本發(fā)明涉及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種組織芯片的RNA-蛋白質(zhì)-DNA原位多重染色方法。

背景技術(shù)：

經(jīng)典的免疫組織化學是指在單張組織切片上運用一種已知的第一抗體（一抗）與針對性靶抗原進行特異性結(jié)合，然后利用加酶標的第二抗體（二抗）與一抗的多價結(jié)合和酶底物顯色來實現(xiàn)放大免疫反應，使得在顯微鏡下可清晰觀察到被檢抗原/蛋白在組織細胞的分布和表達情況。該方法已成為病理學在基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學領域廣泛應用的一個最重要和最具有影響力的實驗診斷技術(shù)。

近二十年來，隨著抗原熱修復技術(shù)的革命性突破，免疫組織化學染色已由執(zhí)行單一免疫組織化學法發(fā)展到雙重乃至多重免疫組織化學法。雙重乃至多重免疫組織化學技術(shù)的原理是（1）利用不同酶標的抗體和其化學底物的不同顯色，從而達到在一張組織切片上同時顯現(xiàn)兩種靶抗原甚至兩種以上靶抗原的目的。此改良法雖解決了經(jīng)典免疫組織化學的靶抗原單一顯色的缺點，但卻無法完全確保消除兩種以上靶抗原之間的交叉免疫反應的影響，故其染色結(jié)果缺乏一定的可信性；（2）在同一張組織切片上，先進行第一種抗體染色，經(jīng)觀察后再去除其顯色劑，并破壞抗原和抗體的結(jié)合，然后用另一種抗體進行下一輪免疫組織化學染色；此技術(shù)方法以單一的免疫組織化學染色為基礎，可多次重復，但存在經(jīng)一定批次染色后特異性抗原的免疫反應減弱或消失，切片組織結(jié)構(gòu)變差或完全脫落的缺點。

自1998年Kononen J等人發(fā)明微型組織芯片技術(shù)以來，幫助蛋白質(zhì)組學邁向高通量化和標準化。組織芯片能夠在一次實驗中準確比對不同部位、不同時期甚至不同來源的組織切片的相關信息，大大提高了實驗效率；組織芯片是將來源于不同病變程度、不同病期或不同病種的數(shù)十乃至數(shù)千個微小組織切片樣本，整齊有序地排列固定在一張載玻片上。

此外，對同一張組織芯片進行多重免疫組織化學染色，僅能獲得該組織切片上的蛋白層面的信息，所得生物信息不夠全面。如果需要獲得RNA或DNA層面的分子信息，往往需要在額外的組織芯片，單獨進行RNA原位雜交或DNA原位雜交，而組織芯片的制備成本較高，往往限制了相關實驗的進行。

因此，需要一種能夠在RNA、蛋白質(zhì)和DNA等三個分子層面對同一組織芯片進行檢測并獲取相應的生物信息的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種組織芯片的RNA-蛋白質(zhì)-DNA原位多重染色方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中不能對同一組織芯片進行RNA、蛋白質(zhì)和DNA等三個分子層面的檢測并獲取相應的生物信息的問題。

為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種組織芯片的RNA-蛋白質(zhì)-DNA原位多重染色方法，所述方法對同一組織芯片依次進行RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交；

在所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中，采用表位抗原修復蒸鍋對組織芯片進行分子交聯(lián)解鏈或抗原修復；

在RNA原位雜交、免疫組化染色過程中，在顯色后均用明膠甘油封片。

其中，所述免疫組化染色步驟包括對多個蛋白依次進行免疫組化染色。

其中，所述采用表位抗原修復蒸鍋對組織芯片進行分子交聯(lián)解鏈或抗原修復的具體步驟為：

A1、將抗原修復液加入抗原修復盒中，并將抗原修復盒置于表位抗原修復蒸鍋中預熱；

A2、然后將組織芯片浸泡于已預熱的抗原修復液中，95℃-98℃處理20 min至30 min；

A3、將抗原修復盒取出，室溫冷卻。

其中，在所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色之前，需進行預實驗，確定每一次免疫組化染色所用抗體的最佳濃度和反應程度。

其中，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色根據(jù)所述多個蛋白對應抗體的信號，由弱到強的順序依次進行。

