本發(fā)明具體涉及藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

角膜病是致盲的重要原因之一，角膜上皮損傷導(dǎo)致屏障作用破壞是主要致盲角膜病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前治療角膜上皮缺損主要有局部用藥及局部保護(hù)。局部用藥包括使用含有生長(zhǎng)因子或者抗生素的滴眼液及眼用凝膠，由于自然瞬目，淚道的排出，以及角膜屏障作用，導(dǎo)致滴眼液及眼用凝膠的藥物生物利用率極低。頻繁的給藥，使得患者在依從性上難以保證。同時(shí)隨著給藥次數(shù)的增多，藥物進(jìn)入全身血流增加，可引起全身的副作用。

局部保護(hù)措施主要包括繃帶式角膜接觸鏡以及羊膜移植，但移植羊膜需要手術(shù)操作，患者的花費(fèi)較大，而且對(duì)患者的外觀及視力造成影響。角膜接觸鏡，由于透氧性能的限制，連續(xù)配戴可能引起角膜水腫，同時(shí)角膜接觸鏡會(huì)干擾其他藥物的利用率，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，可以提高眼局部用藥生物利用度，同時(shí)具有局部保護(hù)作用，并負(fù)載所需藥物的緩釋給藥系統(tǒng)是一個(gè)非常值得研究和探索的領(lǐng)域，具有廣闊前景。

左氧氟沙星作為喹諾酮類藥物中的一種，是氧氟沙星的左旋光學(xué)異構(gòu)體，具有廣譜抗菌作用，對(duì)多數(shù)的革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌活性。目前，含有諾氟沙星或氧氟沙星等喹諾酮類藥物的滴眼液，已廣泛用于治療眼部的細(xì)菌感染。

生長(zhǎng)因子在角膜損傷修復(fù)中扮演重要角色，可調(diào)節(jié)角膜上皮和基質(zhì)的增殖，并可對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行重塑。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在1987年被首次發(fā)現(xiàn)，廣泛分布由中胚層及神經(jīng)外胚層發(fā)育而來(lái)的組織中，其產(chǎn)生的機(jī)制尚不明確，但其在細(xì)胞損傷時(shí)分泌增加。在眼表組織中，bFGF的分布極為廣泛，分布在角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮，甚至也分布在房水中，對(duì)角膜細(xì)胞的增殖起著重要作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的局限，本發(fā)明的提供了一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜的制備方法及其應(yīng)用，通過(guò)放置于角膜表面，緩釋出復(fù)合膜內(nèi)藥物用于促進(jìn)角膜上皮生長(zhǎng)并預(yù)防感染。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜在角膜上皮損傷修復(fù)上的應(yīng)用。

所述的負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜與Ca²⁺離子離子交聯(lián)后用于角膜上皮損傷的修復(fù)。

一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：將海藻酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液按4-0.5∶1質(zhì)量比混合，同時(shí)加入的負(fù)載生長(zhǎng)因子溶液及左氧氟沙星溶液，攪拌6h后，使其完全混和均勻，隨后倒入培養(yǎng)皿中平鋪，烘干成膜，待復(fù)合膜干燥后，放置4℃條件下保存。

