本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)放射生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及放射生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室方法領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測細(xì)胞、組織和臨床放射敏感性的新型方法，該方法基于若干細(xì)胞參數(shù)和酶參數(shù)的測定和相關(guān)性。

背景技術(shù)：

約1％至15％通過放療治療癌癥的患者會(huì)表現(xiàn)出組織反應(yīng)(如皮炎或直腸炎)，這可能會(huì)對(duì)提供成功的治療有影響，以至可能導(dǎo)致醫(yī)生在既定方案完成之前就決定停止放療治療。另外，所述組織反應(yīng)是患者對(duì)電離輻射的超高敏感性的指標(biāo)。此外，即使是在可見的組織標(biāo)記物首次出現(xiàn)之前就中斷放療治療，放療治療也可能會(huì)增加治療后的發(fā)病率或者甚至增加患者的死亡率，不僅因?yàn)檫^早中斷治療使得不能完全根除想要治療的癌癥，而且輻射本身也會(huì)對(duì)健康組織造成繼發(fā)性損害。

眾所周知，組織對(duì)電離輻射的敏感性問題與DNA損傷修復(fù)機(jī)制是分不開的。事實(shí)上，在細(xì)胞水平上，電離輻射可以通過產(chǎn)生自由基(尤其是通過過氧化)和DNA損傷相關(guān)的其他活性物質(zhì)，使某些類型的化學(xué)鍵斷裂。由內(nèi)源性或外源性攻擊(如由電離輻射和自由基)所導(dǎo)致的DNA損傷，可以導(dǎo)致不同類型的DNA功能損傷，特別是，能量積累的損傷：堿基損傷、單鏈斷裂和雙鏈斷裂(DSB)。未修復(fù)的DSB與細(xì)胞死亡、毒性、以及更具體地說，放射敏感性相關(guān)。修復(fù)差的DSB與基因組不穩(wěn)定性、致突變現(xiàn)象和癌癥易感性有關(guān)。機(jī)體對(duì)每種類型的DNA損傷都有特定的修復(fù)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物有兩種主要的DSB修復(fù)方法：縫合修復(fù)(雙鏈連接)和重組修復(fù)(插入同源或非同源的單鏈)。

眾所周知，在不同器官之間以及不同個(gè)體之間，組織對(duì)電離輻射的敏感性高度可變；1981年，由Fertil和Malaise提出了“內(nèi)在放射敏感性”的概念。此外，針對(duì)放療的療效和副作用的各種研究已經(jīng)表明，有些個(gè)體具有很高的抗放射性，而其他個(gè)體，相比之下，則表現(xiàn)出放射敏感性，可導(dǎo)致臨床上公認(rèn)的副作用，但并不會(huì)造成隨后的致死作用。即使排除某些罕見的極端敏感的案例，遺傳起源似乎證明，放射敏感性一般源于遺傳易感性，因此認(rèn)為其因人而異。因此為了能夠確定特定患者在無風(fēng)險(xiǎn)的情況下可接受的最大累積劑量，期望存在一種預(yù)測試驗(yàn)方法。這一問題主要出現(xiàn)在高電離劑量的放療中。然而，該問題也有可能在任何其他與放療使用相同劑量的強(qiáng)電離劑量的暴露中出現(xiàn)。

眾所周知，一般稱為ATM和ATR的激酶家族中的兩種蛋白參與DSB的檢測、修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；它們的行動(dòng)至少需要存在一種已知能標(biāo)定BRCA1的蛋白，并需要存在多種ATM底物的有序磷酸化級(jí)聯(lián)(見由N.Foray等發(fā)表在EMBO雜志22卷(11)，p.2860-2871(2003)的文章“A subset of ATM-and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA 1protein”)。在細(xì)胞放射敏感性的解釋性模型中使用ATM酶進(jìn)行試驗(yàn)(參見Joubert等,“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response；At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity？”，發(fā)表于lnt.J.Radiat.Biol.,vol.84(2),p.107-125(2008))，并且該試驗(yàn)鑒定了三種類型的放射敏感性：抗放射性細(xì)胞(被稱為I類放射敏感性)、中度放射敏感細(xì)胞(被稱為II類放射敏感性)和極度放射敏感細(xì)胞(被稱為III類放射敏感性)。然而，在此基礎(chǔ)上并未提出預(yù)測模型。特別是沒有建立臨床數(shù)據(jù)(組織嚴(yán)重等級(jí)0到5)與放射生物學(xué)數(shù)據(jù)之間的定量關(guān)系。同樣，2008年1月25日N.Foray在“Rencontres Nucléaire&Santé”會(huì)議(XP55131242)上所做的報(bào)告“Les réparatoses:nouveaux concepts sur la prédiction de la radiosensibilité”中為了描述輻射誘導(dǎo)雙鏈斷裂的數(shù)量，討論了不同標(biāo)記物pH2AX和MRE11的作用以及它們隨時(shí)間的變化。該報(bào)告未提及用于定量和列出臨床水平觀察到的放射敏感性水平的組織嚴(yán)重等級(jí)。

許多文獻(xiàn)描述了ATM用于檢測和修復(fù)DNA損傷的條件。專利申請(qǐng)WO 2004/013634(KUDOS制藥有限公司)描述了ATM依賴型DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)組分的識(shí)別，該組分與包括MRE11/Rad51/NBS1復(fù)合體在內(nèi)的其他DNA損傷的響應(yīng)因子相互作用。專利申請(qǐng)US 2007/0072210(Ouchi和Aglipay)提出了一種篩選促進(jìn)對(duì)DNA損傷響應(yīng)的潛在治療試劑的方法，其中將一種已知為BAAT1的蛋白(其與乳腺癌易感基因BRCA1相關(guān))與ATM蛋白及候選化合物混合；如果相對(duì)于不含候選化合物的對(duì)照混合物來說，ATM磷酸化增加，則認(rèn)為后者是促進(jìn)DNA修復(fù)的潛在活性成分。專利申請(qǐng)EP 2 466 310 A1(慕尼黑亥姆霍茲中心)描述了在組蛋白H2AX的磷酸化形式(稱為γ-H2AX或g-H2AX)存在下的DNA雙鏈斷裂修復(fù)。專利申請(qǐng)WO 00/47760和專利US 7,279,290(圣裘德兒童研究醫(yī)院)描述了ATM的激酶功能基團(tuán)在DNA修復(fù)中的作用。

由此，這些文獻(xiàn)描述了修復(fù)途徑，但并未顯示出任何與建立臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)的相關(guān)性。

專利EP 1 616 011 B1(國際遺傳工程和生物技術(shù)中心)公開了一種診斷DNA修復(fù)中遺傳缺陷的方法，該方法基于以下三個(gè)步驟：培養(yǎng)從待測樣品中分離的細(xì)胞，用嵌合多肽孵育所述細(xì)胞，以及表征細(xì)胞響應(yīng)。所述細(xì)胞響應(yīng)是指以下生化標(biāo)記物的表達(dá)率，所述生化標(biāo)記物由p53、ATM、Chk1、Chk2、BRCA1、BRCA2、Nbs1、MRE11、Rad50、Rad51和組蛋白等類型的細(xì)胞內(nèi)蛋白構(gòu)成。然而，通過輻射誘導(dǎo)的表達(dá)無法預(yù)測所述蛋白的功能(某些癥狀中蛋白雖然已經(jīng)突變，但其表達(dá)率正常)：這些程序不是功能試驗(yàn)。

專利申請(qǐng)WO 01/90408、WO2004/059004和WO 2006/136686(法國核能源局)描述了觀察電離輻射后DNA損傷的方法。第一篇文獻(xiàn)公開了DNA損傷切口的活性，但不能定量DNA切除和再合成的酶活性，也不能定量DSB的修復(fù)。其他兩篇文獻(xiàn)描述了通過超螺旋環(huán)狀雙鏈DNA定量評(píng)估生物介質(zhì)修復(fù)DNA的能力(根據(jù)第三篇文獻(xiàn)：在多孔聚丙烯酰胺水凝膠膜中固化)。這些方法并未直接關(guān)注生理環(huán)境中的原位DSB，并且也沒有驗(yàn)證其臨床應(yīng)用的相關(guān)性。

