯以前在CML患者中所常見的藥效喪失；在AML(急性骨髓性白血病)中通過監(jiān)測下游途徑，包括STAT、MAPK和PKB/AKT來監(jiān)測Flt-3的抑制劑；在多發(fā)性骨髓瘤(MM)中通過監(jiān)測MARK、PI3K、STAT和Wnt途徑監(jiān)測新開發(fā)出的分子導(dǎo)向抑制劑。本發(fā)明提供的方法還具有監(jiān)測多藥物組合治療對(duì)特定類型腫瘤的用途。例如，已知對(duì)大多數(shù)CML患者使用GleevecTM單治療最終將失敗，大多數(shù)機(jī)構(gòu)要求多形式治療。本文提供的方法可用于通過監(jiān)測諸如MAPK、STAT、凋亡等下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來監(jiān)測GleevecTM與諸如flavopiridol或阿糖胞苷等其他試劑組合后的體外效果，以協(xié)助選擇具有潛在體內(nèi)療效的組合。本文提供的方法可用于研究AML和MM患者個(gè)體中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在該實(shí)施方式中，可使用特定途徑刺激物和/或抑制劑，例如，F(xiàn)lt-3配體、PMA和Steele因子+/-UO-126(MAPK抑制劑)、用于AML的雷帕霉素(mTOR抑制劑)處理血液或骨髓樣品，并隨后測量基線和在多途徑中與細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合的磷酸化的(激活的)關(guān)鍵蛋白的可誘導(dǎo)和適居(inhabitable)的水平。如本文所述，在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明方法能用于制備用于進(jìn)行蛋白表位的測量的含紅細(xì)胞的生物樣品以致能保留用于檢測的細(xì)胞內(nèi)磷酸基-表位，包括例如ERK、p38、JNK，和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)、STAT1、STAT5、STAT6、AKT/PKB、mTOR、S6激酶、組蛋白(例如組蛋白H3)、ATM、NFKappaB、GSK3等。因此，本發(fā)明提供的方法使得能保留與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)磷酸基-表位。本發(fā)明提供的用以制備含紅細(xì)胞的生物樣品的方法部分通過快速細(xì)胞固定步驟有效地“凍住”蛋白的磷酸化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)了保留用以檢測的細(xì)胞內(nèi)磷酸基-表位。此外，可合為一步或者分別進(jìn)行的溶解和透化步驟使可檢測結(jié)合劑能接近其同源表位，該表位必須在已透化處理的靶細(xì)胞中以適當(dāng)?shù)奶烊换蜃冃缘臉?gòu)象保留。在本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)理解信號(hào)級(jí)聯(lián)通常由下游效應(yīng)器的蛋白磷酸化所驅(qū)動(dòng)，所述下游效應(yīng)器的蛋白磷酸化激活了效應(yīng)器使其執(zhí)行功能。因此，磷酸基-特異性的經(jīng)標(biāo)記結(jié)合劑，例如抗體可用于識(shí)別這些活性蛋白并分辨信號(hào)事件的“開-關(guān)”狀態(tài)。采用磷酸化作為激活下游效應(yīng)器的方式的級(jí)聯(lián)在本領(lǐng)域里是熟知的。多信號(hào)級(jí)聯(lián)可被同時(shí)測量，例如，通過使用不同熒光團(tuán)標(biāo)記以測定配體或抑制劑的特異性，并且所述多信號(hào)級(jí)聯(lián)可包括例如細(xì)胞分裂原激活蛋白(MAP)激酶級(jí)聯(lián)和詹納斯激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活物(Jak-Stat)途徑。MAP激酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-JunN-端激酶(JNK)和p38是雙重磷酸化的(在Thr和Tyr殘基上)，隨后移位進(jìn)入細(xì)胞核以磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子。STAT蛋白由生長因子和諸如IFN-g、IL-4和GM-CSF等細(xì)胞因子激活。在由Jaks磷酸化以后，STAT蛋白發(fā)生二聚化并進(jìn)入細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中，其直接與DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。因此，用于制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞的生物樣品并為隨后的檢測保留細(xì)胞內(nèi)蛋白表位的本發(fā)明方法在涉及測量在細(xì)胞刺激或應(yīng)激后快速發(fā)生的動(dòng)態(tài)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的應(yīng)用中有用。在細(xì)胞分裂原激活蛋白(MAP)激酶級(jí)聯(lián)中，信號(hào)開始于細(xì)胞表面并由MAP激酶激酶激酶(MEKK)傳遞給MAP激酶激酶(MEK)再傳遞給MAP激酶，最后傳遞給轉(zhuǎn)錄因子。該級(jí)聯(lián)的每一個(gè)成員都由其上游成員磷酸化。轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化通常增加DNA結(jié)合親合力或者改變其構(gòu)象而引起二聚化和DNA結(jié)合。在所述JAK-Stat級(jí)聯(lián)中，細(xì)胞因子受體的二聚導(dǎo)致JAKs的激活，其隨后使STAT在其二聚化區(qū)域磷酸化而導(dǎo)致二聚化的STAT進(jìn)入細(xì)胞核并激活轉(zhuǎn)錄。磷酸化也能為其他蛋白提供?？课稽c(diǎn)以結(jié)合和定位于特定細(xì)胞內(nèi)位置，所述磷酸化例如受體酪氨酸激酶的酪氨酸基序的磷酸化。雖然通常導(dǎo)致“正”活性，但是磷酸化事件也可引起負(fù)結(jié)果，例如T細(xì)胞蛋白Lck，其中磷酸化抑制酶活性，并且其是通過導(dǎo)致Lck發(fā)出信號(hào)的磷酸酶發(fā)生的去磷酸化事件。為了單獨(dú)地測定磷酸化事件，可增加與磷酸化形式蛋白的特異性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記結(jié)合配偶體。這通常通過使用結(jié)合到載體蛋白上的經(jīng)磷酸化的短肽免疫原完成。因此，可以在本發(fā)明提供的方法中采用對(duì)相同信號(hào)蛋白中不同磷酸基殘基具有特異性的可檢測結(jié)合劑，由此隨后的測量可以了解對(duì)于特定信號(hào)事件重要的殘基?？梢酝ㄟ^比較靜息細(xì)胞和被刺激的細(xì)胞，在分析前采用磷酸酶處理樣品，使磷酸化肽與非磷酸化肽競爭并將磷酸基-蛋白水平歸一化至總蛋白含量來確定磷酸基-特異性。本發(fā)明提供的方法包括標(biāo)記步驟，其中所述生物樣品與對(duì)一種或多種表位具有特異性的可檢測結(jié)合劑接觸。