其中，在所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色過程中，采用相同的顯色劑顯色。

其中，在所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中，采用相同的顯色劑顯色。

其中，所述DNA原位雜交為TUNEL原位雜交。

其中，所述RNA原位雜交步驟中采用環(huán)保型生物制片透明劑脫蠟。

所述環(huán)保型生物制片透明劑包括但不限于：TO型生物制片透明劑、康柏氏ETC環(huán)保組織透明劑（長沙康伯恩醫(yī)療科技有限公司）、Van-Clear環(huán)保透明劑（上海宏茲實業(yè)有限公司）、GS環(huán)保試劑（哈爾濱格林標本技術(shù)開發(fā)有限公司）、環(huán)保透明劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、環(huán)保型BT生物組織透明劑（佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設備有限公司）、Y透明劑（籟盾公司）、環(huán)保透明劑（廣州市秀威貿(mào)易有限公司）、竹葉提取物（四川自貢雷扁村村委會）、西奈山環(huán)保組織透明液（杭州西奈山生物科技有限公司）。

其中，當所述組織芯片為乳腺癌組織芯片時，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色所使用的一抗依次為CD68抗體、ET-IgG抗體、HIF-2a抗體、STAT-3抗體、MTC02抗體；

當所述組織芯片為結(jié)直腸癌組織芯片時，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色所使用的一抗依次為HIF-2a抗體、LT-IgG抗體、OS-IgG抗體、IgG抗體、CT-IgG抗體、MTC02抗體；或CD68抗體、LT-IgG抗體、OS-IgG抗體、CT-IgG抗體2。

其中，所述顯色劑為AEC顯色液。

其中，在所述依次進行RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交之前還包括驗證組織芯片質(zhì)量的步驟。

進一步的，所述驗證組織芯片質(zhì)量的步驟可直接用RNA原位雜交步驟替代，也可為免疫組化染色步驟。

更進一步的，當所述免疫組化染色步驟包括對多個蛋白依次進行免疫組化染色時，所述驗證組織芯片質(zhì)量的步驟優(yōu)選采用所述多個蛋白中抗體信號最弱的蛋白所對應的免疫組化染色實驗。

由上可知，本發(fā)明通過表位抗原修復蒸鍋技術(shù)對組織芯片進行分子交聯(lián)解鏈或抗原修復，并結(jié)合明膠甘油封片實現(xiàn)了對同一組織芯片在RNA、蛋白質(zhì)和DNA等三個分子層面的檢測，能夠獲得更加全面的生物信息，并降低獲得這些生物信息的成本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一個具體實施例的方法流程圖。

圖2是本發(fā)明一個具體實施例中的組織芯片經(jīng)RNA原位雜交染色后的部分實驗結(jié)果。

圖3是本發(fā)明一個具體實施例中的組織芯片經(jīng)6重免疫組化染色后的部分實驗結(jié)果。

圖4是本發(fā)明一個具體實施例中的組織芯片經(jīng)TUNEL原位雜交染色后的部分實驗結(jié)果。

圖5是本發(fā)明另一個具體實施例中對同一組織芯片采用表位抗原修復蒸鍋技術(shù)進行7輪CD68檢測的部分結(jié)果圖。

圖6是本發(fā)明另一個具體實施例中對同一組織芯片采用微波抗原修復技術(shù)進行5輪CD68檢測的部分結(jié)果圖。

圖7是本發(fā)明的另一個具體實施例中比較表位抗原修復蒸鍋技術(shù)與微波抗原修復技術(shù)對組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響的實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

本發(fā)明提出第一實施例，一種組織芯片的RNA-蛋白質(zhì)-DNA原位多重染色方法，所述方法對同一組織芯片依次進行RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交；

在所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中，采用表位抗原修復蒸鍋對組織芯片進行分子交聯(lián)解鏈或抗原修復；

在RNA原位雜交、免疫組化染色過程中，在顯色后均用明膠甘油封片。

需要說明的是，表位抗原修復蒸鍋能夠有效修復經(jīng)多聚甲醛固定過的組織芯片上的組織切片內(nèi)形成的“分子面罩”，充分暴露抗原決定簇，與其他的分子交聯(lián)解鏈或抗原修復方法（例如：微波修復、酶消化法、高溫高壓法）相比，表位抗原修復蒸鍋對組織切片中組織形態(tài)的影響更小，有利于實驗結(jié)果的觀察、比較和分析；另外，表位抗原修復蒸鍋技術(shù)操作簡單，對實驗操作者要求低，適用于幾乎所有類型抗原的修復（如：膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白），有利于本方法在基礎科學研究、臨床檢驗等方向推廣時的質(zhì)量控制。

另外，針對采用明膠甘油封片的組織芯片，脫片時，僅需將其浸泡于60℃-80攝氏度的水中，待甘油明膠溶解后，蓋玻片會自然脫落；因此，采用明膠甘油封片，有利于簡化后續(xù)的實驗過程中的脫片步驟，并減少脫片步驟對組織芯片上的組織切片中組織形態(tài)的影響。