KR20030033519提出了由催化劑或超氧化物歧化酶的活性推導(dǎo)放射敏感性的方法，KR20030033518中使用了谷胱甘肽過氧化物酶和葡萄糖6-磷酸脫氫酶。這些方法沒有檢測與DNA損傷或修復(fù)直接相關(guān)的標(biāo)記物。

專利申請(qǐng)US 2011/312514(Dana Farber癌癥研究所)提出用FANCD2灶(foci)作為檢測標(biāo)記物。專利申請(qǐng)US 2007/0264648(美國國家放射科學(xué)研究所)提出了DNA寡聚物在預(yù)測放療過程中是否出現(xiàn)副作用的用途。然而，即使在FANCD2灶的含量正常的情況下，也可以觀察到一些放射敏感性。

專利申請(qǐng)US 2008/234946和US 2012/041908(南佛羅里達(dá)大學(xué)等)描述了預(yù)測癌細(xì)胞而不是健康細(xì)胞的放射敏感性的方法；此外，該方法基于基因組數(shù)據(jù)，而不是功能試驗(yàn)。

專利申請(qǐng)WO 2014/154854(蒙彼利埃中心醫(yī)院)描述了利用至少一種放射敏感性生物標(biāo)記物來預(yù)測受試者的放射敏感性的方法。該方法不能檢測與DNA損傷或修復(fù)直接相關(guān)的標(biāo)記物；此外，該方法基于蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。再者，該專利申請(qǐng)未描述放射生物學(xué)數(shù)據(jù)與組織反應(yīng)的嚴(yán)重程度之間的定量關(guān)系。

專利申請(qǐng)WO 2013/187973(加州大學(xué))描述了用于測定細(xì)胞和(或)受試者相對(duì)于對(duì)照群體的放射敏感性的系統(tǒng)和方法。具體來說，所述方法包括輻照生物樣品，通過使用選自包括抗-pH2AX、抗-MRE11和抗-ATM的一系列標(biāo)記物中的一種或多種，對(duì)來自血樣中的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或原代細(xì)胞內(nèi)輻射誘導(dǎo)灶進(jìn)行檢測定量。在輻照后低于兩個(gè)小時(shí)的不同觀察時(shí)間對(duì)輻射誘導(dǎo)灶進(jìn)行定量能夠確定其修復(fù)動(dòng)力學(xué)，從經(jīng)驗(yàn)上來說這與受試者的放射敏感性相關(guān)。然而，由于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核很小，所以對(duì)淋巴細(xì)胞灶進(jìn)行分析非常困難。再者，所述方法也因此不允許醫(yī)師做出治療患者的決定。

專利US 8,269,163(紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院)描述了大量可以用作為標(biāo)記物的蛋白質(zhì)，這些標(biāo)記物用于對(duì)于意外暴露于電離輻射的人的嚴(yán)重程度進(jìn)行簡便、快速的鑒別，從而可以對(duì)患者進(jìn)行區(qū)分，以便安排他們進(jìn)行適當(dāng)?shù)木o急治療。所述專利涉及生物劑量學(xué)(意外劑量測定)，使用已知?jiǎng)┝窟M(jìn)行放射敏感性的檢測。

專利申請(qǐng)WO 2010/88650(得克薩斯大學(xué))描述了用于對(duì)特定放療治療敏感或抵抗的癌細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別的方法和組合物；因此并不適用于所有的放療治療。

專利申請(qǐng)WO 2010/136942(飛利浦)描述了利用生物標(biāo)記物在放療過程中對(duì)患者的放療治療進(jìn)行監(jiān)測的總體方法。該方法包括從成像過程分離的圖像中獲得至少一種描述符，其中所述描述符屬于準(zhǔn)備進(jìn)行放療的目的組織，或者屬于所述目標(biāo)區(qū)域附近的組織。該方法進(jìn)一步包括選擇至少一種疾病特異性的生物標(biāo)記物，該標(biāo)記物適用于對(duì)目的區(qū)域組織放療的副作用進(jìn)行檢測或定量。該方法進(jìn)一步包括獲得針對(duì)所選疾病的特異性生物標(biāo)記物的至少一個(gè)體外測量值。該方法進(jìn)一步包括利用相關(guān)技術(shù)，處理所述生物標(biāo)記物的至少一個(gè)體外測量值的至少一種描述符，得到能夠指示目的組織區(qū)域中放射毒性的輸出信號(hào)。然而，所述專利的學(xué)說只考慮到組織的依賴性毒性，而沒考慮到個(gè)體差異性，并且主要基于圖像分析。

專利申請(qǐng)WO 2010/109357描述了一種安排適應(yīng)性放療方案的方法和裝置，該適應(yīng)性放療方案是基于對(duì)正常組織并發(fā)癥的概率以及根據(jù)每個(gè)患者的特異性標(biāo)記物腫瘤對(duì)照的概率進(jìn)行優(yōu)化而得到的。與正常組織相關(guān)標(biāo)記物的值包括體外試驗(yàn)值、蛋白質(zhì)譜特征和患者的病史數(shù)據(jù)。體外試驗(yàn)值可能源于細(xì)胞、蛋白質(zhì)組和基因，例如，但不限于，多種細(xì)胞計(jì)數(shù)、HB、CRP、PSA、TNF-α、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、LDH、IL-6、鐵調(diào)素、肌酸酐、葡萄糖、HbAlc以及調(diào)聚物長度。從患者病史中得到的標(biāo)記物包括前期腹部手術(shù)、荷爾蒙藥物或抗凝血?jiǎng)?、糖尿病、年齡及腫瘤生長相關(guān)的測量結(jié)果。也設(shè)想到了與放射毒性無關(guān)的生物標(biāo)記物，如與多種形式的切除治療或化療試劑相關(guān)的生物標(biāo)記物。然而，也未考慮個(gè)體放射敏感性。

盡管存在眾多現(xiàn)有技術(shù)，但是申請(qǐng)人要指出的是，上述模式都未描述能夠評(píng)估放療后組織反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體放射敏感性的定量方法，該方法可用于任何患者以及任何類型的導(dǎo)致DSB的電離輻射，并且該方法是預(yù)測方法。因此提供預(yù)測個(gè)體放射敏感性方法的問題仍然沒有可操作的方案。本發(fā)明的目的在于提出一種預(yù)測組織和臨床放射敏感性的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA雙鏈斷裂(DSB)所代表的輻射導(dǎo)致的損傷類型未被修復(fù)時(shí)，其放射敏感性是最可預(yù)測的，并且當(dāng)其修復(fù)較差時(shí)，具有基因組不穩(wěn)定性，根據(jù)本發(fā)明的方法也源自所述發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DSB大多數(shù)可由稱為縫合的主要修復(fù)模式修復(fù)，和/或由稱為MRE11-依賴性重組的次要錯(cuò)配修復(fù)模式修復(fù)。由ATM蛋白調(diào)控這兩種修復(fù)模式之間的平衡。標(biāo)記物pH2AX表明由縫合修復(fù)模式識(shí)別的DSB。標(biāo)記物MRE11表明已經(jīng)通過MRE11-依賴性錯(cuò)配修復(fù)模式修復(fù)的DSB位點(diǎn)。標(biāo)記物pATM提供了通過使H2AX磷酸化并抑制MRE11-依賴性通路來激活縫合通路的信息。

發(fā)明人還觀察到，在氧化型應(yīng)激后，特別是在導(dǎo)致DSB的電離輻射相關(guān)的應(yīng)激之后，細(xì)胞質(zhì)形式的ATM蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。

為了觀察外源性攻擊對(duì)DNA的損傷，DNA的自然狀態(tài)以及DNA的輻射誘導(dǎo)狀態(tài)都必須要考慮。此外，輻照后，必須要考慮DNA修復(fù)，其動(dòng)力學(xué)取決于損傷修復(fù)機(jī)制，并由此取決于輻射誘導(dǎo)損傷的類型。此外，眾所周知，DNA修復(fù)的有效性和速度具有個(gè)體差異性，并且特定的遺傳條件也會(huì)導(dǎo)致特殊的放射敏感性。