為隨后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定生物樣品中一種或多種表位的存在，結(jié)合劑可以是單克隆抗體，吸附和/或親和純化或采用其它方式富含對(duì)一種或多種靶表位具有特異性的抗體的多克隆抗血清，以及諸如酶法制備的單價(jià)(Fab)或二價(jià)(F(ab′2))抗原結(jié)合片段等抗體片段。此外，結(jié)合劑可以是抗體樣分子或模擬物。在標(biāo)記步驟(本領(lǐng)域中也通常稱為染色步驟)中，樣品與飽和量的經(jīng)標(biāo)記結(jié)合劑(優(yōu)選為熒光團(tuán)結(jié)合抗體)接觸，所述經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合劑將結(jié)合到表達(dá)表位的細(xì)胞上。通過適當(dāng)波長的激光激發(fā)，熒光團(tuán)發(fā)射出特征熒光信號(hào)，從而隨后鑒別出表達(dá)表位的細(xì)胞。優(yōu)選的熒光團(tuán)包括藻膽色素蛋白B-藻紅蛋白(B-PE)、R-藻紅蛋白(R-PE)和別藻藍(lán)蛋白(APC)，它們適用于或者要求高靈敏度或者要求同時(shí)多色檢測的應(yīng)用。如果需要，可以使用含有雙標(biāo)簽的串聯(lián)結(jié)合物(例如，藻紅蛋白標(biāo)記的結(jié)合試劑與綠色熒光檢測試劑聯(lián)合)以利用儀器激光的譜線同時(shí)激發(fā)來檢測兩種不同的信號(hào)。如果需要，也可設(shè)計(jì)和合成基于活性的標(biāo)記，其中包括例如作為磷酸酶特異性俘獲裝置的α-溴芐基磷酸酯以及將俘獲裝置與生物素標(biāo)簽相連的連接物，所述生物素標(biāo)簽用于可視化和純化，如Kumar等，Prod.Natl.Acad.ScL，USA1017943-48，(2004)中所述。磷酸基-特異性抗體也可與熒光團(tuán)結(jié)合以形成初級(jí)標(biāo)記的抗體，該抗體是適用于實(shí)施本發(fā)明提供的方法的可檢測結(jié)合劑。當(dāng)選擇用于結(jié)合的熒光團(tuán)標(biāo)記時(shí)，熒光團(tuán)標(biāo)記的吸收光譜必須與細(xì)胞計(jì)數(shù)器中使用的激光線相匹配，并且其發(fā)射必須落在檢測濾波器組件的范圍里。此外，所述標(biāo)記不能影響結(jié)合劑，例如，抗體結(jié)合特性或者穿過細(xì)胞結(jié)構(gòu)的透過性。可以理解諸如PE或APC等大蛋白熒光團(tuán)可以減緩抗體進(jìn)入細(xì)胞并影響其結(jié)合特性。小分子標(biāo)記，例如FITC、Alexa488和Alexa647等熒光團(tuán)可提供最好的染色特性，從而提供對(duì)熒光團(tuán)/蛋白比例的恰當(dāng)控制。熒光團(tuán)在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法中的使用和應(yīng)用的廣泛討論可在Petit等，Biol.Cell781-13，1993；Mullins，MethodsMoIBiol34107-16(1994)；以及Shapiro，MethodsCellBiol63107-29，2001中找到。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法裝置以及操作流程是本領(lǐng)域熟知的，并在大量文獻(xiàn)中得到詳細(xì)的描述。參見例如，F(xiàn)lowCytometryandSorting，第二版，(1990)M.R.Melamed等編輯，Wiley-Liss；FlowCytometryandcellSorting，第二版，(2000)A.Radbruch，Springer-Verlag；和InLivingColor.ProtocolsinFlowCytometryandCellSorting(2000)Diamond和Demaggio編輯，Springer-Verlag。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法同樣在美國專利5,968,738和5,804,387中得以描述；在此將所述公開內(nèi)容以參考的方式引入。本發(fā)明因此提供了一種制備用于蛋白表位測量的含紅細(xì)胞的生物樣品的方法，該方法使得可以保留用于通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測的細(xì)胞內(nèi)蛋白表位，所述細(xì)胞計(jì)數(shù)法例如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法或者激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)法。細(xì)胞計(jì)數(shù)法是非常強(qiáng)大的用于分析磷酸基-特異性表位和其他非磷酸基-表位的多參數(shù)方法，并且具有超過通過諸如蛋白質(zhì)印跡和ELISA等方法進(jìn)行分析的多項(xiàng)優(yōu)勢。為保持精確性和半定量結(jié)果，所述細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測可以通過與諸如蛋白質(zhì)印跡和ELISA等傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較來得以確認(rèn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法使得能夠不經(jīng)過任何預(yù)先細(xì)胞篩選或損耗而分析B細(xì)胞對(duì)比T細(xì)胞，病態(tài)/癌癥細(xì)胞對(duì)比健康細(xì)胞，在一個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞對(duì)比另一階段的細(xì)胞。通過能夠以保留用于檢測的細(xì)胞內(nèi)表位的方式制備生物樣品，本發(fā)明的方法使得能進(jìn)行細(xì)胞類型間的立即比較。應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)選擇的可檢測試劑可以同時(shí)分析幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)或者一個(gè)特定級(jí)聯(lián)中的多個(gè)成員。在意欲檢測多個(gè)表位的實(shí)施方式中，可以使用能進(jìn)行多色分析，例如2、4、6、8或者更多個(gè)不同顏色的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法。因此，所述方法能夠根據(jù)疾病的信號(hào)狀態(tài)或者通過它們對(duì)刺激的響應(yīng)對(duì)比正常健康細(xì)胞對(duì)刺激的響應(yīng)來對(duì)這些疾病進(jìn)行概況分類。在這方面，致瘤性病癥經(jīng)常被表征為過度表達(dá)或者具有組成型活性的信號(hào)分子。本發(fā)明的方法進(jìn)一步應(yīng)用于制備生物樣品用以使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行基于細(xì)胞的藥物篩選，其中可包括同時(shí)檢測多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)以確定藥物特異性。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測使得使用者可以分析在復(fù)雜群體里的罕見細(xì)胞亞群。由于能夠分析異質(zhì)群體中的罕見細(xì)胞亞群，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法可用于特別是存在許多細(xì)胞類型時(shí)的監(jiān)測環(huán)境中的信號(hào)事件，該信號(hào)事件最好地刺激體內(nèi)的信號(hào)事件。