以上，第一實施例中的方法能夠有效的實現(xiàn)對同一組織芯片進行RNA、蛋白質(zhì)和DNA等三個分子層面的檢測并獲取相應的生物信息。另外，通過相關圖形軟件（例如photoshop），可將這三個分子層面的檢測結(jié)果放在同一張圖片中進行分析，即共定位分析，這可大大提高實驗結(jié)果分析效率和準確性。

在第一實施例的基礎上，本發(fā)明針對所述免疫組化染色步驟，提出第二實施例，所述免疫組化染色步驟包括對多個蛋白依次進行免疫組化染色。

本方案可進一步提升對同一組織芯片所獲得蛋白質(zhì)層面的生物信息數(shù)據(jù)量，可廣泛應用于科學研究和臨床檢驗，且基于得到的生物信息，可通過相關軟件，對這些不同蛋白在組織芯片上的分布情況進行共定位分析，這可大大提高實驗結(jié)果分析效率和準確性。

其中，在所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色之前，可進行預實驗，確定每一次免疫組化染色所用抗體的最佳濃度和反應程度。

本方案可保證免疫組化染色實驗過程中每一次顯色的實驗效果。

進一步的，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色根據(jù)所述多個蛋白對應抗體的信號，由弱到強的順序依次進行。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述預實驗包括以下步驟：

A1、確定各待檢測蛋白是否在該類型組織切片中表達；

A2、確定各待檢測蛋白對應的最佳抗體稀釋比，及比較各待檢測蛋白的陽性信號表達強弱；

A3、確定待檢測組織芯片質(zhì)量是否符合要求。

在本發(fā)明一個具體實施例中，所述步驟A2具體為：取與組織芯片上的樣本同一類型的石蠟包埋組織塊（1～3個），進行連續(xù)切片，按照抗體說明書給予的抗體稀釋度范圍選取2-3個的稀釋比，在兩張連續(xù)切片組織片，同時同條件進行免疫組化染色（還需設置陽性對照及陰性對照），以確定最佳的抗體稀釋比，同時根據(jù)其染色可得出待檢測蛋白的陽性信號表達強弱。

在本發(fā)明另一個具體實施例中，所述步驟A3具體可為：用上述步驟A3所確定的最佳條件，對待檢測組織芯片按照上述條件進行一次上述免疫組化染色實驗，只要其脫片率低于5%，組織平整無氣泡，即可認為該待檢測組織芯片質(zhì)量合格。

在本發(fā)明另一個具體實施例中，所述步驟A3具體可為：對待檢測組織芯片按照上述條件進行一次RNA原位雜交實驗，只要其脫片率低于5%，組織平整無氣泡，即可認為該待檢測組織芯片質(zhì)量合格。

需要說明的是，本方案中所述多個蛋白對應抗體的信號值的高低可由上述預實驗獲知。在重復多次免疫組化實驗后，特異性抗原的免疫反應可能會減弱，因此，本方案能夠有效保證對多個蛋白依次進行免疫組化染色實驗時，有效實驗結(jié)果的獲得，避免因為某個蛋白原本的信號值太低，而出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。

此外，需要進一步說明的是，所述多個蛋白對應抗體的信號值的高低與各蛋白的種類、組織芯片中切片的來源（例如組織來源）相關。

其中，當所述組織芯片為乳腺癌組織芯片時，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色所使用的一抗依次為CD68抗體、ET-IgG抗體、HIF-2a抗體、STAT-3抗體、MTC02抗體。其中，所述ET-IgG抗體為人食管癌組織來源IgG抗體。

其中，當所述組織芯片為結(jié)直腸癌組織芯片時，所述對多個蛋白依次進行免疫組化染色所使用的一抗依次為HIF-2a抗體、LT-IgG抗體、OS-IgG抗體、IgG抗體、CT-IgG抗體、MTC02抗體；或CD68抗體、LT-IgG抗體、OS-IgG抗體、CT-IgG抗體。其中，所述LT-IgG抗體為人肺癌組織來源IgG抗體；所述OS-IgG抗體為人宮頸癌患者血來源IgG抗體；所述CT-IgG抗體為人結(jié)腸癌組織來源IgG抗體；所述LT-IgG抗體為人肺癌組織來源IgG抗體；所述OS-IgG抗體人宮頸癌患者血來源IgG抗體；所述CT-IgG抗體為人結(jié)腸癌組織來源IgG抗體。