根據(jù)本發(fā)明，通過基于以下方面的方法上述問題得以解決：1)擴(kuò)增非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，特別是來自皮膚活檢的細(xì)胞；2)對(duì)靜止期人類細(xì)胞有效的機(jī)理模型；3)對(duì)任何治療程序都有效的DSB識(shí)別、修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能試驗(yàn)。

本發(fā)明的第一個(gè)主題是表征取自患者的細(xì)胞樣品對(duì)電離輻射的細(xì)胞放射敏感性的方法，該方法開始于從所述患者的未經(jīng)輻照或只經(jīng)輕微輻照的區(qū)域內(nèi)獲取細(xì)胞，在該方法中：

(i)擴(kuò)增所述取樣的細(xì)胞，所述擴(kuò)增的細(xì)胞構(gòu)成“細(xì)胞樣品”；

(ii)在所述細(xì)胞樣品上，在觀測時(shí)間t，通過標(biāo)記物pH2AX、pATM和MRE11中的至少兩個(gè)確定得到的核灶平均數(shù)(所述平均數(shù)分別稱為N_pH2AX(t)、N_pATM(t)、N_MRE11(t))，所述觀測時(shí)間t為時(shí)間t＝0分鐘(簡稱t0，未經(jīng)輻照狀態(tài))以及用吸收劑量D輻照后，選自t＝t1、t2、t3和t4中的至少一個(gè)觀測時(shí)間；

(iii)確定選自由以下各項(xiàng)構(gòu)成的組中的至少一個(gè)參數(shù)：

-根據(jù)CTCAE分類的放療后組織反應(yīng)的嚴(yán)重等級(jí)，通過至少使用平均數(shù)N_pH2AX(t)和N_pH2AX(tx)，其中tx為t4(優(yōu)選的)或者為t3；

-樣品放射敏感性分類，通過至少使用平均數(shù)N_pH2AX(t)、N_pATM(t)和N_MRE11(t)；

并且在方法中

——t4是固定值，表示DNA斷裂率達(dá)到其殘基值(residual value)時(shí)的時(shí)間，并且t4有利地在t3的6倍至t3的8倍之間選擇，但在這種情況下必須至少為12小時(shí)，并優(yōu)選在12小時(shí)至48小時(shí)之間，并且更優(yōu)選為大約24小時(shí)；

——t3是固定值，表示在取自抗放射性患者的對(duì)照組細(xì)胞中，大約25％DSB修復(fù)結(jié)束的時(shí)間，并且t3有利地在t2的3倍至t2的5倍之間選擇，但在這種情況下必須至少為2.5小時(shí)且至多為6小時(shí)，并優(yōu)選在3小時(shí)至5小時(shí)之間，并且更優(yōu)選為大約4小時(shí)；

——t2是固定值，表示在取自抗放射性患者的對(duì)照組細(xì)胞中，大約50％DSB修復(fù)結(jié)束的時(shí)間，并且t2有利地在t1的5倍至t1的7倍之間選擇，但在這種情況下必須至少為35分鐘且至多為90分鐘，并優(yōu)選在45分鐘至75分鐘之間，并且更優(yōu)選為大約60分鐘；

——t1是固定值，表示在取自抗放射性患者的對(duì)照組細(xì)胞中，識(shí)別的DSB數(shù)量達(dá)到最大值后的時(shí)間，并且t1有利地在輻照結(jié)束后的5分鐘至15分鐘之間選擇，并優(yōu)選在7.5分鐘至12.5分鐘之間，并且更優(yōu)選為10分鐘左右。

在一個(gè)實(shí)施方案中，t1在8分鐘至12分鐘之間選取，t2在50分鐘至70分鐘之間選取、t3在3.5小時(shí)至4.5小時(shí)之間選取，并且t4在22小時(shí)至26小時(shí)之間選取。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞樣品上，測定100個(gè)細(xì)胞在時(shí)間t觀察到的微核的平均數(shù)[用％表示](該數(shù)被稱為N_MN(t))，時(shí)間t至少為t0(未經(jīng)輻照)和用吸收劑量D輻照后的t4。

所述電離輻射是治療性質(zhì)的。具體來說，吸收劑量D在0.5Gy至4Gy之間，優(yōu)選在1Gy至3Gy之間，更優(yōu)選在1.7Gy至2.3Gy之間，更進(jìn)一步優(yōu)選為2Gy。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，t1是10分鐘、t2是60分鐘、t3是4小時(shí)、t4是24小時(shí),并且D是2Gy。

對(duì)于本發(fā)明，表征患者對(duì)電離輻射的細(xì)胞反應(yīng)的一個(gè)參數(shù)是根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)，其表示無量綱的參數(shù)，并定義為

CTCAE＝5-Max[N_pATM(t1)；N_pATM(t2)]/10。

使用根據(jù)本發(fā)明的這一公式，能夠確定根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)，得到十進(jìn)制數(shù)字。根據(jù)本發(fā)明得到的CTCAE最終值是通過算術(shù)舍入計(jì)算得到的約數(shù)對(duì)應(yīng)的整數(shù)值。根據(jù)本發(fā)明確定的并在本申請(qǐng)書中所表示的CTCAE對(duì)應(yīng)于所述數(shù)字和所述整數(shù)。

在實(shí)際使用中，該公式特別適用于確定屬于II類放射敏感性類別的患者(中等放射敏感性)的嚴(yán)重等級(jí)。對(duì)于屬于III類放射敏感性類別(放射敏感患者)的患者禁止進(jìn)行放療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，按以下方式確定放射敏感性類別：

(a)如果N_pH2AX(t4)＜2并且N_pATM(t1)＞N_pATM(t2)，并且N_pATM(t1)＞30并且A＜10并且B＜5并且C＜2，條件是：

C＝N_pH2AX(t0)+N_MN(t0)；

B＝t0時(shí)大細(xì)胞核(大于150μm²)的百分比％；

A＝N_MRE11(t0)+t0時(shí)小pH2AX灶數(shù)/細(xì)胞；

則認(rèn)為樣品是抗放射性的；

(b)如果(N_pH2AX(t4)＞8或N_MN(t4)＞24)，則認(rèn)為樣品是高放射敏感性的；

(c)在所有其他情況下，認(rèn)為樣品是中度放射敏感性的。

對(duì)于一些患者，由于過度重組現(xiàn)象，DNA修復(fù)可能會(huì)被連續(xù)自發(fā)產(chǎn)生的DNA單鏈斷裂(SSB)所干擾，通常在易患癌癥的患者中觀察到該過度重組現(xiàn)象。SSB的自發(fā)過度產(chǎn)生可能會(huì)有兩種非矛盾性的效果：在自發(fā)狀態(tài)下并通過pH2AX標(biāo)記，可能出現(xiàn)通常觀察到的小于pH2AX灶的核灶；其反映出存在大量的DSB(“小灶”現(xiàn)象)。相似地，SSB的過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)解凝，增加細(xì)胞核的尺寸(尺寸通常大于150μm²，對(duì)應(yīng)于“大核”現(xiàn)象)。這兩個(gè)現(xiàn)象主要反映的是基因組不穩(wěn)定性。

優(yōu)選的N_pH2AX、N_pATM和/或N_MRE11的確定方法涉及免疫熒光試驗(yàn)。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，選擇取自抗放射性患者的所述對(duì)照細(xì)胞作為用以顯示在利用2Gy吸收劑量輻照后，體外克隆存活率大于55％的細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇所述取自抗放射性患者的對(duì)照細(xì)胞作為取自放療治療中或治療后未顯示有顯著組織反應(yīng)的患者的細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的方法使用至少一種健康組織樣品，優(yōu)選由成纖維細(xì)胞組成。成纖維細(xì)胞優(yōu)選從患者的結(jié)膜組織取樣。該取樣可通過活檢進(jìn)行。因此，在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述取樣的細(xì)胞為由患者皮膚活檢得到的成纖維細(xì)胞(根據(jù)通常稱為“皮膚穿刺活檢”的方法取樣)。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織樣品。

