本發(fā)明涉及d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

d-色氨酸(d-tryptophan，d-trp)是一種淺褐色的晶體，分子式是c11h12n2o2，分子量204.23g/mol，熔點(diǎn)是282-285℃。d-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是臨床常見的多重耐藥菌，除了頑強(qiáng)的耐藥性，銅綠假單胞菌自身還能產(chǎn)生產(chǎn)生多種毒力因子，包括綠膿菌素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、凝集素等，對患者有明顯的毒副作用。其中彈性蛋白酶主要由基因lasb編碼合成，其毒性作用主要體現(xiàn)在降解免疫系統(tǒng)中的蛋白成分物質(zhì)，包括補(bǔ)體c3、激肽原、抗菌肽、細(xì)胞因子、免疫球蛋白、表面活性蛋白、蛋白多糖、細(xì)菌鞭毛蛋白等，大大破壞機(jī)體的免疫機(jī)制；能損傷組織細(xì)胞，抑制纖維母細(xì)胞的生長，導(dǎo)致pa的感染患者慢性潰瘍的產(chǎn)生；可通過降解調(diào)理素來抵抗表面活性蛋白-a介導(dǎo)的自噬作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一，是提供d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。

發(fā)明的申請人經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，d-色氨酸對銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。由此可見，d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

本發(fā)明的目的之二，是提供一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物。d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且安全性高，應(yīng)用人群廣。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

采用上述進(jìn)一步的有益效果是：將d-色氨酸制成更多劑型，并應(yīng)用在醫(yī)用材料上，能更廣泛的發(fā)揮d-色氨酸抑制銅綠假單胞菌感染后彈性蛋白酶的產(chǎn)生，減少銅綠假單胞菌的毒性作用，為銅綠假單胞菌感染更優(yōu)選的治療方法。

本發(fā)明的有益效果是：

1.d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用。

2.d-色氨酸對銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。

3.d-色氨酸可作為一種抗菌輔劑起效劑量小，安全性高。

4.d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應(yīng)用人群廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明d-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1產(chǎn)彈性蛋白酶的影響。

圖3是彈性蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

圖4是本發(fā)明d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1中l(wèi)asb基因表達(dá)的影響。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

將-80℃保存的銅綠假單胞菌pao1劃板接種至lb固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。挑取約1mm²的單克隆菌落至lb液體培養(yǎng)基中，200r/min，37℃培養(yǎng)6-8h。用新鮮ptsb液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨50g、tsb培養(yǎng)基2.5g，加超純水定容至1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4，121℃高溫滅菌30min),將d-色氨酸溶至10mm，再用培養(yǎng)基依次稀釋。將含不同濃度的d-色氨酸10、5、1、0.1、0mm的lb培養(yǎng)基分別取2ml于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2μl0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊你~綠假單胞菌pao1菌液，各濃度做3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24h。吸取待測菌液，4℃、12000rpm離心5min，吸取200μl上清液于新的ep管，加入800μl彈性蛋白酶反應(yīng)緩沖液(tris-hcl0.1m，cacl21mm)及2mg剛果紅底物。30℃振蕩培養(yǎng)24h后離心去除多余的剛果紅底物，取200μl液體測od495。按上述操作進(jìn)行彈性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線的測定(圖3)，經(jīng)濃度換算后，d-色氨酸對銅綠假單胞菌pao1產(chǎn)彈性蛋白酶的影響見圖2，d-色氨酸濃度為5mm時的pao1產(chǎn)彈性蛋白酶的抑制率>20％，d-色氨酸濃度為10mm時的抑制率>23％。

實(shí)施例2

將銅綠假單胞菌pao1按實(shí)施例1中步驟培養(yǎng)，收集菌液后離心，所得沉淀按照rneasyminikit提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各組的rna，測定各組rna濃度后，按體系配比(20μl體系：primescriptrtmastermix4μl、cdna1μg、超純水添至20μl)進(jìn)行cdna逆轉(zhuǎn)錄。經(jīng)普通pcr驗(yàn)證cdna能擴(kuò)增彈性蛋白酶編碼基因lasb(具體序列見表1)，下一步進(jìn)行熒光定量pcr。配制20μl體系包括：premixextorqⅱ10μl，上下游引物各0.8μl，cdna稀釋10倍后取2μl，超純水6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃5s，(95℃5s，61℃30s，72℃20s)×40個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用管家基因rpsl的量歸一化后再進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)d-色氨酸能下調(diào)銅綠假單胞菌中彈性蛋白酶編碼基因lasb及其上游控制基因lasi和lasr的表達(dá)。

表1pcr相關(guān)引物匯總表

由此可見，d-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌綠膿菌素及彈性蛋白酶的產(chǎn)生。

實(shí)施例3

一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。