本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及用于檢測銅綠假單胞菌和表征其的揮發(fā)性有機化合物的裝置和方法。銅綠假單胞菌是造成多達~14%的所有醫(yī)院感染和多達~23%的重癥監(jiān)護病房感染的革蘭氏陰性細菌病原體。該細菌是燒傷感染和外耳感染(外耳炎-包括惡性外耳炎)的最常見原因，以及囊性纖維化患者中的最常見呼吸道病原體，導致高發(fā)病率和死亡率。銅綠假單胞菌感染的特征在于高抗生素耐藥性，并且需要特殊治療，通常組合使用兩種不同的抗生素。因此，盡可能早地識別銅綠假單胞菌感染是非常重要的。如今使用的最常見方法是培養(yǎng)接種，其可以在兩天內(nèi)識別出銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌細菌產(chǎn)生2-氨基苯乙酮(2-AA)，這是一種具有葡萄樣氣味的揮發(fā)性物質(zhì)。使用離子-噴霧氣相色譜分析，幾項研究顯示，2-AA可以在囊性纖維化患者的呼吸測試中充當銅綠假單胞菌感染的生物標志物(Metters等人,Analyst2014;16:3999,Scott-Thomas等人BMCPulmMed2010;10:56)。2-AA已與銅綠假單胞菌中的細胞密度感應(yīng)信號傳導相關(guān)(參見，例如Bandyopadhaya等人,PLoSPatholog2012；11月15日的在線出版物)，然而，對銅綠假單胞菌中的2-AA的信號傳導途徑和作用知之甚少。2-AA在銅綠假單胞菌中沒有已知受體。2-AA是一大類細菌揮發(fā)性有機化合物(VOC)、細菌代謝物之一，其已經(jīng)證明可用于診斷多種疾病和病況，包括糖尿病、胃腸道和肝臟疾病、肺病、一些癌癥和感染。例如，Reuther等人(美國專利申請US2014/0336081)教導了通過檢測個體的呼吸、血液或組織中的微生物肺炎病原體的VOC特征而診斷肺炎。理想地，VOC分析可最終消除對疑似感染或污染的細菌培養(yǎng)以識別病原體的需要。迄今為止，生物或非生物(醫(yī)療儀器、土壤、水等)樣品中的VOC的分析主要基于氣相色譜(GS)、質(zhì)譜(MS)、組合GC-MS、化學發(fā)光、光吸收光譜系統(tǒng)、“電子鼻”和氣體傳感器系統(tǒng)。專用裝置可能對于檢測某些VOC是特別有效的：例如，火焰離子化檢測氣相色譜(GC-FID)、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(PTR-MS)。由與VOC相互作用以生成向計算機發(fā)送信號輸出(光學、電子)的物理或化學變化的專用或非選擇性傳感器組成的多維傳感器陣列可生成樣品組分的詳細概況，然后可將其與疾病的存在與否相關(guān)聯(lián)。然而，這樣的“電子鼻”是復(fù)雜的、昂貴的并且需要復(fù)雜的計算能力來表征樣品概況。識別指定配體的生物傳感器、用于檢測配體結(jié)合的生物傳感器以及用于報道配體結(jié)合的裝置，試圖提供用于組分概況分析的基于生物的傳感器系統(tǒng)。Hseih等人的美國專利申請2004/019932描述了“人工鼻”的制造和使用，其將生物配體結(jié)合與基于壓電的靈敏度結(jié)合起來。在Zupancic等人的美國專利申請2014/0273020中也教導利用雜交瘤細胞作為生物傳感器的通用檢測系統(tǒng)。Sayler等人(美國專利申請2003/0027241)公開了經(jīng)基因工程改造的噬菌體和生物發(fā)光生物報道細胞，其在所述噬菌體感染靶微生物后發(fā)光。經(jīng)由所述報道細胞的弧菌LuxR-luxCDABE構(gòu)建體響應(yīng)于靶細菌的攜帶Lux-I的噬菌體感染而產(chǎn)生生物發(fā)光。Michelini等人(Biosensors&Bioelectronics2005,20,2261-2267)和Leskinen等人(Chemosphere2005,61,259-266)描述了用于使用重組釀酒酵母檢測具有雄激素活性的化合物的生物發(fā)光測定。MMirasoli等人(Anal.Chem.2002,74,5948-5953)描述了具有內(nèi)部信號校正的細菌生物傳感器。D'SouzaSF(Microbialbiosensors.BiosensBioelectron.2001August;16(6):337-53)公開了將活細胞捕獲于聚合物基質(zhì)中，用于制造穩(wěn)定的生物發(fā)光細胞生物傳感器。SimpsonML等人(TrendsBiotech,1998;16:332-338)描述了生物發(fā)光微生物生物傳感器，其中細胞被包封于聚合物基質(zhì)中，以增加生物傳感器穩(wěn)定性。臺灣專利TW239392公開了與特定信號處理結(jié)合以檢測水毒性或營養(yǎng)特性的便攜式生物傳感系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于樣品毒性對微生物生長的抑制。美國專利申請US2008/032326公開了基于電滲透細胞和多種光合生物體的水質(zhì)分析儀。PCT申請WO2007083137公開了由能夠基于揮發(fā)性物質(zhì)的發(fā)散而檢測特定被分析物的生物傳感器構(gòu)成的裝置，基于使用瓊脂、瓊脂糖和藻酸鹽(所有組分都通常用于固定細菌細胞)的基質(zhì)而設(shè)想了固定程序。PCT申請WO2008152124公開了用作生物傳感器的經(jīng)工程改造的酵母細胞。美國專利申請US2003/162164A1公開了一種測試系統(tǒng)，其中細胞借助懸浮介質(zhì)而固定于多孔支持物上。Nivens等人報道了使用細菌液體培養(yǎng)物的BBIC(生物發(fā)光生物報道集成電路)(Nivens,DE,J.Appl.Microbiol.2004;96(1):33-46)。其它相關(guān)的出版物包括Hitt等人的US2007/0003996，Boots等人(JBreathRes.8,2014127106)，Winson等人(FEMSMicrobLett1998163:185-92)，Kereswani等人(PLoSpathogens,2011,7:e1002192)，Que等人(PLoS2013ONE8:e80140)和Scott-Thomas等人(BMCPulmMed2010;10:56)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了一種裝置，其包括含有多核苷酸的報道細胞，所述多核苷酸包含編碼能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子的第一核酸序列和包含用于調(diào)節(jié)所述報道分子的轉(zhuǎn)錄的luxR樣受體結(jié)合元件的第二核酸序列，其中所述報道細胞附接至固體支持物或包封于附接至固體支持物的包封基質(zhì)內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了檢測生物樣品中的2AA或其衍生物的方法，其包括使所述樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中可檢測信號的存在指示所述生物樣品中的2-AA。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了診斷個體中的銅綠假單胞菌感染的方法，其包括使所述個體的生物樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中檢測到高于預(yù)定水平的信號表明所述樣品中存在銅綠假單胞菌感染。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了檢測測試樣品中存在產(chǎn)生2-AA的生物體的方法，其包括使包含所述生物體的樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中可檢測信號的存在表明所述測試樣品中存在產(chǎn)生2-AA的生物體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了用于檢測個體中的銅綠假單胞菌感染的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括本發(fā)明的裝置和用于檢測可檢測信號的傳感器。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細胞還包含編碼能夠結(jié)合2AA的luxR樣受體的第三核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述多核苷酸包含第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第三核酸序列包含在不同于所述多核苷酸的多核苷酸上。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述luxR樣受體對于所述細胞是外來的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述luxR樣受體選自弧菌(Vibrio)LuxR樣受體、果膠桿菌(Pectobacterium)LuxR樣受體、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)LuxR樣受體、沙雷氏菌(Serratia)LuxR樣受體、假單胞菌(Pseudomonas)LuxR樣受體、色桿菌(Chromobacteria)LuxR樣受體和鹽單胞菌(Halomonas)LuxR樣受體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣表達。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣激動劑和/或拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細胞缺乏luxI表達。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述可檢測信號選自光信號、化學信號和電化學信號。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述可檢測信號是生物發(fā)光。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道分子是報道多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道多肽是熒光素酶。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一核酸序列包含luxCDABE基因簇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞選自細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、藻類細胞和動物細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞是細菌細胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述細菌細胞選自埃希氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、葡萄球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、不動桿菌屬、聚球藍細菌屬、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和青枯菌屬。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞是大腸桿菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞位于包封基質(zhì)內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞被固定于固體支持物上。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述報道細胞被定位成接觸揮發(fā)性樣品。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述方法還包括用2AA標準樣品校準所述裝置，以便將2AA的量或濃度分配給可檢測信號的值。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述接觸經(jīng)由流體連通。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述接觸經(jīng)由氣體連通。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述生物樣品選自細菌培養(yǎng)物、細菌培養(yǎng)液、呼吸空氣、汗液、唾液、痰液、血液、血漿、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、腦脊液、腦膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、精液、膿液、排泄物、嘔吐物、眼淚、組織活檢樣品、細胞培養(yǎng)物、環(huán)境空氣、獲得自傷口或燒傷的組織樣品、獲得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、陰道、傷口、燒傷或疑似具有感染的任何其它組織的拭子、痰以及粘液。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述生物樣品是氣體樣品。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述氣體樣品是收集自選自以下的來源的頂部空間氣體：動物或人患者的呼吸空氣、汗液、唾液、痰液、血液、血漿、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、腦脊液、腦膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、精液、膿液、排泄物、嘔吐物、眼淚、組織活檢樣品、細胞培養(yǎng)物、環(huán)境空氣、獲得自傷口或燒傷的組織樣品、獲得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、陰道、傷口、燒傷或疑似具有感染的任何其它組織的拭子、痰、粘液、滲出物或呼氣。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述氣體樣品包含疑似細菌種群的頂部空間氣體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述疑似細菌種群是疑似細菌感染。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述產(chǎn)生2-AA的生物體是銅綠假單胞菌。