在細(xì)胞取樣(即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在成纖維細(xì)胞系中進(jìn)行活檢)之后進(jìn)行的根據(jù)本發(fā)明方法的第一步驟包括表征DNA的自然狀態(tài)(t0時(shí)的狀態(tài))，換言之未經(jīng)輻照的狀態(tài)。該步驟尤其可以包括調(diào)查細(xì)胞核的尺寸，是否存在微核、潛在自發(fā)性凋亡小體以及具有多種損傷的細(xì)胞：在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。使用染料DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸鹽為CAS No.28718-90-3)確定100個(gè)細(xì)胞的微核率，這是基因組不穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。還確定了凋亡小體的數(shù)目。也確定了異常大的細(xì)胞核的群體，其出現(xiàn)提示染色質(zhì)解凝。

所述電離輻射通過吸收劑量來定義(參數(shù)名稱為D，并以戈瑞(Gray)表示)。根據(jù)本發(fā)明，吸收劑量D在0.5Gy至4Gy之間，優(yōu)選在1Gy至3Gy之間，更優(yōu)選在1.7Gy至2.3Gy之間，更進(jìn)一步優(yōu)選為2Gy。這些區(qū)域通常對(duì)應(yīng)于個(gè)體放療療程，療程的數(shù)目取決于腫瘤的位置、時(shí)間和發(fā)展?fàn)顟B(tài)。

對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方法來說至關(guān)重要的是，在一系列試驗(yàn)開始時(shí)限定所有時(shí)間值t1、t2、t3、t4(即，為了相對(duì)于觀測的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)置校準(zhǔn)方法，至少對(duì)給定的患者，優(yōu)選對(duì)多個(gè)患者，定義試驗(yàn)開始時(shí)間)，并且對(duì)所有參數(shù)的確定來說，所述時(shí)間的間隔都是相同的。

在根據(jù)本發(fā)明的方法中，t1有利地在8分鐘至12分鐘之間，和/或t2優(yōu)選在50分鐘至70分鐘之間，和/或t3有利地在3.5小時(shí)至4.5小時(shí)之間，和/或t4有利地在22小時(shí)至26小時(shí)之間；優(yōu)選滿足所有四個(gè)條件。

在本方法的一個(gè)特別令人感興趣并容易標(biāo)準(zhǔn)化的變體中，t1是10分鐘、t2是60分鐘、t3是4小時(shí)、t4是24小時(shí)，并且D是2Gy。

取自抗放射性患者的對(duì)照細(xì)胞可以取自通過臨床檢查篩選為放療治療中或治療后未顯示出明顯組織反應(yīng)的患者。也可以選擇在利用2Gy吸收劑量的輻照后顯示出體外克隆存活率大于55％的細(xì)胞。

以下，描述典型的實(shí)施方案。

在觀察時(shí)間t和以吸收劑量D輻照后的選自t＝t1、t2、t3和t4的至少一個(gè)觀察時(shí)間，觀察具有標(biāo)記物pH2AX、pATM和/或MRE11的細(xì)胞(所述平均數(shù)分別稱為N_pH2AX(t)、N_pATM(t)和N_MRE11(t))。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定具有標(biāo)記物pH2AX的灶數(shù)和多損傷細(xì)胞的存在。標(biāo)記了蛋白pATM和蛋白MRE11(細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的)的位置。

該第一步驟能夠鑒定出自然狀態(tài)中潛在的基因組不穩(wěn)定性。

根據(jù)本發(fā)明方法的第二步驟包括用所需吸收劑量D(例如2Gy)輻照并對(duì)電離輻射的細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

a)在第一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)通過縫合修復(fù)的輻射誘導(dǎo)DSB進(jìn)行了研究，其中縫合修復(fù)是其修復(fù)的主要模式。在t4，以及在任選的t1、t2和可能的t3，確定每個(gè)細(xì)胞pH2AX灶的數(shù)目；在t3的確定結(jié)果能夠?qū)膖1至t4的動(dòng)力學(xué)速率的定義進(jìn)行整合。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，在持續(xù)時(shí)間t4之后還確定了微核率，以便推導(dǎo)出輻射誘導(dǎo)的微核率。這樣就使得根據(jù)未修復(fù)的DSB數(shù)估計(jì)放射敏感性成為可能。

b)在第二個(gè)實(shí)施方案中，通過測量ATM依賴性激酶活性的功能性，對(duì)電離輻射的細(xì)胞響應(yīng)進(jìn)行了更深入的研究。眾所周知，在抗放射性對(duì)照細(xì)胞中，磷酸化形式的ATM蛋白(pATM)在自然狀態(tài)下是細(xì)胞質(zhì)蛋白。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在輻照狀態(tài)下它們傾向于變?yōu)楹说鞍?。一旦他們進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，pATM形式通過縫合激活修復(fù)機(jī)制并抑制MRE11-依賴性錯(cuò)配修復(fù)通路。

舉例來說，如果輻照后(例如用2Gy的吸收劑量輻照)pATM形式表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)的定位，那么可以斷定pATM形式?jīng)]有或者通常不能從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。這可能是由ATM的突變或者協(xié)助ATM在輻照后進(jìn)入細(xì)胞核的任意其他ATM伴侶蛋白的突變所引起的：在上述任意情況下，這都表示有顯著的放射敏感性。

對(duì)pATM蛋白位置的測定是可選的，該測定至少在t1和t2進(jìn)行，也可選擇性地在t3和t4進(jìn)行。

c)第三個(gè)實(shí)施方案可以結(jié)合前述的實(shí)施方案，其中擴(kuò)展了通過MRE11-依賴通路，細(xì)胞對(duì)電離輻射的細(xì)胞響應(yīng)的研究?？p合通路的能力可以通過pH2AX的免疫熒光進(jìn)行定量，除了縫合這一主要修復(fù)通路以外，申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定出了另一條修復(fù)通路，該通路是縫合通路的備選通路，并在縫合通路不足時(shí)可以替代縫合通路：其是通過MRE11-依賴性重組進(jìn)行的修復(fù)。該通路的能力可通過MRE11灶的免疫熒光動(dòng)力學(xué)研究定量。這種測量方法至少在t1、t2和t3進(jìn)行，也可任選地在t4進(jìn)行。根據(jù)申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)，在2Gy劑量高達(dá)4小時(shí)的輻照之后，在抗放射性對(duì)照細(xì)胞系中，MRE11是細(xì)胞質(zhì)的，而MRE11灶的數(shù)目非常低(通常為7±2個(gè)MRE11灶)；該標(biāo)記在輻照大約24小時(shí)后變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)的。

在最后步驟中，為了預(yù)測患者(特別是患者的CTCAE)的輻射誘導(dǎo)損傷和/或放射敏感性狀態(tài)，通過計(jì)算分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

附圖說明

圖1(a)、(b)和(c)分別示出了以根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)為橫坐標(biāo)的，源自未經(jīng)輻照細(xì)胞的微核灶(a)、標(biāo)記物pH2AX(b)和標(biāo)記物pATM(c)數(shù)目變化的函數(shù)。源自未經(jīng)輻照細(xì)胞的微核灶、標(biāo)記物pH2AX和標(biāo)記物pATM不可預(yù)測放射敏感性。

組織反應(yīng)的嚴(yán)重程度有兩種不同的標(biāo)準(zhǔn)：CTCAE分類和RTOC分類。

稱為CTCAE的分類(通用不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)，法語稱為"Critères d'évaluation de la morbiditéselon la classification du National Cancer Institute")，2006年由美國國家癌癥研究所發(fā)布，是癌癥治療中的不良事件(特別是副作用)的描述性術(shù)語。

不良事件是指任何負(fù)面的或未預(yù)期的體征、癥狀或疾病，暫時(shí)地與醫(yī)學(xué)治療或醫(yī)療程序有關(guān)聯(lián)，但不一定與治療或醫(yī)療程序有關(guān)聯(lián)的事件。不良事件是用于醫(yī)療文件和科學(xué)分析過程中某一特定事件的獨(dú)特表示形式。

