本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及芪類(lèi)化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用，具體涉及白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類(lèi)化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素的廣泛使用導(dǎo)致越來(lái)越多的致病菌產(chǎn)生了耐藥性，因此，急需開(kāi)發(fā)新的抗生素和建立新的治療模式。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，很多病原菌的致病性是由一種密度依賴(lài)的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum Sensing，QS)調(diào)控，群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)介導(dǎo)致病基因的表達(dá)，調(diào)控病原菌生物被膜(biofilm)的形成，對(duì)其致病性進(jìn)行調(diào)控。高效的群體感應(yīng)抑制劑(QSI)有望實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌致病性和生物被膜的控制。

最早發(fā)現(xiàn)的具有QS抑制活性的天然產(chǎn)物是從紅藻中分離得到的溴化呋喃酮，它能夠抑制銅綠假單胞菌等細(xì)菌的QS活性，大幅降低細(xì)菌生物膜對(duì)抗生素的抗性(Gram,L.,et al.Applied and environmental microbiology,1996.62(11):4284-4287)。從葡萄和花生等食物中分離出的一種天然抗毒素白藜蘆醇，已被證明具有抗炎、抗氧化等多種活性，并能抑制奇異變形桿菌毒力因子的表達(dá)(Won-Bo Wang,et al.Journal of MedicalMicrobiology(2006),55,1313–1321)。

銅綠假單胞菌是最常見(jiàn)的與醫(yī)院感染有關(guān)的革蘭氏陰性菌，特別容易感染免疫功能不全的病人以及患有肺部疾病囊胞性纖維癥的病人。銅綠假單胞菌通過(guò)兩個(gè)AHL介導(dǎo)的QS系統(tǒng)來(lái)控制多種毒力因子的表達(dá)，包括外蛋白酶、鐵載體、外毒素和一些次級(jí)代謝物。此外，銅綠假單胞菌是一個(gè)強(qiáng)大的生物膜形成者，而生物膜的形成被認(rèn)為是一個(gè)重要的病原性特征。

芪類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的植物激素，廣泛存在于植物界中。目前，芪類(lèi)化合物的研究集中在其抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性方面，但其對(duì)銅綠假單胞菌是否具有QSI活性未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供芪類(lèi)化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用，具體是白藜蘆醇、白皮杉醇和氧化白藜蘆醇三種芪類(lèi)化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二是提供芪類(lèi)化合物在制備銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之三是提供芪類(lèi)化合物在抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制劑中的最低有效濃度，其中，白藜蘆醇的最低有效濃度為100μM，優(yōu)選為300μM以上，更優(yōu)選為400μM以上；白皮杉醇的最低有效濃度為100μM，優(yōu)選為400μM以上；氧化白藜蘆醇的最低有效濃度為10μM，優(yōu)選為400μM以上。

本發(fā)明具有以下有益效果：

三種芪類(lèi)化合物均能在不影響銅綠假單胞菌PAO1生長(zhǎng)的情況下，顯著抑制其群體感應(yīng)，其中白藜蘆醇的活性最高；濃度為100μM時(shí)，三種化合物均能很好地抑制銅綠假單胞菌PAO1的群集運(yùn)動(dòng)；當(dāng)濃度為400μM時(shí)，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產(chǎn)生，抑制率分別為59.3％、37.1％和50.2％。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中三種芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇對(duì)銅綠假單胞菌PAO1產(chǎn)綠膿菌素能力的影響結(jié)果圖。

圖2是實(shí)施例2中三種芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇對(duì)銅綠假單胞菌PAO1生長(zhǎng)的影響結(jié)果圖。

圖3是實(shí)施例3中空白對(duì)照組(a)、DMSO對(duì)照組(b)和三種芪類(lèi)化合物白藜蘆醇(c)、氧化白藜蘆醇(d)及白皮杉醇(e)對(duì)銅綠假單胞菌群集運(yùn)動(dòng)的抑制結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，其目的是為更好理解本發(fā)明的內(nèi)容，但所舉的實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