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所檢測到的2AA的量或模式指示銅綠假單胞菌感染。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述個體疑似患有中耳炎，而所述生物樣品是耳部滲出物、從耳部滲出物收集的頂部空間氣體或從患耳收集的頂部空間氣體的樣品。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述系統(tǒng)還包括用于顯示可檢測信號的檢測事件的顯示器。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述系統(tǒng)還包括與報道細胞經(jīng)液體或氣體連通的樣品支架，其用于支托來自個體的生物樣品用于檢測。除非另有定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和/或科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的具有相同含義。盡管與本文所述的方法或材料相同或等效的方法或材料也可以用于實施或測試本公開的實施方案，但下文描述示例性的方法和/或材料。在沖突的情況下，以本專利說明書(包括定義)為準。此外，所述材料、方法和實例僅是說明性的，并不一定旨在是限制性的。附圖的幾個視圖的簡述本文參考附圖僅通過示例的方式描述了本發(fā)明的一些實施方案?，F(xiàn)在具體詳細參考附圖，強調(diào)的是，所示細節(jié)是通過示例的方式，并用于說明性討論本發(fā)明的實施方案的目的。在這方面，對附圖所作的描述使得可以如何實施本發(fā)明的實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在附圖中：圖1是顯示由銅綠假單胞菌的揮發(fā)物誘導大腸桿菌/pSB401報道菌株中的發(fā)光的圖。在過夜暴露于銅綠假單胞菌(PA14)的揮發(fā)性化合物后測量大腸桿菌/pSB401的相對發(fā)光。從瓊脂刮下報道菌株的菌落，懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中，并在96孔板中測量發(fā)光水平。誤差條表示5次重復(fù)的標準偏差，且上方星號表示根據(jù)Mann-Whitney秩和檢驗的顯著差異(p<0.01)；圖2是顯示銅綠假單胞菌的總揮發(fā)物對表達LuxR的生物傳感器的影響的圖。如圖1中測量表達LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物的大腸桿菌/pSB401報道菌株相應(yīng)于銅綠假單胞菌(PAO1)的總揮發(fā)物或1pmol3-氧代-C6-HSL(AHL)的相對發(fā)光水平。通過將1pmol3-氧代-C6-HSL添加至報道物(PAO1+AHL)來檢查揮發(fā)物的拮抗或協(xié)同效果。n=8；誤差條是平均值的標準誤差。不同字母表明根據(jù)Ranks的ANOVA和Student–Newman–Keuls事后檢驗的統(tǒng)計學差異(P<0.05)；圖3A-3B舉例說明銅綠假單胞菌PAO1野生型和lasR–缺陷的突變型銅綠假單胞菌的揮發(fā)物概況。圖3A：銅綠假單胞菌的野生型(PAO1-黑線)和lasR突變體(ΔlasR-紅線)的氣相色譜圖。圖3B：銅綠假單胞菌野生型和ΔlasR菌株中的五種揮發(fā)物的豐度。n=3；誤差條表示平均值的標準誤差，星號表示根據(jù)studentt-檢驗的ΔlasR(灰色)和PAO1野生型(黑色)之間的顯著差異(P<0.05)。注意野生型銅綠假單胞菌揮發(fā)物中的2-AA的豐度。為了便于可視化，僅呈現(xiàn)12-20分鐘的保留時間的結(jié)果。在這些保留時間之外，突變型菌株中的揮發(fā)物概況相比于野生型菌株沒有實質(zhì)性差異；圖4是顯示2-AA和C6-HSL對大腸桿菌/pSB401發(fā)光的影響的圖。如圖1中測量大腸桿菌pSB401報道菌株在5nMC6-HSL(pSB401+C6HSL)或50μM2-AA(pSB401+2AA)存在的情況下的相對發(fā)光。測量無任何添加的菌株的發(fā)光作為對照(pSB401)。在暴露于信號傳導分子后20小時實施測量。誤差條表示四次重復(fù)的標準偏差，且上方字母表示顯著統(tǒng)計組ANOVA和事后Tukey(p<0.05)；圖5A和5B是顯示2-AA和3-氧代-C6-HSL對表達LuxR的生物傳感器的影響的圖。將2-AA(0-500μM)(黑色柱)和3-氧代-C6-HSL(0-500nM)(紅色柱)添加至大腸桿菌/pSB401(5A)和大腸桿菌JLD271/pAL103(5B)報道菌株以評估2-AA對LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物的影響。對于拮抗/協(xié)同測定(3-氧代-C6-HSL+2AA)，在10nM3-氧代-C6-HSL存在的情況下將0-500nM2-AA添加至報道菌株。值表示暴露于信號傳導分子后12小時進行的發(fā)光測量。n=4；誤差條表示平均值的標準誤差，星號表明根據(jù)ANOVA和Dunnett事后檢驗的相比于對照的統(tǒng)計學差異(P<0.01)；圖6是顯示2-AA對費氏弧菌的LuxR調(diào)節(jié)的發(fā)光的影響的圖。在18小時溫育期間每半小時測量野生型費氏弧菌MJ-1在不存在2-AA和3-氧代-C6-HSL(對照，黑色圓形)和在存在25(空心圓形)、50(黑色三角形)和100μM(空心三角形)2-AA以及10nM3-氧代-C6-HSL(黑色正方形)的情況下的發(fā)光。注意對100μM2-AA的有效響應(yīng)；圖7是顯示作為揮發(fā)物應(yīng)用的2-AA對大腸桿菌/pSB401的發(fā)光的誘導的圖。在過夜暴露于添加至雙向petri皿的對側(cè)隔室的1μg2-AA(1)之后測量相比于未接受任何添加的對照(0)的大腸桿菌/pSB401的相對發(fā)光。從瓊脂刮下報道菌株的菌落，懸浮于PBS中，并在96孔板中測量。誤差條表示四次重復(fù)的標準偏差，且星號表示根據(jù)t檢驗的各組之間的顯著差異(P<0.05)；圖8是顯示2-AA和C-12HSL對銅綠假單胞菌LasR/pKD201發(fā)光的影響的圖。在50μMC12-HSL(JP2+C12HSL)或2-AA(JP2+2AA)存在的情況下測定銅綠假單胞菌JP2/pKD201報道菌株的相對發(fā)光。測量無任何添加的菌株的發(fā)光作為對照(JP2)。在暴露于信號傳導分子后10小時實施測量。誤差條表示五次重復(fù)的標準偏差，且上方字母表示顯著統(tǒng)計組，ANOVA和事后Tukey(p<0.05)；圖9是顯示2AA和C4-HSL對銅綠假單胞菌的RhlR受體的影響的圖。在50μMC4-HSL(RhlA+C4HSL)或2-AA(RhlA+2AA)存在的情況下的銅綠假單胞菌JP2/pKD-RhlA報道菌株的相對發(fā)光。測量無任何添加的菌株的發(fā)光作為對照(RhlA)。在暴露于信號傳導分子后20小時實施測量。誤差條表示六次重復(fù)的標準偏差，且上方字母表示顯著統(tǒng)計組，ANOVA和事后Tukey(p<0.05)；圖10是顯示2-AA和相關(guān)修飾分子對表達LuxR的生物傳感器的影響的圖。在暴露于50μM以下物質(zhì)后測量大腸桿菌pSB401報道菌株的相對發(fā)光：2-氨基苯乙酮(2-AA)、3-氨基苯乙酮(3-AA)、4-氨基苯乙酮(4-AA)、2-硝基苯乙酮、鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸、苯乙酮和2-氨基苯甲醛。測量在溫育20小時之后。n=6；誤差條表示平均值的標準誤差。不同字母表明根據(jù)ANOVA和Student–Newman–Keuls事后檢驗的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。每個分子的結(jié)構(gòu)描繪于對應(yīng)欄上方；圖11A和11B舉例說明3-氧代-C6-HSL(11A)和2-AA(11B)與LuxR分子模型的生物信息學對接。相互作用顯示為虛線并根據(jù)相互作用類型著色。氫鍵-綠色，疏水相互作用-粉紅色；圖12是費氏弧菌(SEQIDNO:1)、火神弧菌(SEQIDNO:2)、擬態(tài)弧菌(SEQIDNO:3)、鰒發(fā)光桿菌(SEQIDNO:4)和副溶血性弧菌(SEQIDNO:5)的LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物(受體蛋白)的多重氨基酸序列比對(根據(jù)T-Coffee算法比對)。以紅色標記與2-AA相互作用的殘基；圖13A-13B是2-AA的質(zhì)譜分析的圖。圖13A顯示總離子色譜測量(TIC)；圖123顯示100ppm2-AA標準樣品的選擇離子監(jiān)測色譜(SIM)；圖14A-14C是顯示膿液樣品編號1的質(zhì)譜分析的圖。圖14A顯示總離子色譜測量(TIC)；圖14B顯示膿液樣品的選擇離子監(jiān)測色譜(SIM)，且圖14C顯示如圖14A中的2-AA1ppm標準品(藍色)和膿液樣品編號1(紅色)的TIC重疊圖；圖15A-15B是膿液樣品編號2的質(zhì)譜分析的圖。圖15A顯示總離子色譜測量(TIC)；圖15B顯示膿液樣品的選擇離子監(jiān)測色譜(SIM)；圖16A-16B是顯示使用質(zhì)譜和報道菌株分析膿液樣品中的2-AA的圖。圖16A顯示圖14和15中呈現(xiàn)的TIC分析的重疊圖：1ppm2-AA標準品(紅色)、銅綠假單胞菌陽性膿液樣品1(綠色)、銅綠假單胞菌陰性膿液樣品(黑色)；圖16B顯示在暴露于從膿液樣品1(MS分析中2-AA陽性且培養(yǎng)測試中銅綠假單胞菌陽性)和膿液樣品2(MS中2-AA陰性且培養(yǎng)測試中銅綠假單胞菌陰性)發(fā)出的揮發(fā)物后大腸桿菌pSB401報道菌株的相對發(fā)光；圖17是顯示使用報道菌株分析馬傷口樣品中的2-AA的圖。該圖顯示在暴露于從馬傷口組織樣品編號1(用抗生素治療之后兩天)和馬傷口組織樣品編號2(用抗生素治療之后一周)發(fā)出的揮發(fā)物后大腸桿菌pSB401報道菌株的相對發(fā)光。圖18是顯示本發(fā)明的裝置的簡化形式的示意圖，其中代表性報道細胞固定于固體支持物上；圖19是顯示本發(fā)明的裝置的簡化形式的示意圖，其中代表性報道細胞包封于固體支持物上的可透氣基質(zhì)內(nèi)；圖20是顯示本發(fā)明的系統(tǒng)的簡化形式的示意圖，其包括裝置和傳感器。本發(fā)明具體實施方案的描述本發(fā)明，在其一些實施方案中，涉及生物傳感器裝置，其包括附接至或包封于固體支持物內(nèi)的報道細胞，所述細胞能夠在接觸luxR樣受體配體后產(chǎn)生可檢測信號。在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明在其申請中不必限于以下描述中記載或由實施例列舉的細節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實施方案或者能夠以各種方式實施或進行。有效并可靠地檢測和識別細菌是醫(yī)學、環(huán)境科學和工業(yè)中持續(xù)面臨的挑戰(zhàn)。常規(guī)方法通常需要費時且費錢地培養(yǎng)疑似含有細菌的樣品材料，用于通常復(fù)雜的分析程序。某些細菌，諸如銅綠假單胞菌，通過分泌因子諸如細胞密度感應(yīng)(QS)信號、根據(jù)群體密度調(diào)節(jié)響應(yīng)的基因簇的活化劑，與它們的環(huán)境相互作用。本發(fā)明人已顯示，銅綠假單胞菌中的一種這樣的分泌物，揮發(fā)性有機化合物(VOC)2-氨基苯乙酮(2-AA)2-AA結(jié)合并活化LuxR樣受體轉(zhuǎn)錄因子。在實施本發(fā)明時，本發(fā)明人已證明，包含LuxR樣受體和多核苷酸的報道細胞可以將2-AA有效地檢測為純化合物(參見圖4、5A-5B、6和7)和來自銅綠假單胞菌的分泌物(參見圖1、2和3A-3B)，所述多核苷酸包含轉(zhuǎn)錄融合至核酸序列的luxR樣受體結(jié)合元件，而所述核酸序列編碼報道分子。生物傳感器報道細胞的2-AA檢測在檢測來自疑似感染的組織的樣品中的銅綠假單胞菌時與氣相色譜一樣有效(參見圖13A-13B、14A-14C、15A-15B、16A-16B和17)。包括此類包封和/或附接至固體支持物的生物傳感器報道細胞的裝置可以有效地用于廣泛多種醫(yī)學、科學、環(huán)境和工業(yè)應(yīng)用中的2-AA和細菌檢測。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了裝置，其包括：報道細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：a)第一核酸序列，其編碼能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子，和b)第二核酸序列，其包含luxR樣受體結(jié)合元件，用于調(diào)節(jié)編碼所述報道分子的序列的轉(zhuǎn)錄；其中所述報道細胞附接至固體支持物或包封于附接至固體支持物的包封基質(zhì)內(nèi)。如本文中所用，短語“報道細胞”是指可用外源多核苷酸基因工程改造(即，轉(zhuǎn)化或感染)的細胞。如本文中所用，術(shù)語“外源”或“外來”是指這樣的遺傳物質(zhì)(例如DNA、RNA)，其通常不是野生型或非工程改造的、未轉(zhuǎn)化的生物體的遺傳物質(zhì)的組分。本發(fā)明的報道細胞可以是細菌報道細胞、真菌報道細胞、植物報道細胞、藻類報道細胞、原生動物報道細胞和動物報道細胞。在一些實施方案中，所述報道細胞是細菌報道細胞。所述細菌報道細胞可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌細胞。適合于本發(fā)明的示例性細菌報道細胞包括但不限于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、不動桿菌屬、聚球藍細菌屬、嗜水氣單胞菌(Aeromanashydrophilia)和青枯菌屬。在一些實施方案中，所述報道細胞為費氏弧菌MJ-1，其具有天然luxR受體、報道和結(jié)合元件。在一些實施方案中，所述報道細胞是經(jīng)基因修飾的大腸桿菌，包括，但不限于攜帶表達費氏弧菌的LuxR的pSB401質(zhì)粒的大腸桿菌，和攜帶表達費氏弧菌的LuxR的pAL103質(zhì)粒的大腸桿菌JLD271/pAL103。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述報道細胞是含有包含luxR樣受體結(jié)合元件和來自費氏弧菌的完整luxCDABE基因盒的多核苷酸且特異于luxR受體配體的細菌。任何合適的細菌均可用作報道細胞，但在一些實施方案中，所用細菌應(yīng)當缺乏luxI自體誘導物(AI)的表達，以避免LuxR樣受體結(jié)合其配體并活化luxR盒后的自體誘導的反饋回路。在報道細胞內(nèi)，內(nèi)源性Lux-R樣信號傳導系統(tǒng)組分的表達可以是潛在的混淆因素，其干擾對事件諸如配體(例如2-AA)與LuxR樣報道蛋白的結(jié)合或LuxR樣受體-配體復(fù)合物與受體結(jié)合元件的結(jié)合的準確檢測和報道。