為了澄清不良事件的含義，CTCAE為每種不良事件提供了簡明的定義。這種標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其他遺傳毒性應(yīng)激(例如由火災(zāi)引起的傷害)有效，在放療中發(fā)現(xiàn)了其特定的用途。

等級(jí)是指不良事件的嚴(yán)重程度。CTCAE報(bào)告了5種嚴(yán)重等級(jí)(1至5級(jí))，并對(duì)每種不良事件的嚴(yán)重程度給出了唯一的臨床描述，詳見下表1。通過特定的組織反應(yīng)來定義每個(gè)嚴(yán)重等級(jí)。

表1：2010年6月14日由美國國家癌癥研究所發(fā)布的最新版CTCAE標(biāo)準(zhǔn)

在這五個(gè)等級(jí)的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了0級(jí)，對(duì)應(yīng)于無組織效果的情況。

由美國腫瘤放射治療協(xié)會(huì)(RTOC)于1984年提出的稱為RTOG的歷史分類，涵蓋幾乎所有類型的放療后毒性。

然而，RTOG分類對(duì)某些類型的癌癥不適用，而CTCAE分類適用于所有類型的癌癥。

圖2(a)和圖2(b)示出了以CTCAE(圖2(a))或RTOG(圖2(b))嚴(yán)重等級(jí)為橫坐標(biāo)，輻照后24小時(shí)微核數(shù)變化的函數(shù)。使用熒光標(biāo)記物DAPI標(biāo)記微核，然后通過熒光信號(hào)分析進(jìn)行定量。在圖2中用羅馬數(shù)字表示放射敏感性類別(I、II、III)。

輻照后24小時(shí)的微核數(shù)僅能夠用于預(yù)測III類放射敏感性。

圖3(a)、(b)和(c)示出了以CTCAE(圖3(b))或RTOG(圖3(c))嚴(yán)重等級(jí)為橫坐標(biāo)，輻照后24小時(shí)pH2AX灶數(shù)變化的函數(shù)。圖3(a)示出了通過使用標(biāo)記物pH2AX獲得的灶平均數(shù)隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)。

以CTCAE或RTOG嚴(yán)重等級(jí)(組織反應(yīng)的兩種不同嚴(yán)重程度衡量標(biāo)準(zhǔn))作為橫坐標(biāo)，輻照后24小時(shí)得到的pH2AX灶數(shù)的函數(shù)僅能夠用于預(yù)測I、II或III類輻射敏感性，不能用于預(yù)測嚴(yán)重等級(jí)。

圖4(A)示出了患者樣品集合中所有細(xì)胞系(皮膚成纖維細(xì)胞)在用2Gy的劑量輻照后10分鐘后，使用標(biāo)記物pH2AX得到的灶平均數(shù)，虛線表示DSB的正常發(fā)生率，為40DSB每Gy每細(xì)胞。

圖4(A)示出了在2Gy輻照后，來自II類放射敏感性患者的所有細(xì)胞可表征為：比預(yù)期的pH2AX灶(DNA雙鏈斷裂(DSB))更少。這可以由DSB識(shí)別不足的事實(shí)來解釋。

圖4(B)示出了用2Gy的劑量輻照后不同時(shí)間(0分鐘、10分鐘和1小時(shí))pATM在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)。示出了未經(jīng)輻照細(xì)胞和用2Gy的劑量輻照后10分鐘的細(xì)胞相應(yīng)的免疫熒光數(shù)據(jù)。

圖4(B)中出現(xiàn)的數(shù)據(jù)與pATM灶數(shù)相關(guān)，表明存在ATM的“質(zhì)-核遷移”。

圖4(C)示出了細(xì)胞集合中所獲得的標(biāo)記物pATM灶平均數(shù)隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)。為方便起見，省略了在10分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)進(jìn)行的測量的誤差棒。在圖4(A)和4(C)中，每個(gè)點(diǎn)表示三個(gè)獨(dú)立重復(fù)的平均值，誤差棒表示每個(gè)類別的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖5示出了以CTCAE嚴(yán)重等級(jí)為橫坐標(biāo)的，2Gy劑量的輻照后10分鐘(圖5(A))和1小時(shí)(圖5(B))的pATM灶數(shù)變化的函數(shù)。圖5(C)示出了先前分別示出于圖5(A)和5(B)中的，以CTCAE嚴(yán)重等級(jí)為橫坐標(biāo)的，2Gy輻照后10分鐘和24小時(shí)得到的2個(gè)值之間pATM灶數(shù)函數(shù)的最大值。

圖5(B)示出了0級(jí)，即無組織效果的情況。

圖5(C)示出了100例患者中，所述放射生物學(xué)參數(shù)與CTCAE分類嚴(yán)重等級(jí)之間的關(guān)系。因此，圖5(C)代表了相關(guān)性的臨床驗(yàn)證，該相關(guān)性存在于CTCAE嚴(yán)重等級(jí)與2Gy輻照后10分鐘和1小時(shí)得到的2個(gè)值之間pATM灶數(shù)的最大值之間。

在圖5中放射敏感性類別(I、II、IIIa和IIIb)用羅馬數(shù)字表示。圖5(A)、5(B)和5(C)中，每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)類別的三個(gè)獨(dú)立的重復(fù)的平均值。

使用(2Gy+10分鐘)或(2Gy+1小時(shí))之間的pATM灶的最大值可以預(yù)測所有的類別，以及反應(yīng)的嚴(yán)重等級(jí)。

圖6(A)示出了以先前分別示出于圖3(B)和5(C)中的pH2AX灶數(shù)作為橫坐標(biāo)的，使用標(biāo)記物pH2AX得到的灶數(shù)函數(shù)的最大值。

圖6(B)示出了與圖6(A)相同的數(shù)據(jù)，并證明了代表不同人放射敏感性類別(I類、II類和III類)的明確的置信區(qū)。通過對(duì)雙鏈斷裂的識(shí)別和修復(fù)確定放射敏感性。

圖6(C)示出了每種類別類型的類別發(fā)生率。由于給定類別的出現(xiàn)概率與其相應(yīng)的置信區(qū)成反比，因而每個(gè)類別的歸一化頻率由圖6(C)中的柱狀圖表示。虛線對(duì)應(yīng)于與數(shù)據(jù)最擬合的高斯線(r＝0.9)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的說明

一般定義

術(shù)語“輻射誘導(dǎo)損傷”、“輻射誘導(dǎo)的”、“放射敏感性”、“抗放射性”、“放射毒性”和“放療”都是指電離輻射，特別是粒子型輻射，例如，由阿爾法(α)或貝塔(β)粒子組成的輻射或高能電磁輻射，尤其是，伽瑪(γ)或X射線輻射。

術(shù)語ATM的質(zhì)-核遷移是描述尤其是在輻照之后，ATM蛋白通過細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)移動(dòng)的運(yùn)動(dòng)。

發(fā)明詳述

以下將對(duì)具有多種變體的實(shí)施方案進(jìn)行說明，該實(shí)施方案適合于人類患者。

試驗(yàn)準(zhǔn)備

在對(duì)任意細(xì)胞取樣之前，以及在對(duì)取樣的細(xì)胞進(jìn)行任意操作之前，(通常由醫(yī)師)告知各操作員(例如屬于某個(gè)細(xì)胞學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室的)患者的艾滋病毒或丙型肝炎的潛在感染狀態(tài)，以便操作員在取樣、處理和管理培養(yǎng)細(xì)胞的過程中能夠適當(dāng)增加生物安全防護(hù)措施。

然后，操作員從患者處取得細(xì)胞樣品。優(yōu)選地，操作員通過活檢取得皮膚樣品；所述樣品有利地通過根據(jù)已知的稱為“皮膚穿刺活檢”的方法取得。將細(xì)胞樣品置于含20％胎牛血清的滅菌DMEM培養(yǎng)基中。將樣品立即轉(zhuǎn)移到特殊的實(shí)驗(yàn)室，因?yàn)闃悠凡荒茉谑覝刂谐^38個(gè)小時(shí)。