如本文所述，本發(fā)明的方法使得能制備含有紅細(xì)胞的生物樣品，其使信號(hào)事件固定在幾乎任何時(shí)間點(diǎn)以用于隨后的染色。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法可對(duì)諸如96孔板形式的大量樣品平行進(jìn)行操作以快速測量細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在多個(gè)實(shí)施方式中，可以使用許多細(xì)胞因子對(duì)諸如未稀釋外周血、骨髓抽吸物或腹膜液等生物樣品進(jìn)行刺激并在諸如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等幾種不同類型的細(xì)胞中測量諸如ERK、p38和JNK或者STAT轉(zhuǎn)錄因子等MAP激酶的磷酸化。因此，使用磷酸基-特異性流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，僅有淋巴細(xì)胞的一個(gè)特定亞群，例如B細(xì)胞或者T細(xì)胞能根據(jù)其對(duì)刺激的響應(yīng)而被靶向，所述對(duì)刺激的響應(yīng)不會(huì)由其他子群體所表現(xiàn)出來。分辨出細(xì)胞子群體并單獨(dú)檢測出樣品中存在的細(xì)胞類型的能力能夠使那些看上去非常小并且如果從整個(gè)群體背景下考慮則不能檢測到的變化變得清晰。本發(fā)明提供的方法可包括一步或多步溫育步驟，例如，在固定步驟和去污劑步驟之間以及在去污劑步驟和隨后的標(biāo)記步驟之間。可以設(shè)想在生物樣品與固定劑接觸以后，接著進(jìn)行大約在30秒鐘～大約1小時(shí)范圍的溫育步驟?？梢钥紤]在樣品與去污劑接觸后，在標(biāo)記步驟以前，進(jìn)行持續(xù)時(shí)間為大約30秒～大約1小時(shí)的第二溫育步驟。在目前優(yōu)選實(shí)施方式中，第二溫育步驟的時(shí)間約為10分鐘。本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括一步或多步離心步驟。如本文所舉例的那樣，在標(biāo)記步驟前可進(jìn)行其目的在于去除去污劑的第一離心步驟。此外，可在醇步驟后進(jìn)行另外的離心步驟以去除醇。應(yīng)當(dāng)理解可根據(jù)使用者需要在多個(gè)步驟中進(jìn)行洗滌步驟和在適當(dāng)?shù)木彌_液(例如磷酸緩沖鹽水(PBS))中的重懸浮。如本文所述，本發(fā)明提供了包括在去除(溶解)紅細(xì)胞和透化靶白細(xì)胞前加入固定劑的方法。結(jié)果，本發(fā)明提供的方法使得經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合劑，例如抗體、抗體片段或抗體樣分子可接近細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)區(qū)室。此外，本發(fā)明提供了所述方法的以下實(shí)施方式，其包括本文所述的醇步驟，該醇步驟提供了使由于固定步驟而掩蔽的蛋白表位“暴露”的方式，已顯示所述固定步驟對(duì)于檢測諸如ERK1、2等關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化是必須的。當(dāng)提供一個(gè)范圍內(nèi)的值時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解在該范圍的上限和下限間的每一個(gè)中間值，直到下限單位的十分之一(除非上下文明確指出)，以及其他在所述范圍內(nèi)指明的或者位于中間的值都包含在本發(fā)明中。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包含在所述較小范圍里，并也包括在本發(fā)明內(nèi)，在所指明范圍里可特別排除任何的極限值。當(dāng)所指明的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)極限值時(shí)，排除其中一個(gè)或兩個(gè)所包含的極限值的范圍也包括在本發(fā)明中。除非另外指明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
里的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。除非上下文另外明確指明，否則本文使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“和”以及“所述”包括其所指物的復(fù)數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解那些未實(shí)質(zhì)上影響本發(fā)明各種實(shí)施方式實(shí)行的修改也包括在本文提供的本發(fā)明限定范圍內(nèi)。因此，下述實(shí)施例用以描述而不是用以限制本發(fā)明。實(shí)施例1紅細(xì)胞的溶解、固定以及白細(xì)胞的透化本實(shí)施例描述和比較了通過低滲溶解，隨后的固定以及固定后的去污劑溶解來制備全血樣品。簡言之，將豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA，SigmaChemicalCorp.，St.Louis，MO)在100％無水乙醇中制備成40M工作溶液，并以400nM的終濃度用在全血中。在本實(shí)施例中使用的TritonX-100和其他去污劑以Surfact-PakTM去污劑樣品試劑盒的形式從PierceBiotechnology(Rockford，IL)購得。所述樣品試劑盒包含七種不同的非離子型去污劑(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、TritonX-114、NonidetP-40、Brij-35和Brij-58，均以10％水溶液形式提供)和三種粉末(非離子型辛基-B-葡萄糖苷，和辛基-B-硫吡喃葡萄糖苷，和兩性CHAPS)。粉末去污劑溶解在PBS(不含有Ca2+和Mg2+)中制得10％溶液。所有去污劑在即將使用前于PBS中溶解。對(duì)于對(duì)磷酸基-特異性表位進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)染色，使用冷洗滌緩沖液將已固定和透化的細(xì)胞(經(jīng)過或未經(jīng)過甲醇處理)洗滌一次并離心。向細(xì)胞沉淀中加入溶解在洗滌緩沖液中的抗體(單抗體或多抗體)以使最終體積為100μl并在40℃溫育15～30分鐘。采用磷酸基-ERK1/2的單克隆抗體(Thr202/Tyr204，克隆ElO)(CellSignalingTechnologies，Beverly，MA)，并根據(jù)制造商說明與AlexaFluorTM488(MolecularProbes，Eugene，OR)結(jié)合。結(jié)合的磷酸基-ERKl/2具有4.3～6.3的染料蛋白質(zhì)比，并在此前抗體滴定試驗(yàn)所確定的最佳抗體濃度(在100μl中，0.2μg結(jié)合的磷酸基-ERK1/2相對(duì)于每106個(gè)細(xì)胞)使用。從BeckmanCoulter，Inc.得到抗-微管蛋白(FITC結(jié)合物，克隆TBlA337.7)并以100μl中相對(duì)于每106個(gè)細(xì)胞為0.5μg的濃度使用。