因此，在一些實施方案中，所述宿主細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣表達。在其它實施方案中，所述宿主報道細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣激動劑和/或拮抗劑。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，所述報道細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣受體表達。在其它實施方案中，所述報道細胞缺乏內(nèi)源性luxR樣激動劑和/或拮抗劑。在特定實施方案中，所述報道細胞缺乏luxI表達。為了確定候選細胞是否確實缺乏內(nèi)源性luxR樣受體表達，可以通過PCR檢測編碼luxR樣受體的DNA序列或此類序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的存在，可以檢測(例如，從免疫學上)實際luxR樣受體蛋白，且可以用全細胞或在其無細胞級分中來評價luxR樣配體的結(jié)合。類似測定法可以用于檢測內(nèi)源性luxR樣激動劑或拮抗劑，或luxI。luxR樣激動劑和拮抗劑以及l(fā)uxI的表達也可通過如下來評估：觀察候選細胞、細胞提取物或其級分對與分離的luxR樣受體的結(jié)合或?qū)o細胞或全細胞制備物中的luxR樣受體信號傳導的功能的影響。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的報道細胞是天然存在的細胞，其天然能夠結(jié)合luxR樣受體的配體。然而，通常，“報道細胞”是經(jīng)基因工程改造的細胞，其攜帶對于細胞而言外來的luxR樣受體。在本發(fā)明的其它實施方案中，所述報道細胞包含編碼能夠結(jié)合2AA的luxR樣受體的第三核酸序列。術(shù)語“l(fā)ux-R樣受體”或“響應(yīng)調(diào)節(jié)物”涉及包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，2-AA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和識別luxR樣受體結(jié)合核苷酸序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽受體。通常，luxR樣受體結(jié)合在其側(cè)鏈中具有六個或八個碳的?；?高絲氨酸內(nèi)酯諸如2-AA。這些碳鏈可以是氧化或未氧化的，是指：N-3-(氧代己?；?高絲氨酸內(nèi)酯、N-3-(氧代辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯、N-己酰基高絲氨酸內(nèi)酯、N-辛酰基高絲氨酸內(nèi)酯。攜帶LuxR樣受體的細菌物種包括但不限于費氏弧菌(Vibriofisscheri)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)、致金色假單胞菌(Pseuodomonasaureofacians)、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)和Halomonasanticariensis。在一些實施方案中，術(shù)語“l(fā)uxR樣受體”是指與來自生物發(fā)光海洋細菌費氏弧菌的細胞密度感應(yīng)(QS)系統(tǒng)同源的LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)的同源胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(SEQIDNO:6)。在LuxI/LuxR系統(tǒng)中，生理性LuxI同源物是自體誘導物(AI)合酶，其催化SAM和酰基載體蛋白(ACP)之間的反應(yīng)，以產(chǎn)生可自由擴散的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL或HSL)自體誘導物(AI)。在高濃度下，AHLAI結(jié)合胞質(zhì)LuxR樣轉(zhuǎn)錄因子(LuxR樣受體)（當不被AI結(jié)合時，其迅速降解）。AI結(jié)合穩(wěn)定了LuxR樣蛋白，使其折疊，結(jié)合DNA中的luxR樣受體結(jié)合元件，并活化靶基因的轉(zhuǎn)錄。通常，AHL(HSL)-結(jié)合的LuxR樣受體蛋白還活化luxI表達，形成充斥(flood)于AI附近的前饋自體誘導回路。已在超過100種革蘭氏陰性細菌種中識別出了LuxI/LuxR同源物(參見，例如，Case等人,ISMEJ,2008;2:345-49)。使用生物信息學對接技術(shù)，本發(fā)明人已定義了費氏弧菌LuxR樣受體(SEQIDNO:6)中2-AA的潛在對接位點，并識別出了許多氨基酸殘基，其對于配體在結(jié)合口袋內(nèi)的正確配合是關(guān)鍵的(參見圖11A和11B和12)。據(jù)發(fā)現(xiàn)，不響應(yīng)于2-AA或銅綠假單胞菌的報道細胞攜帶的QS信號傳導受體蛋白缺乏假定關(guān)鍵殘基。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，LuxR樣受體蛋白包含LuxR樣同源物或直系同源物，其具有對應(yīng)于費氏弧菌LuxR樣受體蛋白(SEQIDNO:6)的氨基酸Trp66、Try70和Asp79以及對應(yīng)于Tyr62、Leu118、Ala139、Ile46和Ile81的保守氨基酸殘基。適合于在本發(fā)明的一些實施方案中使用且具有包含假定2-AA結(jié)合殘基的高度相似序列的示例性LuxR樣受體包括，但不限于，費氏弧菌(SEQIDNO:6)、火神弧菌(SEQIDNO:7)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)(SEQIDNO:8)、鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathi)(SEQIDNO:9)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)(SEQIDNO:10)的LuxR樣受體。編碼LuxR受體蛋白的示例性核酸序列包括SEQIDNO:11、12、13、14和15。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述LuxR樣受體蛋白包含費氏弧菌LuxR樣受體蛋白(SEQIDNO:6)。在一些實施方案中，所述LuxR樣受體蛋白由核酸序列SEQIDNO:11編碼。所述報道細胞包含編碼報道分子的第一核酸序列，所述報道分子能夠產(chǎn)生可檢測信號并與包含luxR樣受體結(jié)合元件的第二核苷酸序列翻譯融合。作為轉(zhuǎn)錄因子的luxR樣受體，一旦其結(jié)合信號傳導分子(例如，2-AA)，則經(jīng)由受體結(jié)合元件活化基因的轉(zhuǎn)錄。如本文中所用，術(shù)語“報道分子”是指基因轉(zhuǎn)錄物，其轉(zhuǎn)錄導致產(chǎn)生可檢測信號。如本文中所用，可檢測信號可以是報道細胞或其環(huán)境中的任何改變，其隨后可以由于報道分子的轉(zhuǎn)錄而被檢測到。在一些實施方案中，所述報道分子是催化產(chǎn)生可檢測信號的多肽(例如酶)(例如熒光素酶)的mRNA。在一些實施方案中，所述報道分子是多核苷酸調(diào)節(jié)因子，或編碼使得(例如誘導)其它多肽能夠產(chǎn)生可檢測信號的肽或多肽調(diào)節(jié)因子。調(diào)節(jié)因子，諸如轉(zhuǎn)錄增強子和酶誘導物，可以在多個水平發(fā)揮作用，以實現(xiàn)可檢測信號的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實施方案中，編碼報道分子的核酸序列是lux熒光素酶基因簇或“盒”。如本文中所用，“基因簇”是指多個編碼基因產(chǎn)物的基因序列，所述基因產(chǎn)物是相同生物化學途徑(例如產(chǎn)生熒光素酶生物發(fā)光)的組分?；罨虼豯uxCDABE參與熒光素酶基因合成和活化，所述熒光素酶基因一旦被活化就發(fā)射光(發(fā)光)。如本文中所用，術(shù)語“盒”是指由載體和插入的DNA序列制成的重組DNA構(gòu)建體。完整lux盒包含五個基因，即luxA、B、C、D和E。LuxA和luxB編碼負責生成生物發(fā)光的蛋白，而luxC和D編碼生物發(fā)光反應(yīng)所需的醛。在一個具體實施方案中，lux簇為費氏弧菌的luxCDABE簇(SEQIDNO:16)。盡管本文描述的實驗涉及使用來自費氏弧菌的luxCDABE(SEQIDNO:16)，但lux簇或盒可以來自其它發(fā)光細菌，包括發(fā)光光桿菌(Photorhabdusluminescens)或哈氏弧菌(Vibrioharveyi)。此外，所述報道分子可以是昆蟲熒光素酶(來自螢火蟲或磕頭蟲(click-beetle)的熒光素酶)。除了發(fā)光，也可使報道細胞生成熒光信號(使用綠色熒光蛋白，SEQIDNO:17，或紅色熒光蛋白，SEQIDNO:18，橙色熒光蛋白SEQIDNO:19，或在青色、紅色或黃色波長發(fā)熒光的衍生物，以及水母發(fā)光蛋白或尿卟啉原III甲基轉(zhuǎn)移酶(UMT))。也可以在本發(fā)明內(nèi)實現(xiàn)色度(lacZ、xylE、bla)、化學發(fā)光和電化學信號。在表1中提供了適用于本發(fā)明的產(chǎn)生可檢測信號部分的分子的非限制性實例。表1可識別部分氨基酸序列(GenBank登錄號)/SEQIDNO:核酸序列(GenBank登錄號)/SEQIDNO:綠色熒光蛋白AAL33912/17AF435427/27堿性磷酸酶AAK73766/20AY042185/30過氧化物酶CAA00083/21A00740/31組氨酸標簽GenBank登錄號AAK09208/22的氨基酸264-269GenBank登錄號AF329457/32的氨基酸790-807Myc標簽GenBank登錄號AAK09208/23的氨基酸273-283GenBank登錄號AF329457/33的氨基酸817-849生物素連接酶標簽(Biotinlygasetag)LHHILDAQKMVWNHR/24橙色熒光蛋白AAL33917/19AF435432/29β半乳糖苷酶ACH42114/25EU626139/34鏈霉抗生物素蛋白AAM49066/26AF283893/35AmcyanAEI59072.1/44JF796087.1/45如本文中所用，短語“LuxR樣受體結(jié)合元件”是指在LuxR樣受體配體結(jié)合LuxR受體后可結(jié)合LuxR樣受體且可以順式方式活化核酸序列的轉(zhuǎn)錄的DNA序列。應(yīng)理解的是，包含本發(fā)明的報道細胞的luxR樣受體結(jié)合元件的核酸序列是用于調(diào)節(jié)編碼能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子的第一核酸序列的轉(zhuǎn)錄。在費氏弧菌中，天然LuxR受體-配體復(fù)合物(LuxR/3-氧代-C6-HSL)結(jié)合被稱為‘lux框’的luxR-luxI基因間區(qū)域內(nèi)的20-bpluxR-受體結(jié)合序列。lux框居中于luxI啟動子起始位點上游42.5bp，表明LuxR/3-氧代-C6-HSL復(fù)合物充當轉(zhuǎn)錄活化物。在費氏弧菌LuxRQS系統(tǒng)中，位于位置3-5和16-18的lux框堿基對對于lux表達的LuxR調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的。LuxR/3-氧代-C6-HSL復(fù)合物中的配體結(jié)合使得LuxR受體蛋白對蛋白水解耐受。LuxR樣受體結(jié)合元件也存在于費氏弧菌中的lux基因座之外：已證明，大于20種基因在存在生理濃度的3-氧代-C6的情況下被顯著差異調(diào)節(jié)(Antunes等人,JBacteriol2007;189:8387-91)。已證明，LuxR/3-氧代-C6復(fù)合物直接結(jié)合這些基因中相應(yīng)的啟動子元件中的7種。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，第二核酸序列的luxR樣結(jié)合元件包含費氏弧菌lux框序列(SEQIDNO:36)。可結(jié)合一些luxR樣受體蛋白的lux框同源物，包括但不限于根癌農(nóng)桿菌的tra框(SEQIDNO:37)、銅綠假單胞菌的rhl框(SEQIDNO:38)、Qsc102(被銅綠假單胞菌的lasR活化)(SEQIDNO:39)、Qsc117(SEQIDNO:40)、phzA(SEQIDNO:41)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacenocepacia)的cep框(SEQIDNO:42)序列和銅綠假單胞菌的las框(SEQIDNO:46)。在一些實施方案中，第二核酸序列的luxR樣結(jié)合元件包含費氏弧菌lux框(SEQIDNO:36)序列。應(yīng)理解，響應(yīng)于2-AA信號傳導的其它細菌細胞可包含由可適用于本發(fā)明的額外luxR樣結(jié)合元件調(diào)節(jié)的基因。此類額外luxR樣結(jié)合元件的識別和表征可以通過如下進行：篩選在存在和不存在2-AA配體的情況下的差異基因表達，檢測與已知luxR樣結(jié)合元件同源的序列和/或進行候選DNA序列與luxR-配體復(fù)合物的直接結(jié)合研究。在一些實施方案中，所述報道細胞包含含有的多核苷酸。在其它實施方案中，所述第三核酸序列包含于不同于所述多核苷酸的多核苷酸上?？梢葬槍唧w宿主報道細胞類型優(yōu)化核酸序列用于表達，所述核酸序列包含第一核酸序列、第二核酸序列和任選的第三核酸序列，其中所述第一核酸序列編碼能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子，所述第二核酸序列包含用于調(diào)節(jié)編碼所述報道分子的序列的轉(zhuǎn)錄的luxR樣受體結(jié)合元件，所述第三核酸序列編碼本發(fā)明的一些實施方案的luxR樣受體。此類序列修飾的實例包括但不限于改變G/C含量以更緊密地接近目標宿主細胞物種通常具有的含量，以及去除宿主細胞物種中的非典型密碼子（通常所說的密碼子優(yōu)化）。短語“密碼子優(yōu)化”是指選擇合適的DNA核苷酸用于結(jié)構(gòu)基因或其片段內(nèi)從而接近目標宿主細胞內(nèi)的密碼子使用。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指這樣的基因，其中天然基因或天然存在的基因的核苷酸序列已經(jīng)被修飾，以便利用宿主細胞內(nèi)統(tǒng)計學上優(yōu)選或統(tǒng)計學上有利的密碼子。