在收到樣品后，根據(jù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室公知的輔助程序，例如Elkin等人在Gordon和Breach(1967)的出版物“哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的放射生物學(xué)”中強(qiáng)調(diào)的輔助程序，以無病毒或化學(xué)轉(zhuǎn)化劑的擴(kuò)增細(xì)胞系形式制備細(xì)胞樣品(通常為活檢組織)。一旦細(xì)胞量足夠(1-3周)，使用根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行第一個(gè)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中的載玻片上。將一定數(shù)量的所述載玻片置于通過劑量學(xué)認(rèn)證的吸收劑量D(例如2Gy)的醫(yī)療輻照器中。另一部分不照射，并呈現(xiàn)自然的狀態(tài)(吸收劑量0Gy)。

可以通過(例如)使用在吸收劑量率為3Gy min^-1的條件下發(fā)送6MV光子的醫(yī)用加速器進(jìn)行輻照。輻照后并且經(jīng)過下面提到的修復(fù)時(shí)間，細(xì)胞仍在37℃培養(yǎng)箱中。

對(duì)于輻照的細(xì)胞，在幾個(gè)修復(fù)時(shí)間(輻射后修復(fù)時(shí)間)之后，得到對(duì)應(yīng)于輻射誘導(dǎo)狀態(tài)的特征。優(yōu)選為至少需要兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，并且進(jìn)一步優(yōu)選為至少需要三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即：t1、t2、t3和t4。所述特征由對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物pH2AX的灶所表示。

然后對(duì)載玻片上的細(xì)胞進(jìn)行固定、裂解和雜交?？梢允褂靡韵乱阎某绦?參見引用自Bodgi等的出版物)：使用3％多聚甲醛和2％蔗糖在室溫下使細(xì)胞固定15分鐘，并用20mM pH值為7.4的HEPES緩沖液(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、50mM NaCl、3mM MgCl₂,300mM蔗糖、0.5％Triton X-100(式t-Oct C₆H₄-(OCH₂CH₂)_xOH的非離子表面活性劑，其中x＝9-10，CAS號(hào)為9002-93-1，由Sigma Aldrich供應(yīng))滲透3分鐘。然后在磷酸鹽緩沖液(已知首字母縮寫為PBS)中洗滌有免疫染色的蓋玻片。在37℃下含有2％牛血清白蛋白(已知首字母縮寫為BSA或已知為組分V，由Sigma Aldrich供應(yīng))的PBS中孵育40分鐘，隨后用PBS洗滌?？?pH2AX的初級(jí)抗體以1:800稀釋濃度使用，其他初級(jí)抗體以1:100的濃度使用。在2％BSA中，在37℃下用抗鼠次級(jí)抗體FITC或抗兔次級(jí)抗體TRITC(1:100，由Sigma Aldrich供應(yīng))進(jìn)行孵育20分鐘。用含DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)的Vectashield^TM處理載玻片以標(biāo)記細(xì)胞核。DAPI染色也可間接用于確定G₁期細(xì)胞(DAPI染色均勻的細(xì)胞)、S期細(xì)胞(具有許多pH2AX灶的細(xì)胞)、G₂期細(xì)胞(DAPI染色不均勻的細(xì)胞)和中期細(xì)胞(染色體可見)的數(shù)目。

在免疫熒光顯微鏡(例如奧林巴斯模式)下觀察所述蓋玻片，得到結(jié)果。可以直接讀數(shù)(通常通過每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)至少50個(gè)G₀/G₁細(xì)胞的灶數(shù))或通過專用的圖像分析軟件讀數(shù)，或甚至在自動(dòng)顯微鏡上讀數(shù)；優(yōu)選對(duì)軟件或自動(dòng)顯微鏡方法進(jìn)行手動(dòng)校準(zhǔn)。

為了獲得具有足夠統(tǒng)計(jì)可靠性的結(jié)果作為診斷基礎(chǔ)，至少進(jìn)行3次獨(dú)立的系列實(shí)驗(yàn)(輻照)，并且計(jì)算確定的時(shí)間點(diǎn)每個(gè)灶數(shù)的平均值。

生物學(xué)和臨床參數(shù)的確定

所用的一般信息和標(biāo)記物

除其他外，本發(fā)明基于數(shù)據(jù)的應(yīng)用，該數(shù)據(jù)獲得自未經(jīng)輻照細(xì)胞(自然狀態(tài))和輻照細(xì)胞(輻射誘導(dǎo)狀態(tài))下的三種標(biāo)記物pH2AX、pATM和MRE11中的至少兩種。該方法基于通過以所述標(biāo)記物作為修復(fù)持續(xù)時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行的標(biāo)記的動(dòng)力學(xué)研究：從輻照結(jié)束開始的確定時(shí)間段后，對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，并研究了其免疫熒光?？梢詼y量完整的動(dòng)力學(xué)曲線，例如有利地位于t0、t1(優(yōu)選10分鐘)、t2(優(yōu)選1小時(shí))、t3(優(yōu)選4小時(shí))和t4(優(yōu)選24小時(shí))的5個(gè)點(diǎn)，已知t0對(duì)應(yīng)于輻照前的狀態(tài)(自然狀態(tài))。

然而，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)某些點(diǎn)(對(duì)應(yīng)于某些修復(fù)時(shí)間點(diǎn))比其他點(diǎn)更重要，并且某些點(diǎn)是不可預(yù)測的。通過對(duì)給定時(shí)間所測定的參數(shù)進(jìn)行審慎地選擇也可以減少測量的次數(shù)，并由此降低了診斷的總體成本，而不降低本方法的預(yù)測能力。這種簡化的方法構(gòu)成了根據(jù)本發(fā)明的預(yù)測方法的基礎(chǔ)。

計(jì)算每個(gè)標(biāo)記物在每個(gè)點(diǎn)和每個(gè)劑量下的平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，已知取樣n＝3(沒有標(biāo)準(zhǔn)誤差類型SE的高斯標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

(i)pH2AX指的是組蛋白H2AX變體X的絲氨酸439中的磷酸化形式，根據(jù)申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)記了通過可靠的主要修復(fù)模式(即縫合)來識(shí)別的DNA雙鏈斷裂(DSB)的數(shù)量。標(biāo)記物pH2AX主要是細(xì)胞核的，唯一的形式是細(xì)胞核灶，并且只對(duì)灶的數(shù)量和尺寸進(jìn)行了分析。

(ii)pATM指的是激酶蛋白ATM的絲氨酸1981中的磷酸化的形式。根據(jù)申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)，在正常條件(抗放射性狀態(tài))下輻照后，ATM從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移。pATM的形式主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，其標(biāo)記出DSB位點(diǎn)。通過定位可區(qū)分標(biāo)記物pATM，其可能是均勻地存在于細(xì)胞質(zhì)中(無細(xì)胞質(zhì)灶)而沒有核灶的形式，唯一的存在于核中的只有核灶形式(無均勻的細(xì)胞核定位)，或者為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核灶。

(iii)MRE11是核酸內(nèi)切酶，使DNA斷裂。根據(jù)申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)修復(fù)過程完成時(shí)，MRE11標(biāo)記了修復(fù)較差的DSB。標(biāo)記物MRE11可以是無灶的細(xì)胞質(zhì)形式，或無灶的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形式，或有灶的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形式。

為了定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的位置(MRE11和pATM在電離輻射的影響下會(huì)改變?cè)撔迯?fù))，為了定量微核、凋亡小體以及細(xì)胞核尺寸這些灶數(shù)據(jù)的額外的細(xì)胞標(biāo)記物，可以使用DAPI(本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA標(biāo)記物)染色計(jì)數(shù)來定位細(xì)胞核。

生物學(xué)參數(shù)