所述的海藻酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液的質(zhì)量比為0.5∶1。

所述的烘干成膜的溫度為37℃。

所述的培養(yǎng)皿直徑為5.6cm。

本發(fā)明的工作原理為：聚乙烯醇分子和海藻酸鈉分子通過(guò)氫鍵可以形成互穿網(wǎng)絡(luò)聚合物結(jié)構(gòu)，由于氫鍵的作用力相對(duì)較弱，水分子進(jìn)入時(shí)可以將氫鍵撐斷，從而使得復(fù)合膜發(fā)生水解。海藻酸鈉分子由M片段和G片段組成，其中G片段可以和多價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合，形成蛋盒模型，這種結(jié)構(gòu)可有效提高復(fù)合膜的穩(wěn)定性。因此，制備出的復(fù)合膜需與氯化鈣溶液交聯(lián)，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性。海藻酸鈉與鈣離子的交聯(lián)是離子交聯(lián)中的一種，二價(jià)以上的金屬陽(yáng)離子如Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺等極易與海藻酸古羅糖醛酸上的羧基發(fā)生靜電相互作用，但此過(guò)程是可逆的，二價(jià)離子很容易與周圍環(huán)境中的陽(yáng)離子(如Na⁺，Mg²⁺)發(fā)生交換，而這過(guò)程是難以避免的，因此會(huì)逆向溶解。盡管Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺等離子都可以和海藻酸鈉交聯(lián)，但這些陽(yáng)離子具有一定的生物毒性，因子限制了他們?cè)卺t(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。而Ca²⁺無(wú)毒，交聯(lián)后的Ca²⁺與淚液中的Na⁺及K⁺可發(fā)生置換，從而釋放出Ca²⁺，鈣離子可以促進(jìn)角膜上皮的修復(fù)，對(duì)角膜具有重要意義，因此我們選用氯化鈣作為交聯(lián)劑。由于鈣離子會(huì)與周圍環(huán)境中的陽(yáng)離子交換，因此SA/PVA復(fù)合膜是一種PH敏感性的復(fù)合膜，隨著周邊陽(yáng)離子的增加，復(fù)合膜溶解的速率增加(如圖1、圖2所示)。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜的制備方法及其應(yīng)用，能夠可控緩釋堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星，并達(dá)到各自的有效濃度，可在預(yù)防感染的同時(shí)，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，復(fù)合膜規(guī)則的孔洞結(jié)構(gòu)可為角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)提供機(jī)械保護(hù)支架，并有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的流通，復(fù)合膜可減少光線的透過(guò)率，減少光線對(duì)受損角膜的刺激，該復(fù)合膜可用于外傷性、或角膜屈光手術(shù)等醫(yī)源性角膜上皮缺損的愈合修復(fù)，減少角膜感染，提升患者依從性和診療體驗(yàn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明原理流程圖。

圖2為本發(fā)明原理流程圖。

圖3為紫外可見(jiàn)近紅外分光光度儀對(duì)載藥及空白復(fù)合膜的透光率進(jìn)行測(cè)試結(jié)果圖。

圖4為將質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5∶1的復(fù)合膜與氯化鈣溶液交聯(lián)后進(jìn)行透光率檢測(cè)結(jié)果圖。

圖5為不同質(zhì)量比復(fù)合膜表面掃描電鏡圖。

圖6為不同質(zhì)量比復(fù)合膜斷面掃描電鏡圖。

圖7為不同質(zhì)量比復(fù)合膜Ca²⁺交聯(lián)后表面掃描電鏡圖。

圖8為不同質(zhì)量比復(fù)合膜Ca²⁺交聯(lián)后斷面掃描電鏡圖。

圖9為載藥復(fù)合膜各時(shí)間點(diǎn)左氧氟沙星釋放濃度曲線圖。

圖10為載藥復(fù)合膜各時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)因子體外釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

一種負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜的制備方法，包括以下步驟：將海藻酸鈉溶液與聚乙烯醇溶液按4-0.5∶1質(zhì)量比混合，同時(shí)加入的負(fù)載生長(zhǎng)因子溶液及左氧氟沙星溶液，攪拌6h后，使其完全混和均勻，隨后倒入直徑5.6cm的培養(yǎng)皿中平鋪，放入37℃烘箱中，烘干成膜，待復(fù)合膜干燥后，放置4℃冰箱中保存。

(1)根據(jù)所述的方法制備負(fù)載生長(zhǎng)因子和左氧氟沙星的海藻酸鈉/聚乙烯醇復(fù)合膜，采用紫外可見(jiàn)近紅外分光光度儀對(duì)載藥及空白復(fù)合膜的透光率進(jìn)行測(cè)試。所得結(jié)果如圖3所示：從透光率結(jié)果可以看出，聚乙烯醇的含量越高，復(fù)合膜的透光性越強(qiáng)，同時(shí)載藥復(fù)合膜對(duì)紫外光有較強(qiáng)的吸收作用。因此當(dāng)質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5∶1時(shí)，復(fù)合膜的透光率相對(duì)高于其他質(zhì)量比復(fù)合膜的透光率。

(2)將質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5∶1的復(fù)合膜與氯化鈣溶液交聯(lián)后進(jìn)行透光率檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示：從圖中可以看出，載藥復(fù)合膜的透光率相對(duì)較低，這可以減輕光線對(duì)角膜上皮缺損的刺激作用。