此外，需要說明的是，上述一抗的種屬來源可謂鼠或兔，相應的二抗可為PV9000（中杉金橋）；另外，上述一抗的種屬來源還可以是羊，相應的二抗可謂PV9003（中杉金橋）。另外，需要說明的是，上述一抗均含有相應的標記，用于與二抗特異性結(jié)合。當一抗上的標記為Biotin時，二抗可為鏈酶親和素-HRP抗體。

對于表位抗原修復蒸鍋技術(shù)，需要說明的是，所述采用表位抗原修復蒸鍋對組織芯片進行分子交聯(lián)解鏈或抗原修復的具體步驟可為：

A1、將抗原修復液加入抗原修復盒中，并將抗原修復盒置于表位抗原修復蒸鍋中預熱；

A2、然后將組織芯片浸泡于已預熱的抗原修復液中，95℃-98℃處理20 min至30 min；

A3、將抗原修復盒取出，室溫冷卻。

本方案將溫度控制在95℃-98℃，對大部分抗原具有較好修復效果；且有效的節(jié)約了抗原修復的時間，提高了實驗效率。

對于RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中的顯色系統(tǒng)，需要說明的是，因為需要進行多次顯色和脫色，因此，所使用的顯色劑既要有較好的顯色效果，又要能夠在顯色觀察之后，能夠被有效的洗去。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中所使用的二抗含有辣根過氧化物酶標記，相應的顯色劑可為AEC，相應的脫色劑為80%乙醇。當然，二抗含有辣根過氧化物酶標記時，相應的顯色劑可為DAB，不過DAB無法脫色，因此僅能使用在DNA原位雜交過程中。

在本發(fā)明的另一個實施例中，所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中所使用的二抗含有堿性磷酸酶標記，相應的顯色劑可為NBT-BCIP，相應的脫色劑為二甲基甲酰胺。

以上，脫色劑的選擇取決于酶標二抗及相應的顯色劑。

另外，在所述RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交過程中，采用相同的顯色劑顯色，能有效的簡化整個方法過程中的實驗種類，使操作更為簡單，實驗穩(wěn)定性更高。而對多個蛋白依次進行免疫組化染色過程中，采用相同的顯色劑顯色的方案，具有上述同樣的效果，此外，還能使對多個蛋白的免疫組化實驗結(jié)果相互之間具有更好的對比性，避免因為顯色劑顯色特性的不同，干擾實驗結(jié)果的分析。

對于DNA原位雜交，優(yōu)選采用TUNEL原位雜交。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述RNA原位雜交步驟中采用環(huán)保型生物制片透明劑脫蠟。與目前常見的采用苯類試劑脫蠟的方案相比，本方案的脫蠟效果無明顯差異，但是能夠有效防止實驗操作者苯類中毒，減少對實驗操作者的危害。

所述環(huán)保型生物制片透明劑包括但不限于：TO型生物制片透明劑、康柏氏ETC環(huán)保組織透明劑（長沙康伯恩醫(yī)療科技有限公司）、Van-Clear環(huán)保透明劑（上海宏茲實業(yè)有限公司）、GS環(huán)保試劑（哈爾濱格林標本技術(shù)開發(fā)有限公司）、環(huán)保透明劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、環(huán)保型BT生物組織透明劑（佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設備有限公司）、Y透明劑（籟盾公司）、環(huán)保透明劑（廣州市秀威貿(mào)易有限公司）、竹葉提取物（四川自貢雷扁村村委會）、西奈山環(huán)保組織透明液（杭州西奈山生物科技有限公司）。

在本發(fā)明的一個實施例中，在所述依次進行RNA原位雜交、免疫組化染色和DNA原位雜交之前還包括一驗證組織芯片質(zhì)量的步驟。該步驟可采用上述預實驗中所述步驟A3的任一種方法。

經(jīng)本發(fā)明人多次實驗驗證發(fā)現(xiàn)，待檢測組織芯片按上述方法進行一次上述免疫組化染色實驗后，或按上述方法進行一次RNA原位雜交實驗后，在上述第一次實驗中未發(fā)生脫片的，可按上述方案至少重復進行9次顯色-脫色實驗，且不再發(fā)生脫片。上述顯色-脫色實驗可為按上述條件依次進行的RNA原位雜交實驗、免疫組化染色實驗、DNA原位雜交實驗的總次數(shù)。