按照如下定義并確定：

-N_pH2AX(t)、N_pATM(t)、N_MRE11(t)是在觀察時(shí)間點(diǎn)t0(未經(jīng)輻照)或輻照后的時(shí)間點(diǎn)t1、t2、t3、t4(吸收劑量：2Gy)，通過使用標(biāo)記物pH2AX、pATM和MRE11獲得的核灶平均數(shù)，已知在根據(jù)本發(fā)明的方法中必須確定參數(shù)N_pH2AX(t)，而其他參數(shù)N_pATM(t)和N_MRE11(t)的確定是任選的，但優(yōu)選確定這些其他參數(shù)；

-N_MN(t)是100個(gè)細(xì)胞中，在自然狀態(tài)下(t＝t0，即未經(jīng)輻照)或在2Gy吸收劑量的輻照之后的時(shí)間點(diǎn)t＝t4時(shí)，觀察到的微核數(shù)(用％表示)。

預(yù)測評(píng)估

旨在從測得的生物數(shù)據(jù)中預(yù)測臨床或放療參數(shù)。提出了兩個(gè)診斷水平：

a)直接源自評(píng)分的數(shù)學(xué)值或與評(píng)分相關(guān)數(shù)學(xué)公式的定量診斷；考慮以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：

(i)分類為I、II或III類的患者(標(biāo)準(zhǔn)稱為類)：

放射敏感性類別(類)的定義有助于醫(yī)生通過根據(jù)本發(fā)明的評(píng)分以及患者的臨床觀察表來確定其與已知的遺傳綜合征的相似性。在上文引用的Joubert等人的出版物中定義了這些分類。

·根據(jù)本發(fā)明，據(jù)認(rèn)為：

如果N_pH2AX(t4)＜2并且

如果N_pATM(t1)＞N_pATM(t2)并且

如果N_pATM(t1)＞30并且

如果A＜10并且

如果B＜5并且

如果C＜2

條件是：

C＝N_pH2AX(t0)+N_MN(t0)；

B＝t0時(shí)大細(xì)胞核(大于150μm²)的百分比％；

A＝N_MRE11(t0)+小pH2AX灶數(shù)/t0時(shí)細(xì)胞；那么認(rèn)為放射敏感性類別(類別標(biāo)準(zhǔn))是“I類”：所述細(xì)胞是抗放射性的。

——如果(N_pH2AX(t4)＞8或N_MN(t4)＞24)

那么認(rèn)為放射敏感性類別(類別標(biāo)準(zhǔn))是“III類”：所述細(xì)胞是高放射敏感性的。

——認(rèn)為所有其他情況的類別標(biāo)準(zhǔn)是“II類”：所述細(xì)胞表現(xiàn)出中度放射敏感性。

(ii)根據(jù)急性CTCAE分類(標(biāo)準(zhǔn)名為CTCAE)來預(yù)期的組織反應(yīng)的嚴(yán)重等級(jí)。

稱為CTCAE的分類(通用不良事件術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)，法語稱為“Critères d'évaluation de la morbidité selon la classification du National Cancer Institute”)，2006年由美國國家癌癥研究所發(fā)布，是癌癥治療中的不良事件(特別是副作用)的描述性術(shù)語。

根據(jù)本發(fā)明，這種等級(jí)根據(jù)以下公式測定：

CTCAE＝5-[最大值(N_pATM(t1)；N_pATM(t2)]/10

b)更定性的診斷，其受定量診斷的影響，但會(huì)請(qǐng)醫(yī)生考慮可能的臨床因素。

分析方法和水平

在第一個(gè)實(shí)施方案中，所有實(shí)驗(yàn)測得的參數(shù)都在數(shù)學(xué)上有聯(lián)系(從某個(gè)方面)。在評(píng)分之間有沖突的事件中，需要重復(fù)或增加某些實(shí)驗(yàn)或測定過程。某些參數(shù)的水平只足夠建立一種評(píng)分和一個(gè)診斷。

第二個(gè)實(shí)施方案考慮到觀察到了某些點(diǎn)不能用于任何評(píng)分的預(yù)測：例如在點(diǎn)N_pH2AX(t3)、N_pATM(t3和t4)的情況。這就是可以設(shè)想限制性分析的原因，其中只有點(diǎn)t0、t1、t2和t4用于pH2AX，點(diǎn)t0、t1和t2用于pATM，以及點(diǎn)t0、t1、t2和t3用于MRE11。

用于確定根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)的該預(yù)測方法已經(jīng)應(yīng)用于健康組織中，所述健康組織中主要是成纖維細(xì)胞類型的結(jié)締組織。該方法可以應(yīng)用于任意類型的癌癥。獲得pATM與CTCAE之間的相關(guān)性，能夠根據(jù)CTCAE分類以及本申請(qǐng)書中所描述的嚴(yán)重等級(jí)確定患者的嚴(yán)重等級(jí)(參看圖5(C))，所述相關(guān)性已在罹患乳腺癌、縱隔癌、所有類型的耳鼻喉癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌和直腸癌的患者中得到了驗(yàn)證。

根據(jù)本發(fā)明的用于確定來自患者的樣品的輻射敏感性的方法已應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞類型的組織以及來自于罹患以下疾病的患者的細(xì)胞中：乳腺癌、前列腺癌、子宮癌、卵巢癌、直腸癌以及所有類型的耳鼻喉癌癥、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、骨肉瘤和黑素瘤。

通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出解釋，但本發(fā)明不以任何方式受實(shí)施例的限制。這些實(shí)施例聚焦于分析取自患者的細(xì)胞系，該分析使得對(duì)患者所屬的嚴(yán)重等級(jí)和放射敏感性類別的確定成為可能。

實(shí)施例：

試驗(yàn)準(zhǔn)備

通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“皮膚穿刺活檢”法從患者處取得皮膚細(xì)胞樣品。然后將細(xì)胞樣品置于含+20％胎牛血清的無菌DMEM培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞樣品立即轉(zhuǎn)移到特殊的實(shí)驗(yàn)室，以保證樣品在室溫中不超過38個(gè)小時(shí)。

在收到樣品后，根據(jù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序，以擴(kuò)增的細(xì)胞系形式，由活檢組織制備細(xì)胞樣品：尤其是通過使用胰蛋白酶分散，將細(xì)胞再次在新?lián)Q的培養(yǎng)基中稀釋，直到獲得所需的細(xì)胞數(shù)。在獲得足量的細(xì)胞量后(一般是3周后)，使用根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行第一個(gè)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中的載玻片上。將一定數(shù)量的所述載玻片置于通過劑量學(xué)認(rèn)證的吸收劑量D為2Gy的醫(yī)療輻照器中。另一部分不照射，所述數(shù)目呈現(xiàn)自然的狀態(tài)(吸收劑量0Gy)。

確定自然狀態(tài)(t0)下和2Gy吸收劑量的輻照后修復(fù)10分鐘(t1)、1小時(shí)(t2)、4小時(shí)(t3)和24小時(shí)(t4)后pH2AX、pATM和MRE11的灶數(shù)，觀察確定100個(gè)細(xì)胞在自然狀態(tài)(t0)下和2Gy吸收劑量的輻照后修復(fù)24小時(shí)后的微核數(shù)N_MN(t)(用％表示)，確定自然狀態(tài)下每個(gè)細(xì)胞中的小pH2AX灶數(shù)，以及確定t0時(shí)大核(大于150μm²)的百分比。

對(duì)于受到輻照的細(xì)胞，使用在吸收劑量率為3Gy min^-1的條件下發(fā)送6MV光子的醫(yī)用加速器進(jìn)行輻照。

在2Gy吸收劑量的輻照之后，將細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱中。對(duì)于輻照后的細(xì)胞(輻射誘導(dǎo)狀態(tài))，樣品在一段特定時(shí)間(輻照后修復(fù)時(shí)間)之后被標(biāo)記，即：輻照結(jié)束時(shí)開始算10分鐘(t1)、1小時(shí)(t2)、4小時(shí)(t3)和24小時(shí)(t4)，并且所得到的核灶平均數(shù)是在所述輻照后修復(fù)時(shí)間10分鐘(t1)、1小時(shí)(t2)、4小時(shí)(t3)和24小時(shí)(t4)通過標(biāo)記物pH2AX、MRE11和pATM得到的。在2Gy吸收劑量的輻照之后的24小時(shí)修復(fù)時(shí)間后，所觀測的100個(gè)細(xì)胞中的微核N_MN(t)數(shù)(用％表示)也是通過對(duì)所述樣品進(jìn)行免疫熒光分析來確定的。