通常在DNA水平檢查核苷酸序列，并且采用任何合適的程序確定優(yōu)化用于在宿主細胞物種中表達的編碼區(qū)，例如參見Sardana等人(1996,PlantCellReports15:677-681)。在該方法中，密碼子使用的標準偏差（密碼子使用偏倚的度量）可以通過如下計算：首先找出天然基因的各個密碼子使用率相對于高表達基因的各個密碼子使用率的平方比例偏差(squaredproportionaldeviation)，隨后計算平均平方偏差。所用公式為：1SDCU=n=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高表達基因中密碼子n的使用頻率，其中Yn是指目標基因中密碼子n的使用頻率，N是指目標基因中密碼子的總數(shù)。根據(jù)特定細胞類型的優(yōu)選的密碼子使用而優(yōu)化核酸序列的一種方法是基于直接使用密碼子優(yōu)化表，而無需進行任何額外的統(tǒng)計學計算，所述密碼子優(yōu)化表諸如通過日本的NIAS(國立農(nóng)業(yè)生物科學研究院(NationalInstituteofAgrobiologicalSciences))DNA文庫(www.dotkazusadotordotjp/codon/)的密碼子使用數(shù)據(jù)庫在線提供的密碼子優(yōu)化表。密碼子使用數(shù)據(jù)庫含有大量不同物種的密碼子使用表，其中每個密碼子使用表基于Genbank中存在的數(shù)據(jù)從統(tǒng)計學上確定。通過使用所參考的表來確定特定物種(例如，大腸桿菌)中每個氨基酸的最優(yōu)選或最有利的密碼子，可將編碼目標蛋白的天然存在的核苷酸序列針對該特定物種進行密碼子優(yōu)化。關(guān)于氨基酸，通過用統(tǒng)計學上更有利的相應(yīng)密碼子替代特定物種基因組中可具有低統(tǒng)計發(fā)生率的密碼子來實現(xiàn)這一點。然而，可以選擇一個或多個較不利的密碼子以缺失存在的限制位點，以在可能有用的連接點(添加信號肽或終止盒的5'末端和3'末端，可用來一起切割和剪接區(qū)段以產(chǎn)生正確的全長序列的內(nèi)部位點)上產(chǎn)生新的限制位點，或者消除可負面影響mRNA穩(wěn)定性或表達的核苷酸序列。天然存在的編碼核苷酸序列，在任何修飾前，可能已經(jīng)含有對應(yīng)于特定物種中統(tǒng)計學上有利的密碼子的多個密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可包括確定天然核苷酸序列內(nèi)的哪些密碼子就特定細胞而言不是統(tǒng)計學上有利的，并且根據(jù)特定物種的密碼子使用表修飾這些密碼子以產(chǎn)生經(jīng)密碼子優(yōu)化的衍生物。經(jīng)修飾的核苷酸序列可以針對宿主細胞密碼子使用進行完全或部分優(yōu)化，條件是經(jīng)修飾的核苷酸序列編碼的蛋白以高于由相應(yīng)的天然存在的基因或天然基因編碼的蛋白的水平產(chǎn)生。通過改變密碼子使用構(gòu)建合成基因在例如PCT專利申請?zhí)?3/07278中有述。為了使用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的報道細胞，在適用于指導報道分子在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄的luxR受體結(jié)合元件和順式調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子序列)的轉(zhuǎn)錄控制下，可以將包含第一、第二和任選第三核酸序列的多核苷酸連接入核酸表達載體(例如細菌質(zhì)粒)或核酸構(gòu)建體系統(tǒng)中。在具體實施方案中，lux框元件和啟動子包含如SEQIDNO:43中所示的核酸序列。在一些實施方案中，將包含第一、第二和任選的第三核苷酸序列的多核苷酸連接入核酸表達載體中，用于在宿主細胞中轉(zhuǎn)化和表達。在某些實施方案中，編碼用于產(chǎn)生可檢測信號的報道分子的第一核酸序列、包含luxR-受體結(jié)合元件的第二核酸序列和編碼luxR樣受體蛋白的第三核酸序列位于同一核酸表達載體中，并因而位于宿主細胞內(nèi)的同一多核苷酸上。因此，在一些實施方案中，所述報道細胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼報道分子的第一核酸序列、包含luxR樣受體結(jié)合元件的第二核酸序列和編碼luxR樣受體蛋白的第三核酸序列。在其它實施方案中，所述第三核酸序列包含在與包含第一和第二核酸序列的多核苷酸(其在本文中也被稱為核酸構(gòu)建體系統(tǒng))不同且分開的多核苷酸上。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述載體是細菌質(zhì)粒，其使用市售的細菌質(zhì)?！肮羌堋睒?gòu)建。在特定實施方案中，所用細菌質(zhì)粒骨架是pACYC184或pBR322。因此，本發(fā)明設(shè)想了包含本發(fā)明的第一、第二和任選的第三核酸序列的分離的多核苷酸。短語“分離的多核苷酸”是指單鏈或雙鏈核酸序列，其以以下形式分離和提供：RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如上述的組合)。如本文中所用，短語“互補多核苷酸序列”是指由使用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其它RNA依賴性DNA聚合酶將信使RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的序列。此類序列隨后可以使用DNA依賴性DNA聚合酶在體內(nèi)或體外擴增。如本文中所用，短語“基因組多核苷酸序列”是指源自（分離自）染色體的序列，因而其表示染色體的連續(xù)部分。如本文中所用，短語“復(fù)合多核苷酸序列”是指至少部分互補且至少部分是基因組的序列。復(fù)合序列可包含編碼本發(fā)明多肽所需的一些外顯子序列以及在其間間插的一些內(nèi)含子序列。所述內(nèi)含子序列可以具有任何來源（包括其它基因），并且通?？砂Ｊ丶艚有盘栃蛄?。此類內(nèi)含子序列還可包含順式作用表達調(diào)節(jié)元件。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述報道細胞選自包含編碼能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子的核酸序列(例如luxR基因簇)的細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、藻類細胞和動物細胞。真核宿主細胞(酵母：Gupta等人,FEMSYeastRes20034:305;Sanseverino等人,ApplEnviron.Microbiol2005;71:4455-60;和人細胞：Patterson等人,JIndMicrobBiotech,2005;3:2115-23以及Close等人,PLoSOne,2010;5:e12441)以及細菌宿主細胞已用luxR序列工程改造以產(chǎn)生生物發(fā)光的報道細胞。因此，本發(fā)明的表達載體或核酸構(gòu)建體可包含使得載體適合于在原核生物、真核生物或優(yōu)選兩者(例如，穿梭載體)中復(fù)制和整合的額外序列。典型的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列(例如，啟動子、增強子)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子(例如，多腺苷酸化信號)?？梢允褂酶鞣N方法將本發(fā)明的表達載體引入宿主細胞系統(tǒng)中。此類方法在Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork(1989,1992),Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.(1995),Vega等人,GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.(1995),Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques4(6):504-512,1986]中有一般性描述，并且包括，例如，穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和用重組病毒載體感染。此外，對于正負選擇方法，參見美國專利號5,464,764和5,487,992。示例性的基于細菌的表達系統(tǒng)在Baneyx等人,CurrentOpinioninBiotechnology,1999;10,411-421和Macrides等人,MicrobiolRev1996,60:512-538中公開，其通過引用并入本文。所述宿主細胞可以用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中，本發(fā)明的核酸分子被整合入宿主細胞基因組中，因此其呈現(xiàn)穩(wěn)定和遺傳的性狀。在瞬時轉(zhuǎn)化中，重組核酸分子由轉(zhuǎn)化的細胞表達，但并不整合入基因組中，因此呈現(xiàn)瞬時性狀。如所提及，所述報道細胞附接至固體支持物。如本文中所用，術(shù)語“附接(attach,attachment)”、“粘附(adhere,adhered,adherent)”、“固定化(immobilize)”或類似術(shù)語通常是指將例如本發(fā)明的報道細胞固定化或固定至表面，諸如通過物理吸附、化學粘合和類似方法或其組合。具體地，“細胞附接”、“細胞粘附”或類似術(shù)語是指細胞與表面的相互作用或結(jié)合，諸如通過將細胞與表面、諸如固體支持物的表面一起培養(yǎng)或相互作用。所述固體支持物表面可以是未修飾的或修飾的，諸如具有表面涂層、錨定材料、相容劑(例如，纖連蛋白、膠原蛋白、核纖層蛋白、明膠、聚賴氨酸等)，或促進報道細胞粘附和細胞狀態(tài)或生長的類似修飾。對于懸浮細胞，所述細胞可以，例如，在溫育期間通過物理沉降或通過表面-細胞相互作用來使其與固體支持物的表面接觸。表面-細胞相互作用可通過若干種方式來實現(xiàn)，例如，反應(yīng)表面與細胞表面(細胞膜，細胞壁)蛋白或分子的共價偶聯(lián)、基于電荷的電相互作用、固體支持物表面分子(例如，抗體、配體)與細胞表面分子的結(jié)合，或類似方法。用于附接或固定報道細胞的固體支持物是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，Michelini等人的US2012/0045835。簡而言之，所述固體支持物可以是天然聚合物，諸如膠原和/或其衍生物與蛋白聚糖或蛋白聚糖混合物的組合，其中選擇所述膠原的來源(例如，牛、馬、豬、鯊魚)以與生物傳感器活力相容。所述固體支持物還可以是合成聚合物，例如，合成乙烯基聚合物與任選修飾的聚硅氧烷的組合，確保結(jié)構(gòu)剛度和報道細胞限制以及足以令光信號傳輸至檢測器的透明度，其中所述可檢測信號是光信號(例如，生物發(fā)光)。合適的聚合物包括，但不限于，乙烯基聚合物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、膠原-蛋白聚糖混合物等。取決于所固定的細胞類型，所述固體支持物也可以是天然材料，諸如紙、木材、金屬、天然聚合物，或合成材料，或天然和合成材料的混合物，諸如混合的天然或合成的聚合物。此外，合成聚合物，可以包含固定/附接混合物，或者被添加至固定/附接混合物中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，添加植物粘液以增加細胞對固體支持物的粘附性。小百分比就足夠了。來自苯胺紫(mauve)和蘆薈的示例性植物粘液是市售的。根據(jù)報道細胞的類型，用于細胞附接的固體支持物也應(yīng)用適當?shù)木彌_溶液來制備。在不損害報道細胞的細胞完整性、活力和功能性(即，響應(yīng)于2AA的能力)的同時將細胞固定至固體支持物。在一種示例性固定方法中，將所述細胞培養(yǎng)至所需密度，任選地沖洗干凈培養(yǎng)基，并且與偶聯(lián)劑諸如戊二醛、六亞甲基二異氰酸酯和六亞甲基二異硫氰酸酯混合，然后應(yīng)用于固體支持物表面。如所提及，固定至固體支持物可包括使用聚丙烯酰胺固定，使用天然聚合物諸如藻酸、膠原、明膠、瓊脂和κ-角叉菜膠固定，以及使用合成聚合物諸如光固化樹脂和聚氨酯聚合物固定。生物傳感器諸如本文描述的報道細胞的一個優(yōu)點是其靈敏度、小尺寸和操作的簡易性。所述報道細胞可以容易地與測試樣品接觸，或者甚至部署用于檢測luxR樣配體(例如，2-AA)或原位(例如，在傷口(例如，燒傷、感染、炎癥)部位或疑似污染的表面或材料(例如，醫(yī)療裝置、水源、呼吸或空氣))產(chǎn)生它們的微生物。將報道細胞固定在所述裝置的固體支持物上允許：將包含固定的報道細胞的裝置定位到疑似LuxR樣受體配體(例如，2-AA)的來源附近，簡化檢測且甚至可能消除樣品回收的需要。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，裝置經(jīng)配置使得其允許將報道細胞定位到疑似LuxR樣受體配體(例如，2-AA)的來源附近。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供了包括如本文所述的報道細胞的裝置，所述報道細胞附接至固體支持物或包封于可透氣的包封基質(zhì)內(nèi)。圖18舉例說明本發(fā)明的一個實施方案的示例性裝置10，其具有報道細胞12，所述報道細胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述報道細胞固定在固體支持物14上。固體支持物14可以是細胞諸如細菌或酵母細胞可以附接至的任何剛性或半剛性材料。在本發(fā)明的一些實施方案中，報道細胞12附接至固體支持物14。在其它實施方案中，報道細胞12包封于包封基質(zhì)內(nèi)。維持細胞活力、允許可檢測信號的檢測和提供透氣性(例如，用于與揮發(fā)性luxR樣受體配體諸如2-AA接觸的細胞)的合適的包封基質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。例如，Smith等人(US2008/0182287)教導了用于操作、分析或處理活細胞的來自PBP嵌段聚合物的細胞包封基質(zhì)，其特征在于低毒性和光學相容性。PBP凝膠特性可通過提供具有適合于不同應(yīng)用的不同轉(zhuǎn)變溫度的嵌段聚合物的制劑進行改良。在另一個實施方案中，聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，和聚硅氧烷(任選地用原硅酸酯修飾和/或交聯(lián))，可以不同濃度使用(通常為0.05至15％)，以生成適合于包封細胞和維持它們的活力、同時確保透明度(這是用于檢測發(fā)光信號的關(guān)鍵因素)的基質(zhì)。