三種芪類(lèi)化合物抑制銅綠假單胞菌PAO1綠膿菌素產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)。

配制NB培養(yǎng)基滅菌備用；挑取已劃線(xiàn)培養(yǎng)好的銅綠假單胞菌PAO1單菌落到NB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；取30μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1:1000稀釋到裝有30mL NB培養(yǎng)基的錐形瓶中，同時(shí)加入不同濃度的芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，使其終濃度分別為100、200、300及400μM，等體積的DMSO作為對(duì)照組，混勻后放入搖床中，150rpm、37℃培養(yǎng)16-18h，每組重復(fù)三次；取5mL上述得到的培養(yǎng)液到10mL離心管中，8000×g離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的10mL離心管中，加入3mL三氯甲烷，充分混勻，靜置；棄去水相，加入1mL 0.2M HCl，充分混勻后8000×g離心5min，測(cè)粉紅到深紅色上層溶液的OD₅₂₀。

綠膿菌素是由銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)調(diào)控產(chǎn)生的一種重要的毒力因子，在侵襲性感染中起著重要作用。由圖1可以看出，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產(chǎn)生，且抑制效果隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。其中白藜蘆醇的抑制效果最好，氧化白藜蘆醇次之，白皮杉醇末之；在400μM時(shí)，三種化合物均能顯著地抑制綠膿菌素的產(chǎn)生，抑制率分別為59.3％、37.1％和50.2％。

實(shí)施例2

三種芪類(lèi)化合物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定。

取30μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1:1000稀釋到裝有30mL NB培養(yǎng)基的錐形瓶中，同時(shí)加入不同濃度的芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，使其終濃度為400μM，等體積的DMSO作為對(duì)照組，150rpm、37℃條件下培養(yǎng)；起始培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，取200μL各培養(yǎng)液于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)其于620nm處的吸光度；從起始培養(yǎng)開(kāi)始，每隔2h，取一次菌液測(cè)其在620nm處的吸光度，直至24h；對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

綠膿菌素產(chǎn)量的減少可能是化合物對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制引起的，也可能是化合物抑制了銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)引起的。因此，為了排除生長(zhǎng)抑制對(duì)群體感應(yīng)抑制的影響，我們測(cè)定了在400μM下三種化合物對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照相比，在400μM下，三種化合物對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。這一結(jié)果進(jìn)一步證明綠膿菌素產(chǎn)量的減少歸功于三種化合物對(duì)銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)抑制活性，而不是生長(zhǎng)抑制活性。

實(shí)施例3

三種芪類(lèi)化合物抑制銅綠假單胞菌PAO1群集運(yùn)動(dòng)(swarming)的實(shí)驗(yàn)。

配制swarming培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基8g、葡萄糖5g、瓊脂5g、蒸餾水1000mL，調(diào)PH至7.2左右)，滅菌后冷卻至50℃左右時(shí)加入不同濃度的芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇，混勻后倒入已滅菌的平板中，其中芪類(lèi)化合物白藜蘆醇、白皮杉醇及氧化白藜蘆醇為100、200、300及400μM，同時(shí)以等體積的DMSO作為溶劑對(duì)照組。待平板凝固后，取2μL PAO1的過(guò)夜菌液接種到瓊脂板的中央；37℃倒置培養(yǎng)16h后觀察結(jié)果。

銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)(swarming)受其群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。因此，測(cè)定三種化合物對(duì)銅綠假單胞菌群集運(yùn)動(dòng)的影響可以作為又一個(gè)指標(biāo)，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證三種化合物對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的影響。如圖3所示，和未加任何物質(zhì)的陰性對(duì)照組(a)和溶劑DMSO對(duì)照組(b)相比，在群集運(yùn)動(dòng)平板上，各個(gè)測(cè)定濃度的白藜蘆醇(c)、白皮杉醇(e)及氧化白藜蘆醇(d)均能顯著地抑制銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)的直徑及分叉數(shù)，展現(xiàn)出顯著的群集運(yùn)動(dòng)抑制效果。