(3)將不同質(zhì)量比的復(fù)合膜，經(jīng)表面噴金后，用掃描電鏡觀察其表面及斷面結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖5、圖6所示，其中圖中放大倍率均為4000倍，圖中A代表質(zhì)量比SA∶PVA＝4，B代表質(zhì)量比SA∶PVA＝2，C代表質(zhì)量比SA∶PVA＝1，D代表質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5。E代表質(zhì)量比SA∶PVA＝4，F(xiàn)代表質(zhì)量比SA∶PVA＝2，G代表質(zhì)量比SA∶PVA＝1，H代表質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5.從電鏡結(jié)果可以看出質(zhì)量比不同的SA/PVA復(fù)合膜都具有相對(duì)光滑的表面，其中SA與PVA質(zhì)量比＝0.5∶1時(shí)復(fù)合膜具有最光滑的表面。由此可以看出復(fù)合膜中SA與PVA均勻混合。不同質(zhì)量比的復(fù)合膜微觀結(jié)構(gòu)均一，未出現(xiàn)明顯的分離，同時(shí)均有孔洞結(jié)構(gòu)，當(dāng)質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5時(shí)，復(fù)合膜結(jié)構(gòu)最為歸整，孔洞細(xì)致，形似蜂窩狀。

(4)將不同質(zhì)量比的復(fù)合膜交聯(lián)后，用掃描電鏡觀察其表面及斷面結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖7、圖8所示，其中圖中放大倍率均為4000倍，其中I代表質(zhì)量比SA∶PVA＝4，J代表質(zhì)量比SA∶PVA＝2，K代表質(zhì)量比SA∶PVA＝1，L代表質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5，M代表質(zhì)量比SA∶PVA＝4，N代表質(zhì)量比SA∶PVA＝2，0代表質(zhì)量比SA∶PVA＝1，P代表質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5。從電鏡結(jié)果可以看出，交聯(lián)后復(fù)合膜結(jié)構(gòu)變得更加致密，并未出現(xiàn)明顯的斷裂現(xiàn)象。橫斷面電鏡結(jié)果可以看出，當(dāng)質(zhì)量比SA∶PVA＝1時(shí)復(fù)合膜開始出現(xiàn)較大的孔洞，當(dāng)質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5時(shí)，復(fù)合膜的孔洞最大，并分布均勻，這種結(jié)構(gòu)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流通以及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的排出。

(5)將載藥復(fù)合膜各取3片，直徑10mm，與氯化鈣溶液交聯(lián)后置于5mlFP管中，加入4ml去離子水，放入37℃搖床中模擬體內(nèi)環(huán)境，搖床以每分鐘100圈的速度運(yùn)行。每個(gè)樣本于0.5h，1h，2h，3h，6h，12h，24h，36h，48h及72h取樣，完全取出FP管中去離子，同時(shí)置換入新鮮的去離子水4mL，收集的樣品4℃冰箱保存。一部分溶液使用紫外分光光度法側(cè)定左氧氟沙星濃度，另一部分，使用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定bFGF含量。

體外釋放結(jié)果：

載藥復(fù)合膜各時(shí)間點(diǎn)左氧氟沙星釋放濃度

繪制左氧氟沙星釋放曲線，如圖9所示，圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3。

bFGF的體外釋放結(jié)果：

繪制bFGF體外釋放曲線，如圖10所示，圖中各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3。

由載藥SA/PVA復(fù)合膜的左氧氟沙星的釋放中可以發(fā)現(xiàn)，各復(fù)合膜具有相似的釋放規(guī)律，在前3個(gè)小時(shí)有突釋現(xiàn)象，隨著時(shí)間的推移逐漸變得平緩，在72小時(shí)仍有藥物的釋放。72小時(shí)后，左氧氟沙星的濃度依然在0.05ug/mL以上。采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，P>0.5，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

而復(fù)合膜的bFGF的釋放無(wú)明顯突釋現(xiàn)象，并可緩慢釋放72h。隨著時(shí)間的推移，bFGF的濃度未見(jiàn)明顯減少，原因考慮為bFGF是大分子物質(zhì)，相對(duì)不易從復(fù)合膜的孔隙中流出，而隨著SA遇水溶解，孔隙結(jié)構(gòu)的破壞，bFGF隨之釋放。經(jīng)過(guò)72小時(shí)的釋放，bFGF的濃度保持在5pg/mL以上。采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，P>0.5，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，SA/PVA復(fù)合膜是左氧氟沙星和bFGF理想的緩釋載體，復(fù)合膜不同的質(zhì)量比對(duì)其緩釋效果無(wú)明顯影響。但質(zhì)量比SA∶PVA＝0.5時(shí)，復(fù)合膜結(jié)構(gòu)最為規(guī)整，孔洞直徑最大，孔壁較薄，形似蜂窩狀。同時(shí)載藥復(fù)合膜的透光率相對(duì)較低，可有效減輕光線對(duì)角膜上皮缺損的刺激。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。