在抗體染色后，將樣品懸浮在2ml洗滌緩沖液中，并通過35微米尼龍網(wǎng)(SmallParts，在PA州某處)過濾，離心，然后在使用BeckmanCoulterEpicsEliteTM流式細(xì)胞儀分析前重懸浮于150μl～300μl洗滌緩沖液中。對(duì)于細(xì)胞表面加上細(xì)胞內(nèi)染色，將在按照制造商(BeckmanCoulter，Inc.，Miami，F(xiàn)L)說明進(jìn)行Q-PrepTM處理后或者在進(jìn)行經(jīng)過或未經(jīng)過50％冷甲醇處理的方法B后采用選定的單克隆抗體對(duì)全血樣品(100μl)進(jìn)行染色過程。單克隆抗CD抗體(在使用方法B或B′制備細(xì)胞樣品后加入)包括CD45(克隆J.33)、CD3(克隆UCHT-1)、CD19(克隆J4.119)、CD13(克隆SJZD1)、CD14(克隆RMD52)和CD33(克隆D3HL60.251)。所有抗CD抗體均從BeckmanCoulter，Inc.(Miami，F(xiàn)L)獲得并按照制造商推薦的抗體濃度用作PE結(jié)合物。在室溫溫育抗體30分鐘后，將試管離心(645×G，四分鐘)，重懸浮于1ml洗滌緩沖液，并立即使用FC-500TM，或者EpicsXLTM流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，Inc.，Miami，F(xiàn)L)進(jìn)行分析。對(duì)于測量磷酸基-特異性表位變化的試驗(yàn)，使用EpicsEliteTM流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，Inc.)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測量，該細(xì)胞儀配備有采用20mW488nm照明的空氣冷卻的氬激光。通過525±10nm帶通濾波器收集FITC或AlexaFluorTM488熒光，通過575±10nm帶通濾波器收集PE，并采用最小補(bǔ)償以消除在PE通道中的FITC或AlexaFluorTM488信號(hào)。獲得2000～10000的陽性事件(通常為CD3陽性)并保存在列表式文件中。使用EpicsEliteTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(MFI)和陽性事件百分比。在采用FALS和側(cè)散射測量比較淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的相對(duì)分離度的試驗(yàn)中，和在測量采用三種不同技術(shù)(Q-PrepTM、甲醛/Triton(不采用醇)[方法B]，或者采用醇的甲醛/Triton[方法B′])制備的全血樣品中選定的表面標(biāo)記的相對(duì)熒光強(qiáng)度的試驗(yàn)中，按照制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)配置使用FC-500TM，或者EpicsXLTM流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，Inc.)。采用488nm(唯一)提供照射，并且用于PE通道(575±10nm)的儀器設(shè)置保持在同一值，每次測量計(jì)數(shù)總共45,000個(gè)細(xì)胞。采用FALS鑒別器，設(shè)置其用以消除大部分血小板和小的碎片。在Q-PrepTM、方法B、或方法B加上50％甲醇處理(稱為方法B′)之后，光散射群體(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)的定量回收差異通過比較CBC分析結(jié)果與基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的光散射所測定的群體的結(jié)果而確定。使用CD45(FITC)相對(duì)于側(cè)散射的同時(shí)測量進(jìn)行基于光散射的群體的驗(yàn)證，正如Loken等，Cytometry11453-459，1990中所描述。如圖2所示，對(duì)比PMA刺激的和未刺激的全血，低滲溶解技術(shù)(方法A)通常給出20～25倍的磷酸基-ERK1/2信號(hào)增加。為將淋巴細(xì)胞作為測量的靶點(diǎn)，如Chow等，Cytometry4672-78，2001中所述，測量了CD3陽性外周血淋巴細(xì)胞上的磷酸基-特異性ERK水平。這樣做部分是由于低滲溶解技術(shù)后通過光散射所測量的白細(xì)胞群體的分離度低(圖2，左圖)。在磷酸基-ERK信號(hào)(PMA刺激的相對(duì)于未刺激的樣品的比率)中未能觀察到采用方法A(圖2，上圖)與采用在RBC溶解后立即進(jìn)行福爾馬林固定的改進(jìn)低滲溶解技術(shù)(圖2，下圖)相比較的顯著差異。這些結(jié)果表明對(duì)全血樣品進(jìn)行固定方面的延遲對(duì)磷酸基-ERK的測量水平?jīng)]有顯著影響。根據(jù)與低滲RBC溶解技術(shù)相關(guān)的技術(shù)難點(diǎn)，進(jìn)行在去污劑溶解后的固定。增加交聯(lián)固定劑濃度、溫育時(shí)間或者提高溫度是使得紅細(xì)胞更耐去污劑溶解的因素。為篩選不同的去污劑進(jìn)行了一系列試驗(yàn)以評(píng)價(jià)在交聯(lián)固定后它們?nèi)芙饧t細(xì)胞的能力。對(duì)于這些試驗(yàn)，在室溫(RT)使用35μl10％甲醛(終濃度2％)固定100μl全血10分鐘。隨后在室溫(不去除固定劑)，采用濃度為三種不同濃度之一(0.001％、0.01％、0.1％)的每種去污劑處理已固定的全血樣品，并進(jìn)行目視監(jiān)測以檢測長至2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)的紅細(xì)胞溶解。采用前向角光散射(FALS)對(duì)比側(cè)散射(SS)分析去污劑處理的樣品以確定白細(xì)胞群體的相對(duì)完整性和分離。如圖3所示，采用0.1％TritonX-100(左圖)對(duì)所固定的全血進(jìn)行處理顯示出淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的不同群體。相反，采用終濃度為0.001％的TritonX-100的處理未顯示出不同的WBC群體(右圖)。采用0.01％TritonX-100對(duì)所固定的樣品進(jìn)行處理通過光散射顯示出相似的WBC群體分離不足(結(jié)果未示出)。對(duì)于表現(xiàn)出顯著的紅細(xì)胞溶解的三種去污劑(TritonX-100、NP-40和Brij58)可以觀察到相似結(jié)果，所有這三種去污劑根據(jù)去污劑終濃度表現(xiàn)出相似的RBC溶解和WBC群體分離的模式(其中僅特定去污劑終濃度表現(xiàn)出清晰的WBC群體分離，而相同去污劑的其他濃度未表現(xiàn)出明顯的分離)。對(duì)于表現(xiàn)出RBC溶解的三種去污劑(TritonX-100、NP-40和Brij58)，(在所測試的三種濃度中)0.1％去污劑終濃度通過光散射顯現(xiàn)出WBC群體的分離。對(duì)于這三種去污劑，在0.01％時(shí)RBC溶解不可見，在0.001％去污劑處理的樣品中僅可見部分溶解。與在使用低滲溶解法(方法A)制備的全血樣品中的20倍或更高水平相比，使用甲醛固定(2％濃度在室溫下處理10分鐘)和0.1％去污劑處理，在PMA刺激的全血中的磷酸基-ERK水平僅僅比未刺激的對(duì)照高2.5～3.5倍(見圖4)。