一種經(jīng)修飾的聚硅氧烷是具有烷基、丙烯酸基團、醇基團的聚硅氧烷。聚硅氧烷是具有30-60個Si原子長度的Si--O--Si主鏈和C1至C12的側(cè)鏈的聚合物。原硅酸酯是合適的交聯(lián)劑，并且在一些實施方案中，聚硅氧烷是用四乙基-原硅酸酯交聯(lián)的二甲基硅氧烷。在其它實施方案中，所述包封基質(zhì)可以是瓊脂基質(zhì)，或任何其它合適的固體或半固體培養(yǎng)基，其單獨使用或用可透氣保留層覆蓋(例如涂覆)。此外，藻酸鹽已成功地用于包封細胞，而對活力無不利影響。長期活力(數(shù)周至數(shù)月)是可能的，只要藻酸鹽包封的細胞保持濕潤。膠乳共聚物也已報道可用于固定大腸桿菌并維持活力。其它基質(zhì)包括角叉菜膠、丙烯酸乙酸乙烯酯共聚物、聚氯乙烯聚合物、溶膠-凝膠、瓊脂、瓊脂糖、微機械加工的納米孔膜、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酰胺、聚氨酯/聚羰基(polycarbomyl)磺酸酯或聚乙烯醇。也可以采用電泳沉積。報道細胞可以被包封，例如，通過與溶膠狀態(tài)的包封基質(zhì)混合，然后膠凝化，并將混合物形成為所需形狀(珠、塊、顆粒等)，直到膠凝化并適合于附接至固體支持物。應(yīng)理解，所述包封基質(zhì)可以是固體支持物的一部分，或并入固體支持物，使得報道細胞分布于固體支持物的體內(nèi)。在此類實施方案中，固體支持物可以有利地具有包封基質(zhì)的特征中的一些，例如，最少干擾或不干擾可檢測信號(例如光學透明度)、維持報道細胞活力和功能以及透氣性。應(yīng)理解，本發(fā)明的裝置中的信號檢測可以通過將大量報道細胞附接至固體支持物或者通過在包封基質(zhì)中包括大量報道細胞來增強。因此，在一些實施方案中，所述裝置包括報道細胞群體。對所述裝置中包含的細胞數(shù)目的限制由以下確定：細胞類型、固體支持物或包封基質(zhì)的大小、傳感器用于檢測可檢測信號的靈敏度、預(yù)期用途(例如，預(yù)期的LuxR-1配體的豐度、測試環(huán)境的物理局限等)。有效用于本發(fā)明的裝置中的合適的報道細胞群體大小可通過如下確定：暴露于LuxR樣配體(例如，2-AA)或產(chǎn)生LuxR樣配體的生物體之后，監(jiān)測報道細胞培養(yǎng)物的系列稀釋液中的可檢測信號(例如，生物發(fā)光)。用預(yù)期存在于待測試的樣品、表面或物體中的范圍內(nèi)的配體或產(chǎn)生配體的生物體的量或濃度校準可以進一步有助于精確測定裝置所需的報道細胞的數(shù)目。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述報道細胞包含在營養(yǎng)培養(yǎng)基諸如營養(yǎng)瓊脂上，或與營養(yǎng)培養(yǎng)基諸如營養(yǎng)瓊脂接觸。營養(yǎng)培養(yǎng)基可添加至固體支持物上，或可整合于固體支持物內(nèi)。在一些實施方案中，報道細胞或細胞設(shè)置于培養(yǎng)容器諸如培養(yǎng)皿、燒瓶或多孔培養(yǎng)板中的營養(yǎng)培養(yǎng)基上。圖19舉例說明本發(fā)明的一個實施方案的示例性裝置100，其具有報道細胞12，所述報道細胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述報道細胞包封于包封基質(zhì)18內(nèi)，所述包封基質(zhì)18固定在固體支持物14上。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述裝置包含在還包含傳感器的系統(tǒng)中。如本文中所用，術(shù)語“傳感器”是指能夠檢測由報道細胞產(chǎn)生的可檢測信號的檢測器裝置。在一些實施方案中，其中核酸序列編碼的可檢測信號是發(fā)光或生物發(fā)光，而能夠產(chǎn)生可檢測信號的報道分子可以是在luxR樣活化后產(chǎn)生的能夠發(fā)光的蛋白諸如熒光素酶，可檢測信號可通過光度計來讀取或者發(fā)光可通過使用光電二極管和將報道測定從發(fā)光信號轉(zhuǎn)換為電信號的信號處理系統(tǒng)來讀取。用于檢測發(fā)光的一些方法描述于(Vijayaraghavan等人，2007)和(Li等人，2012)。包括本發(fā)明的裝置的系統(tǒng)可包含在所述裝置上的基本上任何位置的各種不同的傳感器方式?？墒褂貌⑷胙b置或與裝置分離但與待檢測的裝置區(qū)域?qū)R的傳感器來實現(xiàn)檢測。傳感器通常包括信號接收器(檢測器)和用于將檢測到的信號轉(zhuǎn)換為可以容易地傳輸、定量和存儲的能量形式的換能器。傳感器的類型自然由可檢測信號的性質(zhì)決定。因此，在一些實施方案中，所述傳感器選自光傳感器、電化學傳感器和化學傳感器。在一些實施方案中，所述裝置還可包括用于增加檢測信號的靈敏度水平的信號擴增器。在其它實施方案中，其中可檢測信號是發(fā)光或熒光，由發(fā)光報道細胞(無論是細菌、酵母還是其它)生成的光響應(yīng)通常用光學換能器諸如光電倍增管、光電二極管、微通道板或電荷耦合裝置來測量。另外還需要一些將生物發(fā)光信號轉(zhuǎn)移至換能器的裝置，這使得在大型裝置中必須用到光纖電纜、透鏡或液體光導。然而，可干擾膝上型計算機或具有存儲和計算能力的無線裝置(諸如“智能手機”)的手持式、電池操作的光電倍增器裝置是可用的(TheAzurCorporation,Carlsbad,Calif.)，其為本發(fā)明的裝置的移動和遠程使用(例如，在野外條件下和在診所和醫(yī)院病房中)提供了平臺。此類移動發(fā)光檢測器可以如下制成，例如，使用直接干擾報道細胞的集成電路光學換能器，形成“生物發(fā)光生物報道集成電路(BBIC)，其可被包含在小(近似5mm2)區(qū)域內(nèi)，并且包括兩個主要組分：用于捕獲生物發(fā)光報道細胞信號的光檢測器和用于管理和存儲源自生物發(fā)光的信息的信號處理器。如果需要的話，也可將遠程射頻(RF)發(fā)射器并入裝置(在一般情況下)，或并入用于無線數(shù)據(jù)中繼(relay)的整體集成電路設(shè)計。由于所有必需元件完全自含于BBIC內(nèi)，所以通過將BBIC簡單地暴露于所需測試樣品即可實現(xiàn)操作能力。在一些實施方案中，所述系統(tǒng)還包括用于顯示所檢測事件的顯示器。圖20舉例說明本發(fā)明的一個實施方案的示例性系統(tǒng)200，其具有報道細胞12，所述報道細胞12包含具有如本文所述的第一和第二核苷酸序列的多核苷酸16，所述報道細胞固定在固體支持物14上，所述裝置還包含用于檢測來自報道分子的可檢測信號的傳感器20。在一些實施方案中，傳感器20位于固體支持物14上，附接至固體支持物14或并入固體支持物14。在其它實施方案中，傳感器20與固體支持物分開，例如傳感器可包含于對接站中，所述固體支持物與報道細胞被合適鄰近置于所述對接站中，以便檢測可檢測信號。所述系統(tǒng)或裝置還可包含樣品支架，其用于將報道細胞定位成足夠鄰近測試樣品，以便有效量的LuxR樣受體配體(當存在時)接觸和結(jié)合LuxR樣受體分子?！皹悠贰笨梢允谦@得自人、動物或其它來源的生物樣品，并且可以是，但不限于：呼吸空氣、汗液、唾液、痰液、血液、血漿、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、腦脊液、腦膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、精液、膿液、排泄物、嘔吐物、眼淚、組織活檢樣品、細胞培養(yǎng)物、環(huán)境空氣、獲得自傷口或燒傷的組織樣品、獲得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、陰道、傷口、燒傷或疑似具有感染的任何其它組織的拭子、痰和粘液。為了測試來自肺部諸如來自囊性纖維化患者的感染，樣品可以是粘液，但也可以是呼出至合適容器中的呼吸樣品。所述樣品也可以是非生物的，諸如醫(yī)院中使用的需要針對銅綠假單胞菌感染進行監(jiān)測的醫(yī)療裝置、插管、導管等。在一些實施方案中，所述裝置可以設(shè)計成連續(xù)監(jiān)測醫(yī)療裝置附近的空氣樣品，并且一旦達到或超過2AA的預(yù)定水平就發(fā)出警告。本發(fā)明的裝置可以檢測結(jié)合并活化LuxR樣受體蛋白以產(chǎn)生來自報道細胞的信號的揮發(fā)性有機分子。因此，在一些實施方案中，所述樣品本身不是流體或固體樣品，而是本身為氣體的樣品(諸如來自囊性纖維化患者的呼吸樣品)或與樣品直接接觸且向其中釋放揮發(fā)性有機分子(諸如2-AA)的氣體級分(例如空氣)。因此，在一些實施方案中，設(shè)計裝置，使得所述報道細胞被定位為接觸揮發(fā)性樣品，例如，報道細胞可以與測試樣品氣體連通。在其它實施方案中，報道細胞與測試樣品流體連通。如本文中所用，短語“氣體連通”是指報道細胞的放置，使得包含樣品的或從樣品發(fā)出的一種或多種氣體可以接觸報道細胞。氣體連通可以包括用于防止樣品的或由樣品散發(fā)的一種或多種氣體分散的裝置、用于盛放并任選地濃縮氣體的捕獲器、]用于防止氣體樣品的縮合/相轉(zhuǎn)移的加熱元件、用于使氣體從樣品移動至報道細胞的導管等。本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，2-AA可結(jié)合并活化luxR樣受體蛋白，而由銅綠假單胞菌分泌的2-AA可通過包含多核苷酸的報道細胞來檢測，所述多核苷酸包含本發(fā)明的第一和第二核酸序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供了檢測樣品中l(wèi)uxR樣配體諸如2-AA的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中檢測到高于預(yù)定水平的可檢測信號表明所述樣品中存在2-AA(或其它luxR樣配體)。在一些實施方案中，所述luxR樣配體是2-AA。由于2-AA由銅綠假單胞菌分泌，在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了檢測個體中的銅綠假單胞菌感染的方法，所述方法包括使來自所述個體的生物樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中檢測到高于預(yù)定水平的可檢測信號表明所述個體中存在銅綠假單胞菌感染。在本發(fā)明的一些實施方案中，提供了檢測樣品中的產(chǎn)生2-AA的生物體的方法，所述方法包括使所述樣品與本發(fā)明的裝置接觸，其中檢測到高于預(yù)定水平的可檢測信號表明所述樣品中存在產(chǎn)生2-AA的生物體。在一些實施方案中，在個體中檢測luxR樣配體諸如2-AA或檢測銅綠假單胞菌感染或在樣品中檢測產(chǎn)生2-AA的生物體的方法還包括用2-AA標準樣品校準本發(fā)明的裝置，以便將2-AA的量或濃度分配給可檢測信號的值。本發(fā)明的裝置的校準可以通過如下進行：使所述裝置的報道細胞與不同濃度的外源添加的2-AA接觸，并測量誘導可測量的發(fā)光響應(yīng)所需的濃度和時間。制備2-AA的標準稀釋液，例如，0.001nM至100nM，并將其點樣于吸附性基板上，并與報道細胞鄰近置于裝置中，例如樣品支架中。記錄可檢測信號的檢測，例如，從時間零，并以30秒至30分鐘間隔，經(jīng)預(yù)定的時間段。數(shù)據(jù)可以被繪制為隨著時間的每單位時間的事件數(shù)(例如光子數(shù))，并可確定所述裝置對于2-AA的靈敏度的范圍，例如，通過選擇其中報道細胞對2-AA的響應(yīng)與2-AA濃度呈線性的范圍。因此，可以從記錄自報道細胞的信號事件的記錄確定所述裝置的預(yù)定鄰近空間中的2-AA濃度的值。一旦確定了標準品的值，則根據(jù)隨著時間發(fā)生的可檢測事件的數(shù)目分析樣品數(shù)據(jù)。樣品中或從樣品散發(fā)的2-AA的濃度越高，每單位時間記錄的事件數(shù)目越大。也可在本發(fā)明的裝置的校準和實際使用中使用對照樣品。陽性對照可以包括，例如，將已知luxR樣配體(例如2-AA)添加至樣品以觀察累加信號產(chǎn)生，并添加luxR樣受體或lux途徑拮抗劑以驗證響應(yīng)的特異性。陰性對照可包括，但不限于，引入對照裝置，所述對照裝置包含缺乏報道途徑的組分的細胞或包含不同的配體非響應(yīng)性報道途徑的細胞。在一些實施方案中，在氣體樣品上進行l(wèi)uxR-1樣配體(例如2-AA)的檢測。氣體樣品可收集自luxR樣配體的疑似來源的鄰近，例如，密封小瓶中，吸附性材料諸如木炭上，或通過濃縮和液化。氣體重構(gòu)可以通過加熱液化樣品來實現(xiàn)。在一些實施方案中，所述氣體樣品收集自樣品的頂部空間氣體。如本文中所用，術(shù)語“頂部空間氣體”是指樣品上方或周圍的任何氣體材料。對于密閉容器中的固體或液體樣品，例如，頂部空間氣體是容器的不包括固體或液體樣品的內(nèi)容物部分。細菌培養(yǎng)物的頂部空間氣體是在其中培養(yǎng)細菌的液體或固體培養(yǎng)基上方收集的氣體級分。當分析氣體樣品時，應(yīng)在使得揮發(fā)性2-AA能夠與受體結(jié)合、活化LuxR樣受體并產(chǎn)生可檢測信號的條件下進行樣品和報道細胞之間的接觸。在此類條件下防止直接接觸對于特異性是重要的，因為2-AA是活化luxR樣受體的唯一揮發(fā)性分子。合適條件的非限制性實例是PBS緩沖液，約pH8，并在37度下暴露幾分鐘至過夜。對于傷口、感染或污染儀器(例如醫(yī)療裝置)、土壤、廢水和可能需要原位取樣的其它樣品的取樣，頂部空間氣體可通過如下取樣：將裝置與樣品(最大程度接近地(取決于報道細胞的靈敏度)放置例如，距離疑似銅綠假單胞菌感染的傷口或燒傷的幾毫米至一厘米)。在一些實施方案中，本發(fā)明的裝置可包括用于收集頂部空間氣體的裝置(例如吸管)，因此可以從遠程位置實時取樣頂部空間氣體。這樣的收集方法可特別適合于在患有中耳炎的患者或燒傷患者中、從排泄物中監(jiān)測2-AA并診斷銅綠假單胞菌感染，而無需去除樣品。所述裝置又還可以包括用于維持氣體樣品與報道細胞接觸而氣體不會散失或稀釋至周圍空氣的容器。當測試氣體樣品時，所述樣品可以是來自人、動物或其它來源的頂部空間氣體，并且可以是，但不限于：氣體樣品，諸如呼吸空氣，或來自以下的頂部空間氣體：汗液、唾液、痰液、血液、血漿、尿液、乳汁(乳腺分泌物)、胸膜液、腦脊液、腦膜液、羊水、淋巴液、腺分泌物、精液、膿液、排泄物、嘔吐物、眼淚、組織活檢樣品、細胞培養(yǎng)物、環(huán)境空氣、獲得自傷口或燒傷的組織樣品、獲得自鼻子、耳朵和眼睛、嘴巴、陰道、傷口、燒傷或疑似具有感染的任何其它組織的拭子、痰和粘液。在一些實施方案中，所述裝置可用于檢測任何慢性炎癥、感染或病況中的2-AA或銅綠假單胞菌感染，以及用于檢測(醫(yī)療)儀器的污染。2-AA和銅綠假單胞菌可通過所述裝置檢測，以便檢測疾病或病理性病況，包括，但不限于慢性中耳炎(滲出性)、支持性急性中耳炎、膿腫引流物、感染的燒傷、由于支氣管炎導致的排痰性咳嗽、肺炎、鼻竇炎、犀牛鼻竇炎、感染的導管包括-機械通風管、外周和中樞線、尿?qū)Ч?、感染的褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍、乳汁和醫(yī)療裝置。