對(duì)于未經(jīng)輻照細(xì)胞(自然狀態(tài)，即在t0時(shí))，通過對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光分析，得到了在自然狀態(tài)下的pH2AX灶平均數(shù)、自然狀態(tài)下每個(gè)細(xì)胞中小pH2AX灶數(shù)、t0時(shí)大核(大于150μm²)的百分比以及觀測到的自發(fā)微核數(shù)。

然后在載玻片上將未經(jīng)輻照細(xì)胞和接受了輻照的細(xì)胞進(jìn)行固定、裂解和雜交。使用3％多聚甲醛和2％蔗糖在室溫下使細(xì)胞固定15分鐘，并用20mM pH值為7.4的HEPES緩沖液(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、50mM NaCl、3mM MgCl₂,300mM蔗糖、0.5％Triton X-100(式t-Oct C₆H₄-(OCH₂CH₂)_xOH的非離子表面活性劑，其中x＝9-10，CAS號(hào)為9002-93-1，由Sigma Aldrich供應(yīng))滲透3分鐘。然后在磷酸鹽緩沖液(已知首字母縮寫為PBS)中洗滌有免疫染色的蓋玻片。在37℃下含有2％牛血清白蛋白(已知首字母縮寫為BSA或已知為組分V，由Sigma Aldrich供應(yīng))的PBS中孵育40分鐘，隨后用PBS洗滌?？?pH2AX初級(jí)抗體以1:800稀釋濃度使用，其他初級(jí)抗體以1:100的濃度使用。在2％BSA中，在37℃下用抗鼠次級(jí)抗體FITC或抗兔次級(jí)抗體TRITC(1:100，由Sigma Aldrich供應(yīng))進(jìn)行孵育20分鐘。

然后用含DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)的VectashieldTM處理載玻片以標(biāo)記細(xì)胞核。DAPI染色也間接地確保能夠確定靜止期G₀/G₁細(xì)胞(DAPI染色均勻的細(xì)胞)、合成期S細(xì)胞(具有許多pH2AX灶的細(xì)胞)、靜止期G₂細(xì)胞(DAPI染色不均勻的細(xì)胞)和有絲分裂期M細(xì)胞(染色體可見)的數(shù)目。特別地，DAPI染色計(jì)數(shù)能夠用于定位細(xì)胞核，從而定位其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的位置，因此能夠?qū)Υ嬖诘奈⒑诉M(jìn)行定量。

在免疫熒光顯微鏡(奧林巴斯模式)下觀察所述蓋玻片，得到結(jié)果。可以通過每個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)至少50個(gè)G₀/G₁細(xì)胞中觀測到的不同標(biāo)記物pH2AX、pATM和MRE11的灶數(shù)并通過專用的圖像分析軟件(imageJ)讀數(shù)。

為了獲得具有足夠統(tǒng)計(jì)可靠性的結(jié)果作為診斷基礎(chǔ)，進(jìn)行了3次獨(dú)立系列的輻照。計(jì)算了多個(gè)患者皮膚細(xì)胞樣品在自然狀態(tài)(t0)下、輻照后修復(fù)時(shí)間10分鐘(t1)、1小時(shí)(t2)、4小時(shí)(t3)和24小時(shí)(t4)后每個(gè)灶數(shù)的平均值和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，并列于下表中(參見表2)。

樣品的嚴(yán)重等級(jí)和放射敏感性的預(yù)測評(píng)估

自上世紀(jì)70年代至今，文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了輻照后死亡的案例(根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)5)，并系統(tǒng)地對(duì)應(yīng)到共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥或患者連接酶4突變的案例中(參見Joubert等的文章“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response；At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity？”,發(fā)表于lnt.J.Radiat.Biol.,vol.84(2),p.107-125(2008))。基于這些回顧性數(shù)據(jù)，并且知曉這些放療期間積累的總劑量，可以得到相應(yīng)未修復(fù)雙鏈斷裂(DSB)數(shù)的平行結(jié)果。實(shí)際上，在大量共濟(jì)失調(diào)細(xì)胞系和LIG4突變系(細(xì)胞系180BR)的獨(dú)特案例中，測量了未修復(fù)雙鏈斷裂的數(shù)。利用這些細(xì)胞系，系統(tǒng)地證明了在一次輻照劑量后，未修復(fù)斷裂率超過了致死閾值。表2中列出了源自AT和180BR患者的細(xì)胞系的值，包含確定閾值高于非修復(fù)斷裂數(shù)的證據(jù)，其中非修復(fù)斷裂數(shù)是患者的致死閾值。對(duì)于這些特定的情況，相應(yīng)的CTCAE等級(jí)是5(＝死亡)。

嚴(yán)重等級(jí)2至4涉及組織反應(yīng)(如皮炎、直腸炎等)。嚴(yán)重等級(jí)1涉及可忍受的副作用，經(jīng)常被從業(yè)人員與等級(jí)0(無影響)混淆。圖6(A)表示以不同患者pATM灶數(shù)的最大值為橫坐標(biāo)，輻照后修復(fù)24小時(shí)后由標(biāo)記物pH2AX獲得的灶數(shù)函數(shù)的最大值，證明了根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)與這些參數(shù)之間存在相關(guān)性。

因此，對(duì)不同患者的皮膚細(xì)胞樣品(參見表2)，應(yīng)用上文所述公式已經(jīng)能夠確定根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)，即：

CTCAE＝5-Max[N_pATM(t1)；N_pATM(t2)]/10。

這個(gè)公式特別適用于確定屬于II類放射敏感性類別患者(中等放射敏感性)的嚴(yán)重等級(jí)。所有屬于III類放射敏感性類型的患者(放射敏感性患者)顯示為(并且必須顯示為)嚴(yán)重等級(jí)5。禁止對(duì)所述放射敏感性患者進(jìn)行放療。

在實(shí)踐中，為了將患者歸入正確的嚴(yán)重等級(jí)值，在確定根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)之前，先確定患者的放射敏感性類別。目前，只有一個(gè)細(xì)胞系的案例，還不足以驗(yàn)證上述的根據(jù)前述公式確定嚴(yán)重等級(jí)的計(jì)算公式。該案例是屬于III型放射敏感性類別的細(xì)胞系(180BR)的案例，而基于前述公式計(jì)算出其根據(jù)CTCAE的嚴(yán)重等級(jí)值為1。然而，優(yōu)選在確定了患者的放射敏感性類別(I、II或III類)之后使用預(yù)測嚴(yán)重等級(jí)的公式。因此，根據(jù)本發(fā)明，患者180BR實(shí)際上屬于III類(高放射敏感性)，并且因此不應(yīng)以任何借口使其遭受輻射。另一方面，也利用所有其他細(xì)胞系驗(yàn)證了患者的嚴(yán)重等級(jí)。

按照以下方式，利用上述公式已經(jīng)測定了樣品的放射敏感性類別：

(a)如果N_pH2AX(t4)＜2并且N_pATM(t1)＞N_pATM(t2)，并且N_pATM(t1)＞30并且A＜10并且B＜5并且C＜2；條件是：

C＝N_pH2AX(t0)+N_MN(t0)；

B＝t0時(shí)大細(xì)胞核(大于150μm²)的百分比％；

A＝N_MRE11(t0)+小pH2AX灶數(shù)/t0時(shí)細(xì)胞；

則認(rèn)為樣品是抗放射性的；

(b)如果(N_pH2AX(t4)＞8或N_MN(t4)＞24)，則認(rèn)為樣品是高放射敏感性的；

(c)在所有其他情況下，認(rèn)為樣品為中度放射敏感性的。

在表2中示出了根據(jù)CTCAE分類的嚴(yán)重等級(jí)和樣品的放射敏感性的定量值。