如圖4所示，使用兩種不同方法(方法A與甲醛/Triton(方法B))制備并與抗-微管蛋白-FITC同時(shí)溫育的細(xì)胞顯示出相同百分比的陽性細(xì)胞(基本上100％為CD3陽性細(xì)胞)，以及相似的抗-微管蛋白染色的MFI(圖4，右圖)，表明對(duì)使用任一方法制備的細(xì)胞中的胞內(nèi)抗原具有等同的接近性，并排除了甲醛/去污劑方法不能提供足以使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞透化作用的可能性。在磷酸基-ERK(而不是抗微管蛋白)染色中的主要差別表明磷酸基-ERK表位(而不是微管蛋白)在交聯(lián)固定(在低滲溶解(方法A)技術(shù)中通過醇處理提供的過程)需要暴露或變性。然而，如圖2和圖4所示，甲醛固定后的醇處理并不能保留光散射特性并使得可以分辨所有白細(xì)胞群體。甲醛/去污劑技術(shù)盡管保留了光散射但不能暴露磷酸基-ERK。結(jié)果，研究了使用高鹽、低pH和加熱作為變性條件是否可以潛在地暴露出磷酸基-ERK表達(dá)。使用高鹽、低pH或者溫度來暴露抗原在4％甲醛(室溫10分鐘)中固定全血樣品和在室溫使用0.1％去污劑(TritonX-100、NP-40或者Brij58)處理30分鐘后，通過在可見RBC溶解后直接將濃縮儲(chǔ)備溶液(5M儲(chǔ)備液)加入到去污劑溶液中制得在NaCl或尿素中的1M或2M樣品。對(duì)置于低pH的樣品，通過離心(在30分鐘溫育后)去除去污劑并將細(xì)胞重懸浮于pH調(diào)節(jié)為5的PBS中。將所有樣品在室溫置于高鹽或酸中30分鐘，離心并重懸浮于洗滌緩沖液中。對(duì)于置于升高的溫度作為變性因素的樣品，將已固定的全血樣品(在室溫條件下4％甲醛處理10分鐘)采用0.1％TritonX-100在室溫處理30分鐘，然后在70℃水浴中溫育10分鐘，離心并重懸浮于洗滌緩沖液中。對(duì)于所有條件，使用CD3-PE和磷酸基-ERK-Alexa488對(duì)樣品進(jìn)行染色，洗滌并使用EpicsEliteTM進(jìn)行分析。如圖5所示并總結(jié)在表1中的結(jié)果表明，通過低滲溶解技術(shù)制備的全血樣品(頂行，圖5)表現(xiàn)出對(duì)比刺激的樣品和未刺激的樣品，在CD3陽性淋巴細(xì)胞中磷酸基-ERK表達(dá)具有26～34倍的差異。對(duì)比僅用去污劑處理的樣品，使用1N或2NNaCl，或者1M或2M尿素處理的樣品表明很小而不顯著的磷酸基-ERK表達(dá)的增加，而置于pH5條件下表現(xiàn)出7倍的差異，進(jìn)行70℃處理表現(xiàn)出6倍的差異(PMA刺激的相對(duì)于未刺激的)。使用任何去污劑處理并置于NaCl、尿素或低pH的全血樣品的散射圖(FALS對(duì)比SS)表現(xiàn)出白細(xì)胞群體的分離度很差(圖5，每種去污劑處理的第一行)。所顯示的結(jié)果代表對(duì)三份不同全血樣品進(jìn)行的相同試驗(yàn)。表1不同變性條件對(duì)p-ERK在CD3陽性淋巴細(xì)胞中的表達(dá)的影響aa所示結(jié)果獲自三個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)b方法A低滲溶解加上固定c方法B4％甲醛/0.1％TX-100這些結(jié)果表明雖然所述變性條件提高了p-ERK在甲醛/去污劑處理的細(xì)胞中的表達(dá)，但表達(dá)水平遠(yuǎn)比在使用低滲RBC溶解、固定和醇處理(方法A)處理的全血樣品中見到的表達(dá)水平要低。實(shí)施例II固定劑和去污劑濃度對(duì)白細(xì)胞光散射的影響該實(shí)施例表明固定劑和去污劑二者的濃度和溫育時(shí)間對(duì)白細(xì)胞的分離度和回收的影響。根據(jù)先前研究所建議的高濃度交聯(lián)固定劑有助于維持白細(xì)胞群體的光散射圖和分離度，研究了不同固定劑濃度的影響。全血樣品在室溫或37℃在濃度逐漸升高的甲醛(從1％至10％終濃度)中溫育10分鐘，隨后立即與1ml0.1％TX-100(在室溫)溫育。如圖6所示，甲醛濃度從2％～4％(對(duì)于室溫溫育)的逐漸升高顯著改進(jìn)白細(xì)胞群體的分離度(左圖)。相似地，在37℃使用甲醛處理全血樣品導(dǎo)致使用光散射的WBC群體的分離改善，而對(duì)CD3表達(dá)沒有顯著影響(對(duì)于兩個(gè)處理溫度具有相似的MFF，圖6，中圖)。然而，較高甲醛濃度(超過4％)導(dǎo)致RBC的不完全溶解，并且不能分辨白細(xì)胞群體(數(shù)據(jù)未示出)。如圖6所示(右圖)，在37℃的處理也導(dǎo)致提高了磷酸基-ERK表達(dá)的S/N(從室溫的2.5提高到37℃處理的5.2)。為確定去污劑濃度對(duì)WBC回收、基于光散射的分離和p-ERK表達(dá)的影響，用4％甲醛(終濃度)在室溫或37℃固定全血等分試樣(100μl)10分鐘，然后將其與1mlTX-100溫育，所用去污劑濃度從0.1％至1.0％。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，通過離心去除去污劑并洗滌(使用洗滌緩沖液洗滌三次)，然后使用抗-CD3-PE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。如圖7所示，去污劑濃度提高到超過0.1％導(dǎo)致WBC群體的分離度變差，伴隨碎片量的增加以及顯著喪失使用光散射從淋巴細(xì)胞分辨出單核細(xì)胞的能力(見圖7左圖)。此外，通過使用逐漸升高的去污劑濃度，CD3相比側(cè)散射直方圖(圖7中圖)顯示出CD3陽性事件百分比提高并伴隨側(cè)散射圖顯著高于在淋巴細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的側(cè)散射圖。如圖7所示，室溫固定使得RBC在所有去污劑濃度下溶解，而在37℃固定的樣品顯示在所有去污劑濃度下細(xì)胞凝集且RBC溶解不完全。這些結(jié)果啟示伴隨去污劑濃度增加，或者CD3陽性淋巴細(xì)胞結(jié)合到單核細(xì)胞或粒細(xì)胞，或者溶解的CD3陽性淋巴細(xì)胞將膜片段結(jié)合到單核細(xì)胞和粒細(xì)胞(后者與圖7的中圖中所見的SS圖更一致)。結(jié)合有關(guān)固定劑滴定的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明使用4％甲醛和0.1％TX-100處理可獲得最優(yōu)的RBC溶解和WBC回收。然而，對(duì)使用上述討論的甲醛和TX-100的范圍所處理的細(xì)胞進(jìn)行的p-ERK染色的研究未提供比未刺激的對(duì)照樣品高于7.4倍的p-ERK信號(hào)(對(duì)于PMA刺激的全血樣品)(與最初描述的低滲溶解處理的28倍相比較)。隨后研究了使用4％甲醛時(shí)全血樣品與固定劑的溫育時(shí)間的作用(10分鐘～30分鐘)。此外，研究了或者在存在固定劑(如前所述)，或者在去除固定劑后，樣品(在添加固定劑后)與去污劑溫育的作用。樣品在固定劑中溫育時(shí)間超過10分鐘則顯示出不完全的RBC溶解和細(xì)胞凝集(結(jié)果未示出)。與使用固定劑溫育10分鐘，洗滌，然后再采用去污劑處理的樣品(10分鐘～30分鐘)相比，存在固定劑時(shí)使用去污劑處理的樣品顯示出更完全的RBC溶解和更好的白細(xì)胞群體分離度(結(jié)果未示出)。此處，雖然全血樣品表現(xiàn)出良好的RBC溶解和良好的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的分離度，但是對(duì)于磷酸基-ERK1/2的信噪比保持在5～8，表明仍存在對(duì)該細(xì)胞內(nèi)表位的明顯屏蔽。實(shí)施例III醇暴露劑對(duì)p-ERK的影響和對(duì)CD3表達(dá)的影響該實(shí)施例表明了醇對(duì)淋巴細(xì)胞回收和對(duì)暴露表面表位的影響。