特別重要的是免疫受損個體中的任何傷口、燒傷、感染或皮膚病變。在一個具體實施方案中，所述個體疑似患有中耳炎，而生物樣品是耳部滲出物、從耳部滲出物收集的頂部空間氣體或從患耳收集的頂部空間氣體的樣品。所述裝置還可用于檢測對于食品安全而言重要的產(chǎn)生LuxR樣配體的病原體，其中適當考慮所分析樣品的性質(zhì)。通常，在非氣體樣品的情況下，報道細胞應(yīng)答可能受樣品基質(zhì)(即從樣品制備生成的顆粒材料)影響。顆粒材料可以結(jié)合報道細胞，并引起從報道細胞發(fā)射的(光)信號的普遍淬滅。因此，可分析樣品以測試樣品基質(zhì)對報道細胞測定法的影響。用本發(fā)明的裝置檢測樣品中的2-AA之后，可以例如，通過培養(yǎng)疑似材料的樣品，建立對銅綠假單胞菌感染或定植(例如，醫(yī)療裝置上的生物膜中)的進一步證實。如本文中所用，術(shù)語“約”是指±10%。術(shù)語“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其變化形式是指“包括但不限于”。術(shù)語“由……組成”是指“包括并限于”。術(shù)語“基本由……組成”是指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括額外的成分、步驟和/或部分，但只有當額外成分、步驟和/或部分不實質(zhì)性改變要求保護的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新穎特征才可以。如本文中所用，單數(shù)形式“a(一)”、“an(一)”和“the(該)”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有明確說明。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在整個本申請中，本發(fā)明的各個實施方案以范圍形式提供。應(yīng)當理解的是，以范圍形式的描述僅僅是出于方便和簡明，不應(yīng)解釋為是對本發(fā)明范圍的不可變更的限制。因此，范圍的描述應(yīng)被視為已具體公開所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，范圍諸如1-6的描述應(yīng)被視為已具體公開子范圍諸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及該范圍內(nèi)的個別數(shù)，例如1、2、3、4、5和6。這無論范圍寬度如何都適用。如本文中所用，術(shù)語“方法”是指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領(lǐng)域的從業(yè)人員已知或易于由所述從業(yè)人員從已知方式、手段、技術(shù)和方法開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和方法。要理解的是，為了清楚起見在分開實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征，也可與單個實施方案組合提供。相反，為了簡明起見在單個實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征，也可以單獨提供或以任何合適的子組合或以適于任何其它描述的本發(fā)明實施方案提供。各個實施方案的上下文中描述的某些特征不應(yīng)被視為是那些實施方案的必需特征，除非實施方案無那些要素就無法實施。如上文中所述以及下面權(quán)利要求部分中要求保護的本發(fā)明的各個實施方案和方面在以下實施例中找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參考下列實施例，所述實施例與上面的描述一起以非限制性方式舉例說明本發(fā)明的一些實施方案。一般而言，本文使用的命名和本發(fā)明中利用的實驗室方法包括分子、生物化學、微生物和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻中有全面解釋。參見，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等人,(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,編(1994);Ausubel等人,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等人,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等人(編)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美國專利號4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中記載的方法;"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis,J.E.,編(1994);"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版;"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,編(1994);Stites等人(編),"BasicandClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);MishellandShiigi(編),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);可用的免疫測定法全面描述于專利和科學文獻中，參見，例如，美國專利號3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771and5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,編(1984);“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,編.(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.,andHigginsS.J.,編.(1984);"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,編(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)and"MethodsinEnzymology"Vol.1-317,AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等人,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);所有文獻都通過引用并入本文，如同全部記載于本文中一樣。其它一般參考文獻貫穿本文中提供。其中的程序被認為是本領(lǐng)域眾所周知的，并且為了讀者方便而提供。其中含有的所有信息通過引用并入本文。材料和方法生長條件使所有細菌菌株(表II)在37℃下生長于在1升蒸餾水中含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gNaCl的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)液中(除了根癌農(nóng)桿菌A136/pCF218/pMV26(其在30℃下生長)，和費氏弧菌MJ-1(其在30℃下生長于LBM(LB+2%NaCl)培養(yǎng)基中)。表II：細菌菌株和質(zhì)粒C4-HSL：N-丁酰基-高絲氨酸內(nèi)酯；3-氧代-C6-HSL：N-3-氧代-己酰基-高絲氨酸內(nèi)酯；C6-HSL：N-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯；3-氧代-C8-HSL：N-3-氧代-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯；C8-HSL：N-辛?；?高絲氨酸內(nèi)酯；3-氧代-C12-HSL：N-3-氧代-十二酰基-高絲氨酸內(nèi)酯。由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的總揮發(fā)物對細胞密度感應(yīng)報道菌株的影響。對于銅綠假單胞菌揮發(fā)物對各種細胞密度感應(yīng)(QS)響應(yīng)調(diào)節(jié)物的影響的檢查，在雙向Petri皿的兩個單獨隔室中用不同的QS-報道菌株(表I)接種銅綠假單胞菌PAO1。這樣的隔室接種設(shè)備僅使得能夠在銅綠假單胞菌培養(yǎng)物和被檢查的報道菌株之間交換揮發(fā)物。對于評估銅綠假單胞菌的揮發(fā)物對QS響應(yīng)調(diào)節(jié)物的可能的拮抗作用/協(xié)同作用的測定法，將暴露于銅綠假單胞菌的揮發(fā)物的報道菌株用其相關(guān)的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)信號傳導分子(CaymanChemicalCompany,AnnArbor,MI,USA)接種。在這些實驗中，以1μM的濃度添加1μlN-3-氧代-十二?；?高絲氨酸內(nèi)酯(3-氧代-C12-HSL)和N-3-氧代-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯(3-氧代-C6-HSL)，并且以100μM的濃度添加1μlN-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)和N-辛酰基-高絲氨酸內(nèi)酯(C8-HSL)。對于檢查銅綠假單胞菌揮發(fā)物的激動劑活性的測定法，兩種菌株均在不添加任何外源性AHL的情況下進行溫育。過夜溫育之后，從瓊脂刮下報道菌株的菌落，將其再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；0.1MpH=7.4；10.9gl-1的Na2HPO4,3.2gl-1的NaH2PO4和9gl-1的NaCl)中，并且在96孔板中使用infinite-F200讀板器(TecanTradingAG,Switzerland)測量發(fā)光。相對發(fā)光以發(fā)光除以光密度計算。用465nm的激發(fā)波長和535nm的發(fā)射波長測量新洋蔥伯克霍爾德氏菌H111-I/pAS-C8產(chǎn)生的相對綠色熒光?；蛘撸陔p向petri皿的兩個單獨隔室中用幾種報道菌株接種銅綠假單胞菌PA14。過夜溫育之后，如上所述分析報道菌株的培養(yǎng)物的發(fā)光產(chǎn)生。揮發(fā)物概況分析用500μlDDW一式三份稀釋500μl具有PAO1或PAO1ΔlasR的培養(yǎng)基。將5μl1ppm芐基丙酮/MeOH作為內(nèi)部標準品添加至0.33μM或5ppb的最終濃度。使用1x10mmPDMS-涂覆的Twister棒(GerstelGmbH,MülheimanderRuhr,Germany)實施攪拌棒吸附提取8小時。擦去Twisters，并用DDW沖洗并經(jīng)受與程序化溫度汽化(PTV)注射器偶聯(lián)的熱脫附(TDU-CIS-4,Gerstel)。在具有40mlmin-1He流速和20℃至170℃的60℃min-1的溫度梯度且保持5分鐘的TDU未分條件下實施解吸。PTV入口裝有石英棉襯墊(Gerstel)，并在解吸過程中保持在-20℃以下，隨后是12℃sec-1的溫度梯度，最高達250℃，保持10分鐘。與5375質(zhì)譜儀(MS)(Agilenttechnologies,SantaClara,CA)偶聯(lián)且裝有Rxi-XLB30x0.25x0.25柱(Restek,Bellafonte,PA)的7890氣相色譜儀(GC)用于運行分析。GC烘箱溫度梯度為40℃持續(xù)3分鐘，然后15℃min-1至280℃，持續(xù)5分鐘。MS在陽性EI掃描(40-400amu)模式、70eV能量下操作。獲得的色譜圖用Chemstation軟件(Agilent)分析，并將質(zhì)譜與Wiley9/NIST08組合質(zhì)譜文庫(WileyandSons,Hoboken,NJ)和/或NIST11(NIST,Gaitersburg,MD)進行比較。用商業(yè)標準品(Sigma)針對光譜和保留時間驗證2-氨基苯乙酮(2-AA)和芐基丙酮的身份。在Chemstation中使用chemstation積分器實施積分。將曲線下面積(AUC)針對內(nèi)部標準品的AUC進行標準化。2-氨基苯乙酮對特定QS-報道菌株的影響將2-AA應(yīng)用于各種報道菌株，以便評估其是否可以抑制或活化不同的QS響應(yīng)調(diào)節(jié)物。使報道菌株在30℃下在含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基中生長過夜，然后洗滌，并用新鮮LB培養(yǎng)基1:100稀釋，獲得約107個細胞ml-1的濃度。在四次重復(fù)中，將每孔100μl培養(yǎng)物添加至96孔板(CorningInc.,NY,USA.目錄號356701)。通過將2-AA與特定AHL一起添加至報道菌株培養(yǎng)物而準備拮抗/協(xié)同活性的測定。通過將2-AA添加至報道菌株、不添加任何AHL而進行激動作用測定。陰性對照缺乏2-AA和AHL，而陽性對照僅含有各種濃度的相應(yīng)AHL。以1、10、25、50、100和500μM的濃度添加2-AA用于激動作用和拮抗作用/協(xié)同作用測定。以1、10、25、50、100和500μM的濃度添加C4-HSL、C8-HSL和3-氧代-C12-HSL用于陽性對照，而以1、10、25、50和500nM添加3-氧代-C6-HSL。對于拮抗作用/協(xié)同作用測定，以10μM的濃度添加C4-HSL、C8-HSL和3-氧代-C12-HSL，而以10nM添加3-氧代-C6-HSL。將2-AA直接添加至報道菌株的培養(yǎng)物，然后將其分至96孔板的各孔，而將一微升溶解于乙腈中的不同濃度的各種AHL置于孔中，半小時后，添加培養(yǎng)物，以允許乙腈蒸發(fā)。然后將板內(nèi)的細菌在37℃下溫育24小時，而在30℃下溫育根癌農(nóng)桿菌A136/pCF218/pMV26。溫育期間，以30分鐘間隔使用infinite-F200讀板器(TecanTradingAG,Switzerland)測量由報道菌株產(chǎn)生的光密度(ODλ=600nm)和發(fā)光或熒光。如下檢查2-AA在其揮發(fā)物狀態(tài)的影響：簡而言之，將10nmol2-AA和100μl過夜溫育的報道菌株添加至雙向Petri皿的2個相對側(cè)?；蛘?，在揮發(fā)物測定中檢查1μg2-AA的LuxR活化。將一微升1μg/μl濃度的2-AA置于petri皿的蓋片上的空白盤(Oxoid,UK)上。將二十微升的大腸桿菌/pSB401的過夜生長的培養(yǎng)物接種于petri皿的第二部分上。將皿密封，并在37℃下的靜態(tài)條件下溫育過夜。過夜溫育之后，從瓊脂板刮下報道菌株的菌落，將菌落重懸浮，分份入96孔板，并如上所述測量相對發(fā)光。2-氨基苯乙酮對費氏弧菌的LuxR調(diào)節(jié)的發(fā)光的影響。將2-氨基苯乙酮(2-Acetoaminophenone)添加至費氏弧菌，以便驗證2-AA對攜帶LuxR的野生型菌株中的QS調(diào)節(jié)的性狀的活性。如下制備實驗的起始物：每次實驗前，將來自甘油儲備物的培養(yǎng)物接種于LBM培養(yǎng)基中，并在30℃下溫育過夜，然后1:1000稀釋，并再次溫育過夜。然后將培養(yǎng)物洗滌并1:1000稀釋，然后添加25、50或100μM的2-AA，或10nM的3-氧代-C6-HSL。如上所述測量96孔板中溫育的MJ-1培養(yǎng)物的發(fā)光和吸光度。應(yīng)提及，在實驗的兩次重復(fù)中，在添加AHL或添加2-AA后沒有測量到發(fā)光(數(shù)據(jù)未顯示)。2-AA類似物對LuxR的影響針對大腸桿菌/pSB401和大腸桿菌JLD271/pAL103測試2-AA的七種類似物，以評估2-AA的哪些化學基團參與配體-受體相互作用。測試了下列化合物：4-氨基苯乙酮、3-氨基苯乙酮、氨基苯乙酮、2-硝基苯乙酮、鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸和2-氨基苯甲醛(Sigma,St.Louis,USA)。如對于2-AA所述，以1-50μM的濃度將所述化合物應(yīng)用于報道菌株。12小時后在讀板器中測量發(fā)光。多序列比對使用T-Coffee(參見wwwdottcoffeedotvital-itdotchappstcoffeeindex)對TraR(PDB代碼:1L3L)、LasR(PDB代碼:2UVO)、SdiA(PDB代碼:2AVX)和LuxR(Uniprot進入:P12746)進行多序列分析(MSA)。此外，將下列物種的LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物的部分與費氏弧菌的LuxR(登錄號CAA68561.1)(SEQIDNO:1)進行比對：火神弧菌(AAQ90213.1)(SEQIDNO:2)、擬態(tài)弧菌(Vibriomimicus)(AAQ90214.1)(SEQIDNO:3)、鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathi)(AAQ90227.1)(SEQIDNO:4)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)(AAQ90194.1)(SEQIDNO:5)。同源模型構(gòu)建使用T-Coffee算法將LuxR(SEQIDNO:6)(Uniprot進入:P12746)與TraR(PDB代碼:1L3L)進行比對。使用如DiscoveryStudio4.0(DS4.0,Accelrys)中執(zhí)行的Modeller方案(1)生成LuxR的模型。生成二十種模型，并且使用蛋白報道工具(DS4.0)評價模型質(zhì)量，并且選擇具有最佳得分的模型用于進一步細化，其包括最小化。使用默認方案設(shè)置。在模型中識別結(jié)合位點使用DS4.0中的'定義結(jié)合位點'方案定義結(jié)合位點。該方案是基于'橡皮擦和泛洪填充網(wǎng)格算法'，其中基于受體的形狀識別結(jié)合位點。最佳得分位點被確定為生成模型的結(jié)合位點。使用默認算法設(shè)置。配體對接使用‘制備配體’方案制備配體，且使用‘生成構(gòu)象’方案生成構(gòu)象，兩者均在DS4.0中執(zhí)行。使用CDocker方案(DS4.0)進行配體的對接。使用默認方案設(shè)置。對表現(xiàn)出外耳炎癥狀的患者的膿液樣品的分析分析獲得自患有外耳炎的7名患者(2-80歲)的膿液樣品。在每個樣品中，通過三種單獨的方法檢查銅綠假單胞菌的存在：(i)樣品的一部分用于常規(guī)培養(yǎng)拭子測定；(ii)樣品的第二部分經(jīng)受使用GC的動態(tài)頂部空間分析用于2-AA檢測。對于動態(tài)頂部空間分析，將膿液懸浮于標準鹽水溶液(0.9％NaCl)中，并置于20mm頂部空間小瓶中。將頂部空間小瓶搖動并在60℃下溫育10分鐘。使用500ml氦氣以20ml/min將頂部空間連續(xù)收集至TenaxTA管，持續(xù)1小時。將Tenax管在熱解吸單元(GerstelTDU)中在210℃下以未分模式解吸4分鐘，隨后將蒸氣捕獲于PTV注射器(GerstelCIS4)中，所述PTV注射器保持在-70℃下。解吸完成之后，將PTV以12℃/sec加熱至300℃，并在那里保持4分鐘。GC色譜柱為RestekRxi-XLB中等極性柱，30X0.250X25。He流速為1.1ml/min，烘箱程序為40℃持續(xù)3分鐘，然后12.5℃/min至300℃，持續(xù)3分鐘。對于質(zhì)量92.0；120.0；135.0，以SIM模式(選擇性離子監(jiān)測)進行質(zhì)譜獲?。?iii)對于2-AA針對LuxR應(yīng)答調(diào)節(jié)物的活性，用大腸桿菌/pSB401報道菌株檢查了樣品的第三部分。對于LuxR活化測定，將膿液樣品轉(zhuǎn)移至無菌1.5ml離心管。將二十微升大腸桿菌/pSB401報道菌株的過夜生長培養(yǎng)物置于250μl瓊脂上，所述瓊脂在離心管帽的內(nèi)部部分凝固。然后將管密封，并在37℃下的靜態(tài)條件下溫育過夜。膿液樣品和報道菌株之間沒有接觸，并且活化僅通過膿液發(fā)出的揮發(fā)物而發(fā)生。溫育后，將報道菌株的菌落轉(zhuǎn)移至96孔板中的100ulPBS中。在讀板器中測量懸浮菌落的發(fā)光和吸光度。結(jié)果銅綠假單胞菌的揮發(fā)物對基于發(fā)光的QS報道菌株的影響。在雙向Petri皿的兩個單獨隔室中用幾種報道菌株接種銅綠假單胞菌PA14。測試和報道菌株的此類隔室接種使得能夠僅在它們之間交換揮發(fā)物。在大腸桿菌/pSB401(報道菌株)中檢測到發(fā)光的顯著誘導(圖1)，表明銅綠假單胞菌的揮發(fā)性物質(zhì)可誘導細胞密度感應(yīng)(QS)細胞至細胞通訊調(diào)節(jié)途徑，據(jù)推測是由C6-和C8-高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)信號分子介導的那些。在另一系列的實驗中，為了識別可以充當QS激動劑或拮抗劑的潛在揮發(fā)性物質(zhì)，使用雙向Petri皿觀察了由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的總揮發(fā)物對幾種QS生物報道者的影響，所述雙向Petri皿具有獨立隔間、但具有聯(lián)合頂部空間，其僅允許交換揮發(fā)性物質(zhì)。本研究中使用的生物報道者對碳鏈長度范圍為四至12個碳的各種?；呓z氨酸內(nèi)酯(“AHL”或“HSL”)分子響應(yīng)。這些分子是革蘭氏陰性細菌用于通訊的最常見的QS信號傳導分子。表I中匯總了本研究中所用的報道菌株及其指定的響應(yīng)調(diào)節(jié)物。銅綠假單胞菌PAO1菌株的揮發(fā)物在大腸桿菌/pSB401報道菌株中顯著誘導陽性發(fā)光響應(yīng)，其由費氏弧菌LuxR應(yīng)答調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)(P<0.05；Ranks的ANOVA和Student–Newman–Keuls事后檢驗)(圖2)。此外，銅綠假單胞菌的揮發(fā)物的影響對于由1pmolN-3-氧代-己?；?高絲氨酸內(nèi)酯(3-氧代-C6-HSL)獲得的誘導是協(xié)同的(圖2)。值得注意的是，銅綠假單胞菌的揮發(fā)物沒有影響任何其它被檢查的響應(yīng)調(diào)節(jié)物(數(shù)據(jù)未顯示)，也沒有充當LuxR的拮抗劑(圖2)，表明來自銅綠假單胞菌的總揮發(fā)物的某些化合物可以特異性活化LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物。銅綠假單胞菌具有對于其在宿主內(nèi)的完全毒力和持久性至關(guān)重要的三種不同的QS系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)las和rhl分別由N-3-氧代-十二酰基-高絲氨酸內(nèi)酯和N-丁?；?高絲氨酸內(nèi)酯活化。第三種系統(tǒng)mvfR由喹諾酮類信號4-羥基-2-庚基喹諾酮(heptylequinolone)和假單胞菌喹諾酮信號(PQS)活化?？傮w而言，超過10％的銅綠假單胞菌基因組處于QS的調(diào)節(jié)下。為了確定QS突變體是否可以維持其活化LuxR報道菌株的能力，測試了具有LasR響應(yīng)調(diào)節(jié)物產(chǎn)生缺陷的ΔlasR突變體的響應(yīng)。選擇該突變體是因為銅綠假單胞菌的三種QS系統(tǒng)是分層組織的，使得lasQS系統(tǒng)相比于rhl和PQS占主導地位的。與WT菌株相反，ΔlasR突變體的總揮發(fā)物沒有活化LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物(數(shù)據(jù)未顯示)。為了識別負責銅綠假單胞菌活化LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物的揮發(fā)性物質(zhì)，進行了ΔlasR和WT菌株的比較氣相色譜質(zhì)譜(GC/MS)分析。如圖3A和3B中所見，在lasR突變的揮發(fā)物概況中缺失的主要揮發(fā)物是2-氨基苯乙酮(2-AA)。2-AA對基于發(fā)光的QS報道菌株的影響2-AA在銅綠假單胞菌的揮發(fā)物概況中是主要的。為了確定QS-調(diào)節(jié)的發(fā)光的誘導是否由2-AA特異性引起，在添加2-AA(50μM)后測量各種QS-報道菌株的發(fā)光。結(jié)果顯示，主要對C6-HSL敏感的大腸桿菌/pSB401報道者，在暴露于2-AA后表現(xiàn)出對發(fā)光的顯著的兩個數(shù)量級的誘導(圖4)。在另一個系列的實驗中，將作為揮發(fā)物或呈溶解狀態(tài)的不同濃度的合成2-AA添加至大腸桿菌/pSB401和大腸桿菌JLD271/pAL103報道菌株的培養(yǎng)物。當作為液體(圖5A和5B)和作為揮發(fā)物(數(shù)據(jù)未顯示)應(yīng)用時，2-AA能夠顯著誘導報道菌株的LuxR調(diào)節(jié)的發(fā)光(p<0.05；分別為ANOVA和Dennett事后檢驗和student氏t檢驗)。類似于銅綠假單胞菌的總揮發(fā)物的影響，相比于10nMAHL而無2-AA測量的值，將2-AA添加至用固定濃度的AHL(10nM)接種的生物傳感器進一步誘導了LuxR調(diào)節(jié)的發(fā)光(圖5A和5B，綠色條)。然而，相比于大腸桿菌JLD271/pAL103生物傳感器(100和500μm)，對大腸桿菌/pSB401生物傳感器(25-500μm)具有協(xié)同作用的濃度范圍存在差異。為了驗證觀察到的由存在的2-AA經(jīng)由LuxR活化對發(fā)光的誘導，將2-AA應(yīng)用于大腸桿菌JLD271/pAL104報道菌株，其攜帶與pAL103相同的質(zhì)粒，但缺乏編碼LuxR的基因。觀察到2-AA對LuxR陰性報道者沒有影響，表明確實2-AA與LuxR受體直接相互作用(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管銅綠假單胞菌的揮發(fā)物僅活化LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物，但研究了合成的2-AA化合物與上述其它生物報道菌株可能的交叉反應(yīng)。類似于用銅綠假單胞菌的總揮發(fā)物獲得的結(jié)果，2-AA沒有誘導銅綠假單胞菌同源QS受體、RhlR和LasR的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。50和100μM2-AA在存在AHL的情況下輕微抑制(分別為20%和16％)RhlR調(diào)節(jié)的發(fā)光，然而，2-AA在不存在AHL的情況下也將發(fā)光輕微抑制至相同水平(20％)，說明該抑制不是經(jīng)由配體響應(yīng)調(diào)節(jié)物相互作用。500μM2-AA針對LasR-和RhlR調(diào)節(jié)的發(fā)光表現(xiàn)出更顯著的抑制(減少40％)。根據(jù)O.D.測量，觀察到的發(fā)光減少不是由于生長抑制。因此，盡管極高濃度(500μM)的2-AA直接抑制LasR和RhlR是可行的，但這樣的濃度是非生理性高的，并且可能是生物學無關(guān)的。值得注意的是，對于在本研究中檢查的任何其它響應(yīng)調(diào)節(jié)物(即TraR、SdiA、CepR、AhyR和AhlR)，2-AA沒有表現(xiàn)出任何顯著的活化(數(shù)據(jù)未顯示)。上述結(jié)果顯示，2-AA可以在基于大腸桿菌的生物傳感器菌株中活化luxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物。為了充分評估該發(fā)現(xiàn)的生物學意義，檢查2AA對野生型費氏弧菌MJ-1的LuxR調(diào)節(jié)的自然發(fā)光的活性。在未添加外源HSL的情況下，野生型費氏弧菌MJ-1表現(xiàn)出相對低水平的發(fā)光。盡管如此，添加10nM3-氧代-C6-HSL導致發(fā)光的顯著增加(圖6)。顯著地，將2-AA添加至野生型費氏弧菌MJ-1也以劑量依賴的方式顯著增加發(fā)光，類似于攜帶LuxR的報道菌株的活化。當將2-AA作為揮發(fā)物以1μg添加至雙向Petri(對側(cè)接種大腸桿菌/pSB401)時，也獲得對發(fā)光的誘導(圖7)。在這些實驗中使用的2-AA的濃度與銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物中的2-AA的濃度(5μg/ml;37μM)是一致的。值得注意的是，2-AA的添加對PAO-JP2/pKD201菌株(對C12-HSL敏感)(圖8)和銅綠假單胞菌/RhlA受體(對C4-HSL敏感)(圖9)的發(fā)光沒有影響。這些結(jié)果表明，2-AA可以特異性模擬HSL的C6和C8鏈。2-AA的結(jié)構(gòu)分析和生物信息學對接AHL(也稱為HSL)和2-AA在結(jié)構(gòu)上相當不同，因此，AHL-結(jié)合LuxR和2-AA之間的相互作用的性質(zhì)不清楚。為了更好地理解2-AA與AHL結(jié)合受體的表觀特異性和相互作用，檢查了幾種2-AA類似物(4-氨基苯乙酮、3-氨基苯乙酮、苯乙酮、2-硝基苯乙酮、鄰氨基苯甲酸甲酯、鄰氨基苯甲酸和2-氨基苯甲醛)對大腸桿菌/pSB401報道菌株的發(fā)光的影響(圖10)。這些類似物或者在交替位置具有其胺基，或者在酮基具有取代。第三和第四位置的胺基的缺失或移位以及用羧酸、酯或醛取代酮基完全消除了報道菌株表現(xiàn)出的對發(fā)光的誘導(P<0.05；ANOVA和Student–Newman–Keuls事后檢驗)(圖10)。