為了“暴露”在使用交聯(lián)固定劑固定后變得非反應(yīng)性的磷酸基-蛋白(和其他)表位，進(jìn)行了一系列試驗(yàn)以評(píng)估在去污劑處理后的醇處理的影響。在置于去污劑中30分鐘后，用冷(4℃)緩沖液(不含Ca2+或Mg2+的PBS)洗滌已固定的全血樣品并將其在4℃重懸浮于一系列不同濃度的甲醇或乙醇中。將每種樣品的一等分試樣在4℃保持過夜以研究在醇溶液中保存的影響。與以前相同，使用CD3-PE的抗體(以評(píng)估T-淋巴細(xì)胞的回收和染色)和磷酸基-ERK的抗體(以評(píng)估表位暴露)對(duì)樣品進(jìn)行染色(在通過離心和在PBS中洗滌而去除醇以后)。如圖8中提供的結(jié)果所示，甲醇處理(從40％至60％終濃度)保留了WBC光散射概圖而同時(shí)保持了良好的CD3染色。乙醇處理導(dǎo)致更高百分比的碎片(圖8，左下圖)以及單核細(xì)胞的損失。因?yàn)楹芏鄬?shí)驗(yàn)室通常將樣品保存在4℃的醇中不同時(shí)間段，所以作為研究的一部分，我們在分析前將兩份完全相同的樣品保存在醇溶液中過夜。結(jié)果如圖8所示(右圖)表明盡管在甲醇中保存過夜的溶液中碎片百分比有所增加，但是在甲醇處理的樣品中沒有光散射或者CD3表達(dá)的顯著劣化。相反，保存在乙醇中過夜的樣品(圖8，右下圖)表現(xiàn)出明顯的碎片、光散射的劣化和CD3染色的損失。實(shí)施例IV醇處理對(duì)白細(xì)胞群體的影響該實(shí)施例描述了醇處理對(duì)淋巴細(xì)胞群體的散射分離的影響以上實(shí)施例I～I(xiàn)II描述了兩種用于全血樣品固定、溶解RBC，透化細(xì)胞的方法用以進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的細(xì)胞內(nèi)抗原染色。在稱為固定/去污劑溶解技術(shù)的基本方法的一個(gè)實(shí)施方式中，可用4％甲醛在室溫固定全血樣品10分鐘，隨后在室溫不去除固定劑而加入1ml0.1％TritonX-100(方法B)。進(jìn)一步可使用冷(4℃)50％甲醇(在蒸餾水或者緩沖液中)進(jìn)行處理以暴露蛋白表位，且需要變性步驟(方法B′)。如圖9所示，通過方法B處理全血樣品導(dǎo)致WBC群體的良好的光散射分離，CD3在T-淋巴細(xì)胞上的高水平表達(dá)，但是與使用我們最初低滲溶解技術(shù)(方法A，圖9，那套上圖)處理的全血相比，p-ERK的表達(dá)水平較低(圖9第二套圖)。在去污劑處理后用50％甲醇處理的全血樣品(方法B′，圖9第三套圖)保留了WBC光散射特性，CD3表達(dá)和相對(duì)高水平的p-ERK(此處對(duì)于方法B′，S/N＝19.1；對(duì)于方法B，S/N＝8.1；以及對(duì)于方法A，S/N＝29)。為確定兩種技術(shù)(方法B和方法B′)對(duì)白細(xì)胞群體分離度的影響，進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，比較了用Q-PrepTM系統(tǒng)(BeckmanCoulter，Inc.)，或者固定/去污劑溶解技術(shù)(方法B)，或固定/去污劑溶解后50％冷甲醇(方法B′)處理的全血樣品。使用三種不同技術(shù)對(duì)來自正常捐獻(xiàn)者個(gè)體的樣品進(jìn)行處理，并通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測量(使用FALS對(duì)比SS)以確定淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的相對(duì)分離度，所述相對(duì)分離度通過如Riley在StatisticalanalysisandoptimalclassificationofbloodcellpopulationusingGaussiandistributions，博士論文FloridaInternationalUniversity；(2003)中所描述的測量光散射群體間費(fèi)歇爾距離來進(jìn)行。簡言之，為確定不同全血制備技術(shù)對(duì)主要白細(xì)胞群體(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)的回收和鑒別的相對(duì)效果，進(jìn)行試驗(yàn)來通過前向角光散射相對(duì)于90度角光散射參數(shù)(均為線性)比較這三種群體的分離，其中采用如Riley，同上，2003所述測量費(fèi)歇爾距離。如圖1所描述，該技術(shù)測量每一個(gè)基于光散射的群體團(tuán)沿著兩條主要軸(X和Y)的中心，并計(jì)算直角三角形的斜邊，其中C=A2+B2.]]>在其中SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過將每個(gè)群體沿X和Y的SD相加并除以2計(jì)算每個(gè)群體。雖然該計(jì)算沒有提供真實(shí)群體SD，但的確提供了能很容易計(jì)算的有效且有用的近似值。為計(jì)算費(fèi)歇爾距離，在單個(gè)FC-500TM流式細(xì)胞儀上分析由三種技術(shù)中的每一種制備的樣品，如前所述，計(jì)數(shù)總數(shù)為45,000個(gè)事件。對(duì)于通過使用Q-PrepTM或者不含醇的方法B制備的樣品，將相同的增益和高電壓設(shè)置用于FALS和側(cè)散射檢測器。對(duì)于使用醇處理(方法B′)制備的樣品，將更高的電壓用于兩個(gè)散射檢測器(兩個(gè)電壓均高3.3倍)以獲得三個(gè)群體的分離度。使用FALS和側(cè)散射獲得淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞細(xì)目以計(jì)算單獨(dú)樣品的百分比分布。單獨(dú)數(shù)值(百分比)乘以使用CBC(從LH-750TM獲得)從那個(gè)捐獻(xiàn)者獲得的WBC計(jì)數(shù)。為評(píng)估試驗(yàn)精確性(可重現(xiàn)性)，計(jì)算了每一套重復(fù)試驗(yàn)(用CD45、3、19、13、14和33染色的試管)的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。比較了樣品制備方法的費(fèi)歇爾距離、CBC參數(shù)，和表面標(biāo)記的MFF。方差分析和Tukey-Kramer檢驗(yàn)用于比較各方法的費(fèi)歇爾距離。對(duì)于單獨(dú)CD使用MFI和對(duì)于CBC參數(shù)使用差異繪圖在差異和總偏差方面比較各方法，如同在Bland和Altman，Lancet1307-31(1986)中所述。對(duì)于每個(gè)血液樣品的兩種方法間的差異在統(tǒng)計(jì)上可以被模型化為D＝TB+E其中D是差異，TB是總偏差，而E是隨機(jī)誤差。因?yàn)镋主要與不精確性有關(guān)，所以其標(biāo)準(zhǔn)偏差的值也是試驗(yàn)分析的不精確性的估計(jì)值。估算TB的詳細(xì)細(xì)節(jié)可在Magari，JournalofBiopharmaceuticalStatistics，2004(出版中)中找到。95％置信度和99％覆蓋度的容許限度根據(jù)估算的標(biāo)準(zhǔn)誤差計(jì)算。SAS(SASInstituteInc.，Carry，NC)用于所有統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)所有三種技術(shù)進(jìn)行比較的24個(gè)正常捐獻(xiàn)者的測量結(jié)果總結(jié)在表2中。