相比于2-AA，用硝基取代胺基部分減少LuxR活化，表明2-硝基苯乙酮也可活化LuxR，但程度低于2-AA。顯著地，在存在AHL的情況下，用2-硝基苯乙酮沒有觀察到劑量依賴性或協(xié)同作用。此外，無一類似物(除了2-硝基苯乙酮)在不存在外源AHL的情況下表現(xiàn)出顯著誘導活性，或在存在AHL(HSL)的情況下表現(xiàn)出協(xié)同/拮抗活性(數(shù)據(jù)未顯示)。不希望限于單一假設(shè)，這些結(jié)果表明，酮基的存在和胺基的位置是LuxR-2-AA相互作用和活化的關(guān)鍵因素。為了進一步研究LuxR與2-AA的相互作用，將2-AA和LuxR的同源配體3-氧代-C6-HSL對接至LuxR模型進行生物信息學分析。對接的2-AA和3-氧代-C6-HSL的重疊揭示了2-AA環(huán)和LuxR的結(jié)合口袋內(nèi)的3-氧代-C6-HSL的環(huán)的類似位置(數(shù)據(jù)未顯示)。在不希望限于單一假設(shè)的同時，AHL對接的結(jié)果表明，Trp66、Asp79和Tyr70是通過經(jīng)由氫鍵與AHL相互作用的AHL-LuxR相互作用中的關(guān)鍵殘基(圖11A)。除了這些相互作用以外，與Pro48、Met51、Ile56、Ile76和Val82的疏水性相互作用可以起到穩(wěn)定碳鏈的作用。將2-AA對接至LuxR模型中表明參與3-氧代-C6-HSL相互作用的一些LuxR保守殘基(Trp66、Tyr70和Asp79)也在2-AA(藍色)和受體之間的相互作用中發(fā)揮作用(圖11B)。一種可能性是，Tyr70和Asp79可以與胺基形成氫鍵，Trp66可以與羰基形成氫鍵。此外，表明Tyr62、Leu118、Ala139、Ile46、Ile81參與疏水性相互作用。形成疏水性相互作用的所有五個殘基的組合在不同的QS受體結(jié)合位點間不是保守的，并且相比于SdiA、LasR和TraR對于LuxR是獨特的(數(shù)據(jù)未顯示)，與2-AA對于LuxR的特異性一致。總而言之，本文提供的結(jié)果表明，2-AA，由銅綠假單胞菌以相對高量(高達80μM)產(chǎn)生且疑似在病原體的持續(xù)及其與宿主的相互作用中重要的低分子量揮發(fā)性化合物是LuxR響應(yīng)調(diào)節(jié)物的特異性活化劑。如從圖4至9顯而易見的是，3-氧代-C6-HSL對于LuxR的親和力比2-AA對于LuxR的親和力高約三個數(shù)量級。盡管如此，不同親和力的生理相關(guān)性可在于兩種揮發(fā)物的生理濃度的差異：弧菌屬的細菌培養(yǎng)物中測量的3-氧代-C6-HSL的濃度在1至10nM之間變化，而銅綠假單胞菌培養(yǎng)物中的2-AA濃度達到80μM。2-AA不活化銅綠假單胞菌的QS受體。在不希望限于單一假設(shè)的同時，可以想到的是，2-AA可能充當物種間信號，活化其它細菌中的QS系統(tǒng)。在棲息于人體至海洋沉積物的各種環(huán)境的若干種細菌物種的總揮發(fā)物中已檢測到2-AA。來自其它細菌物種的LuxR同源物的BLAST分析揭示，除了費氏弧菌以外的幾種細菌物種，諸如火神弧菌、擬態(tài)弧菌、鰒發(fā)光桿菌和副溶血性弧菌，具有高度類似的LuxR同源物，其包括據(jù)發(fā)現(xiàn)與2-AA相互作用但在非反應(yīng)性SdiA、TraR和LasR受體中缺乏的所有殘基(圖12)。2-AA的質(zhì)譜分析：出于校準目的，進行2-AA標準品的質(zhì)譜(MS)分析。TIC-總離子色譜測量(圖13A)顯示在17.567的保留時間的峰，并且所選離子監(jiān)測譜(SIM)(圖13B)顯示三種離子處于正確比率（分別對于135、120和92為70:100:50）。獲得準確2-AAMS信號特征后，對得自表現(xiàn)出嚴重外耳感染的患者的膿液進行TIC和SIM分析。同時分析了膿液樣品活化報道菌株的發(fā)光的能力，并取樣用于指示銅綠假單胞菌的存在的培養(yǎng)測試。使用兩種樣品：膿液樣品編號1(其在培養(yǎng)測試中為銅綠假單胞菌陽性)，和膿液樣品編號2(其在培養(yǎng)測試中為銅綠假單胞菌陰性)(數(shù)據(jù)未顯示)。膿液樣品編號1的TIC和SIM分析在該樣品中識別出了2-AA(圖14C)，并且報道菌株在暴露于該膿液樣品發(fā)出的揮發(fā)物后也產(chǎn)生發(fā)光信號(圖16B)。相反，TIC和SIM分析不能在膿液樣品編號2中檢測到2-AA(圖15A和15B，以及16A)。報道菌株在暴露于膿液樣品編號2發(fā)出的揮發(fā)物后也沒有產(chǎn)生發(fā)光信號(圖16B)。除了圖16A和16B中分析的樣品以外，分析來自年齡范圍為2-80歲的患者的其它五種膿液樣品。所有樣品在培養(yǎng)、TIC和生物傳感器分析中都得到陰性結(jié)果，表明這些患者沒有被銅綠假單胞菌感染。還對經(jīng)治療的馬的外部傷口進行了分析。從指屈肌腱鞘收集了兩個組織樣品。檢查了來自兩處傷口的樣品。分析它們開始治療后兩天(傷口編號1，樣品編號1)和一周(傷口編號2，樣品編號2)的樣品(在治療開始前的零時間未提供樣品)。治療開始前，兩處傷口在培養(yǎng)測定中均為銅綠假單胞菌細菌陽性。在治療結(jié)束時(10天)從傷口取出的樣品在培養(yǎng)測定中為銅綠假單胞菌細菌陰性。圖17顯示樣品一(其對應(yīng)于抗生素治療2天)為2-AA陽性，而樣品編號二為2-AA陰性，其對應(yīng)于抗生素治療的完成和抗細菌作用?？偠灾?，這些結(jié)果表明，2-AA可以充當例如外耳(外耳炎)的銅綠假單胞菌感染的準確生物標志物，并且表達融合至報道基因的luxR受體的細菌報道菌株可用作檢測銅綠假單胞菌感染的簡單、準確和靈敏的診斷工具。盡管本發(fā)明已結(jié)合其具體實施方案進行描述，但明顯的是，許多替代、修改和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，其意在包括落入所附權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這樣的替代、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利、專利申請在本文都通過引用全部并入本說明書中，其程度如同每個單獨出版物、專利、專利申請具體而單獨指明通過引用并入本文中一樣。此外，本申請中對任何參考文獻的引用或鑒定不應(yīng)當解釋為承認這樣的參考文獻可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)獲得。在使用的節(jié)段標題的程度上，它們不應(yīng)解釋為必然限制性的。序列表<110>YissumResearchDevelopmentCompanyoftheHebrewUniversityofJerusalemLtd.YedaResearchandDevelopmentCo.Ltd.HELMAN,YaelSOBEL,NoamSHUSHAN,SagitKVIATKOVSKI,IgorFRUMIN,IdanCHERNIN,LeonidSECUNDO,Lavi<120>用于檢測銅綠假單胞菌的方法和裝置<130>61656<150>61/947,080<151>2014-03-03<160>46<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>158<212>PRT<213>費氏弧菌<400>1MetLysAsnIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysAlaCysArgAlaTyrAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMetThr202530LysMetValHisCysGluTyrTyrLeuThrLeuAlaIleIleTyrPro354045HisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIle145150155<210>2<211>158<212>PRT<213>火神弧菌<400>2MetLysAspIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysAlaCysArgSerAsnAsnAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMet202530ThrLysMetValHisCysGluTyrTyrLeuLeuAlaIleIleTyrPro354045HisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIle145150155<210>3<211>158<212>PRT<213>擬態(tài)弧菌<400>3MetLysAspIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysAlaCysArgSerAsnAsnAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMet202530ThrLysMetValHisCysGluTyrTyrLeuLeuAlaIleIleTyrPro354045HisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIle145150155<210>4<211>158<212>PRT<213>鰒發(fā)光桿菌<400>4MetLysAspIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysAlaCysArgSerAsnAsnAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMet202530ThrLysMetValHisCysGluTyrTyrLeuLeuAlaIleIleTyrPro354045HisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIle145150155<210>5<211>158<212>PRT<213>副溶血性弧菌<400>5MetLysAspIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysArgCysArgSerAsnLysAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMet202530ThrLysMetValHisCysGluTyrTyrLeuLeuAlaIleIleTyrPro354045HisCysMetValLysSerAspIleSerIleValAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysSerSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuGlnAlaCysMetAsnIle145150155<210>6<211>250<212>PRT<213>費氏弧菌<400>6MetLysAsnIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsnLysIle151015LysAlaCysArgAlaTyrAspIleAsnGlnCysLeuSerAspMetThr202530LysMetValHisCysGluTyrTyrLeuThrLeuAlaIleIleTyrPro354045HisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyrProLys505560LysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyrAspPro65707580IleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrpAsnIle859095PheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIleLysGlu100105110AlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIleHisThr115120125AlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGluLysAsp130135140AsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIleProLeu145150155160IleValProSerLeuValAspAsnTyrArgLysIleAsnIleAlaAsn165170175AsnLysSerAsnAsnAspLeuThrLysArgGluLysGluCysLeuAla180185190TrpAlaCysGluGlyLysSerSerTrpAspIleSerLysIleLeuGly195200205CysSerGluArgThrValThrPheHisLeuThrAsnAlaGlnMetLys210215220LeuAsnThrThrAsnArgCysGlnSerIleSerLysAlaIleLeuThr225230235240GlyAlaIleAspCysProTyrPheLysAsn245250<210>7<211>232<212>PRT<213>火神弧菌<400>7MetGlyMetLysAspIleAsnAlaAspAspThrTyrArgIleIleAsn151015LysIleLysAlaCysArgSerAsnAsnAspIleAsnGlnCysLeuSer202530AspMetThrLysMetValHisCysGluTyrTyrLeuLeuAlaIleIle354045TyrProHisSerMetValLysSerAspIleSerIleLeuAspAsnTyr505560ProLysLysTrpArgGlnTyrTyrAspAspAlaAsnLeuIleLysTyr65707580AspProIleValAspTyrSerAsnSerAsnHisSerProIleAsnTrp859095AsnIlePheGluAsnAsnAlaValAsnLysLysSerProAsnValIle100105110LysGluAlaLysThrSerGlyLeuIleThrGlyPheSerPheProIle115120125HisThrAlaAsnAsnGlyPheGlyMetLeuSerPheAlaHisSerGlu130135140LysAspAsnTyrIleAspSerLeuPheLeuHisAlaCysMetAsnIle145150155160ProLeuIleValProSerLeuValAspAsnTyrArgLysIleAsnIle165170175AlaAsnAsnLysSerAsnAsnAspLeuThrLysArgGluLysGluCys180185190LeuA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