對(duì)于使用Q-PrepTM制備的樣品，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞間的費(fèi)歇爾距離最大(費(fèi)歇爾距離＝2.19)，表明對(duì)于測試的三種技術(shù)來說，該技術(shù)能最好地將單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分離(和將單核細(xì)胞與粒細(xì)胞分離)。所述分析說明比較使用Q-PrepTM和方法B制備的樣品的費(fèi)歇爾距離，具有顯著差異。然而，比較方法B和方法B′的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞間的費(fèi)歇爾距離，沒有顯著差異。因?yàn)槭褂昧N不同的CD標(biāo)記對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行染色，所以我們也分析了樣品內(nèi)部以及技術(shù)間的樣品差異性。該分析說明與通過相同技術(shù)制備的樣品間的差異性相比，測定內(nèi)差異性更大。在對(duì)單核細(xì)胞和粒細(xì)胞間的費(fèi)歇爾距離進(jìn)行比較(表2)時(shí)，所有三種技術(shù)給出具有顯著性差異的結(jié)果，其中Q-PrepTM給出最好分離，隨后是方法B。雖然我們的總體分析指出方法B和B′提供的WBC群體的分離不如Q-PrepTM提供的分離好，但使用方法B或B′制備的全血樣品的散射測量(FALS和SS)提供的分離度足以清晰地分離WBC群體，并基本上提供了比我們的最初低滲溶解技術(shù)(參見圖9，上圖)明顯更好的分離度。圖2費(fèi)歇爾距離計(jì)算的數(shù)據(jù)分析總結(jié)淋巴細(xì)胞對(duì)比單核細(xì)胞單核細(xì)胞對(duì)比粒細(xì)胞使用LH-750TM(BeckmanCoulter，Inc.)分析儀測量通過所有三種技術(shù)制備的全血樣品的等分試樣以得到淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)，其目的在于確定任何血液細(xì)胞群體是否由于樣品制備而降低(損失)(使用低固定濃度，加上去污劑和醇處理的先前實(shí)驗(yàn)已指出單核細(xì)胞的顯著損失和優(yōu)先損失)。使用偏差圖(圖10)進(jìn)行分析以確定是否在回收不同WBC群體時(shí)有顯著差異。與CBC測定相比，所有三種全血制備技術(shù)的淋巴細(xì)胞群體(圖10，上圖)始終被過高估計(jì)，而當(dāng)比較三種全血技術(shù)時(shí)淋巴細(xì)胞的測定值沒有明顯差異。三種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞測定和CBC之間的差異可以解釋為在淋巴細(xì)胞門中包括低散射(碎片、血小板)等事件的結(jié)果。對(duì)單核細(xì)胞(圖10，中圖)和粒細(xì)胞(圖10，下圖)回收進(jìn)行的比較顯示對(duì)于任何用于單核細(xì)胞的全血技術(shù)來說，沒有顯著差異；與CBC相比，所有三種全血技術(shù)在回收粒細(xì)胞方面有小但不明顯的降低。實(shí)施例V全血固定技術(shù)對(duì)代表性CD標(biāo)記表達(dá)的影響該實(shí)施例表明各種固定、RBC溶解和透化技術(shù)(加入或不加入50％冷甲醇)對(duì)具有代表性的一套細(xì)胞表面標(biāo)記的影響。最后一組實(shí)驗(yàn)研究了固定、RBC溶解和透化技術(shù)(加入或不加入50％冷甲醇)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記的影響，所述細(xì)胞表面標(biāo)記對(duì)于淋巴細(xì)胞為CD3、CD19，對(duì)于單核細(xì)胞為CD13、CD14，對(duì)于粒細(xì)胞為CD13和CD33。如前所述，使用Q-PrepTM或者使用或不使用醇的固定/去污劑溶解法制備全血樣品。在洗滌后，將樣品與單抗體(所有均作為PE結(jié)合物)溫育，并通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析以測定陽性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度(MFI)。24個(gè)捐獻(xiàn)者個(gè)體的CD標(biāo)記測量的結(jié)果提供在表3和圖11中。如表3所示，盡管在三種不同全血制備技術(shù)的比較中，對(duì)于任何一種標(biāo)記的MFI都有些差異，但是唯一的染色強(qiáng)度顯著降低見于使用50％甲醇(方法B′)處理的全血樣品中的CD19。如用于CD19表達(dá)的偏差圖所示(圖11，第三圖)，在使用方法B或B′制備的樣品中該標(biāo)記的表達(dá)具有相當(dāng)?shù)牟町愋?，提示該表位在血液捐獻(xiàn)者個(gè)體中對(duì)甲醛/Triton(和甲醇)處理具有不同敏感度。不管所使用的全血制備技術(shù)如何，在所有捐獻(xiàn)者中可以很容易檢測到CD19陽性細(xì)胞。盡管在不同方法的比較中，其他標(biāo)記在染色強(qiáng)度(MFI)方面表現(xiàn)出一些升高或降低，但是對(duì)于這些六種代表性CD標(biāo)記，在所有情況下均有足夠的染色強(qiáng)度使得可容易地區(qū)分出陽性細(xì)胞群體和陰性細(xì)胞群體。表3使用不同全血制備技術(shù)在不同WBC群體上CD標(biāo)記表達(dá)的強(qiáng)度a由光散射測定的WBC群體(FALS對(duì)比SS)b與Q-PrepTM相比，CD表達(dá)水平的顯著降低貫穿本發(fā)明在插入語中參考了多篇文獻(xiàn)。將這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以參考方式整體引入本申請(qǐng)以更完整地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的情況。雖然通過參考所公開的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解，上述這些特定實(shí)施例和詳細(xì)研究僅用于示例性說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，可以做出各種修改而不背離本發(fā)明的精神。因此，本發(fā)明僅受如下權(quán)利要求的限制。權(quán)利要求1.一種用于測量蛋白表位的含有紅細(xì)胞的生物樣品的制備方法，該方法使得能保留用于檢測的細(xì)胞內(nèi)蛋白表位，該方法包括如下步驟(a)固定步驟，該固定步驟包括將所述樣品與固定劑接觸，其中所述固定劑的加入量使得所達(dá)到的終濃度足以交聯(lián)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸分子；(b)去污劑步驟，該去污劑步驟包括向所述樣品中加入去污劑，其中所述去污劑的加入量使得所達(dá)到的終濃度足以溶解所述紅細(xì)胞和透化白細(xì)胞；以及(c)標(biāo)記步驟，其中所述樣品與對(duì)一個(gè)或多個(gè)表位具有特異性的可檢測結(jié)合劑接觸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括醇步驟，該醇步驟包括將所述樣品與醇接觸，所述醇的量使得所達(dá)到的終濃度足以暴露所述細(xì)胞內(nèi)表位而不降低細(xì)胞表面表位的反應(yīng)性。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述醇濃度為大約25％～大約75％。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述醇濃度為大約40％～大約60％。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述醇選自由乙醇和甲醇組成的組。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述醇是甲醇。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)和(b)是在室溫進(jìn)行的。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)和(b)是在37℃進(jìn)行的。9.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述樣品可以保存在低于凝固點(diǎn)而不降低所述細(xì)胞內(nèi)表位的可接近性的溫度。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述溫度是大約-20℃。11.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括T-淋巴細(xì)胞的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)激活的初始步驟。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)表位包括磷酸化的表位。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測由細(xì)胞計(jì)數(shù)法完成。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞計(jì)數(shù)法是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法。16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞計(jì)數(shù)法是激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)法。17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細(xì)胞計(jì)數(shù)法是圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)法。18.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括第一溫育步驟，該第一溫育步驟包括在步驟(a)之后和步驟(b)之前對(duì)所述樣品進(jìn)行溫育。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一溫育步驟的持續(xù)時(shí)間為大約30秒～大約1小時(shí)。20.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括第二溫育步驟，該第二溫育步驟包括在步驟(b)之后和步驟(c)之前對(duì)所述樣品進(jìn)行溫育。21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二溫育步驟的持續(xù)時(shí)間為大約30秒～大約1小時(shí)。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述持續(xù)時(shí)間是大約10分鐘。23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固定劑濃度為大約0.1％～大約20％。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述固定劑濃度為大約2％～大約4％。25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述固定劑是甲醛。26.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑濃度為大約0.1％～大約8％。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述去污劑濃度為大約0.1％～大約1％。28.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去污劑是離子型去污劑。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述離子型去污劑選自由TritonX-100、NonidetP-40(NP-40)和Brij-58組成的組。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述去污劑是TritonX-100。31.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括第一離心步驟，該第一離心步驟包括在步驟(b)之后和步驟(c)之前對(duì)所述樣品進(jìn)行離心。32.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括再次離心步驟，該再次離心步驟包括在步驟(e)之后對(duì)所述樣品進(jìn)行離心。33.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品選自由血液、骨髓抽吸物和腹膜液組成的組。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述生物樣品包括未稀釋的外周血。全文摘要本發(fā)明涉及用于細(xì)胞信號(hào)途徑的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的全血制備，具體地說，本發(fā)明涉及用于測量蛋白表位的生物樣品的制備方法，該方法使得可以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白表位和基于俘獲表位的瞬時(shí)激活態(tài)的能力檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本發(fā)明提供的方法使得可以快速固定含有紅細(xì)胞的生物樣品，以保證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表位和其他細(xì)胞內(nèi)蛋白表位保持在活化態(tài)。本發(fā)明的方法進(jìn)一步使得可溶解紅細(xì)胞，因此使其成為一種用于對(duì)生物樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的有用方法，所述生物樣品包括例如全血、骨髓抽吸物、腹膜液以及其他含紅細(xì)胞樣品。本發(fā)明還提供了一種復(fù)原或“暴露”細(xì)胞內(nèi)抗原上由于固定樣品所需的交聯(lián)固定劑而導(dǎo)致隱蔽的表位。重要的是，本發(fā)明的方法使得可以保持和分析直接取自患者的生物樣品中磷酸基表位水平以確定疾病特異性特征。文檔編號(hào)G01N1/00GK101027557SQ200580028947公開日2007年8月29日申請(qǐng)日期2005年8月12日優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日發(fā)明者休·喬,戴維·赫德利,T·文森特·尚克伊,帕特里夏·格羅姆申請(qǐng)人:貝克曼庫爾特有限公司,健康網(wǎng)絡(luò)大學(xué)