以下本發(fā)明通過數(shù)個具體實施例，進一步說明本發(fā)明所記載技術(shù)方案的技術(shù)效果及優(yōu)越性。

在本發(fā)明的一個具體實施例中，對同一組織芯片依次進行mRNA原位雜交實驗、單色多重免疫組化染色實驗和TUNEL原位雜交染色實驗，該實驗的技術(shù)流程圖如圖1所示。具體步驟如下。

一、mRNA原位雜交實驗。

1、組織芯片置于TO型生物制片透明劑中脫蠟3遍，10分鐘/遍；100%乙醇水化2遍，5分鐘/遍；95%乙醇水化1遍，5分鐘；90%乙醇水化1遍，5分鐘；70%乙醇水化1遍，5分鐘；其中，梯度乙醇用DEPC水配制。

2、TBST（DEPC處理水配制，含0.1% 吐溫-20）洗3遍，5分鐘/遍。

3、組織芯片置0.2N HCl（DEPC處理水配制）中酸處理，室溫孵育15分鐘。

4、1×蛋白酶 K處理組織芯片消化堿性蛋白，37℃孵育30分鐘。

5、TBST洗3遍，5分鐘/遍；終止酶反應。

6、組織芯片置于已預熱20分鐘的表位抗原修復蒸鍋進行分子交聯(lián)解鏈25分鐘，然后自然冷卻至室溫（約20分鐘）。

7、TBST洗3遍，5分鐘/遍。

8、4%多聚甲醛后固定組織，室溫20分鐘。

9、TBST洗3遍，5分鐘/遍。

10、滴加預雜交液，55℃2小時，以封閉組織上探針的非特異性結(jié)合位點。

11、U6寡核苷酸探針（廣州外顯子生物公司）置85℃變性5分鐘，37℃保持2分鐘。

12、去除預雜交液，滴加含探針的雜交液（陰性對照滴加不含探針雜交液），加蓋蓋玻片，在ThermoBrite原位雜交儀中42℃雜交16小時。

13、5×SSC（DEPC處理水配制），37℃，洗10分鐘；然后2×SSC（含50%去離子甲酰胺，DEPC處理水配制），37℃，洗3遍，5分鐘/遍；再用TBST洗5分鐘。

14、滴加封閉液（含1%羊血清，3%BSA，TBST配），37℃封閉1小時；以封閉組織上二抗的非特異性結(jié)合位點。

15、去除封閉液，滴加Anti-Dig-AP-Conjugate二抗（1:1000，TEST配制），37℃孵育2小時。

16、TBST洗3遍，5分鐘/遍。

17、根據(jù)NBT-BCIP顯色試劑盒（索萊寶）配制顯色液，根據(jù)組織芯片大小滴加顯色液，37℃避光孵育，顯微鏡觀察出現(xiàn)藍紫（黑）色陽性信號即可終止顯色，自來水洗2-5分鐘。

18、用甘油明膠封片。

19、顯微鏡下觀察，并運用Leica LAS V4.2軟件選采組織切片中陽性區(qū)域照相，或用全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)對組織芯片進行高通量掃描照相分析。

需要說明的是，上述步驟3中，通過稀酸處理組織能使堿性蛋白變性，防止探針與堿性蛋白的靜電結(jié)合導致非特異性染色。步驟4用于膜打孔，使核酸暴露，使探針易于結(jié)合至靶位點。步驟6中的分子交鏈解鏈步驟能夠有效的對多聚甲醛固定后的組織中形成分子交聯(lián)進行解鏈，便于探針的結(jié)合，同時保證組織芯片上各切片的組織結(jié)構(gòu)，不易使切片脫片。步驟11能夠有效破壞單鏈探針自身形成的二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。步驟17中，若進行核染可自選核固紅或甲基綠，當RNA表達為胞核時也可選擇不核染。

部分實驗結(jié)果如圖2所示。圖2中，NBT-BCIP顯藍紫（黑）色陽性信號，RISH組A圖（放大倍數(shù)400×）為a圖（放大倍數(shù)200×）框中的放大區(qū)域，PC與NC為同批另張陽性對照與陰性對照組織切片染色（放大倍數(shù)為400×）。

二、單色多重免疫組化染色實驗。

按下述步驟依次對Ab1-Ab6這6中抗體所對應的蛋白進行檢測。

1、將組織芯片浸泡于預熱至60℃～80℃雙蒸水中，待甘明膠溶解，蓋玻片自然脫落。

2、置組織芯片于二甲基甲酰胺中，50℃水浴浸泡5-10分鐘，顯微鏡下檢查，待藍紫（黑）色陽性信號完全褪色；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

3、組織芯片置于預熱20分鐘的抗原修復液中，再置于表位抗原修復蒸鍋中持續(xù)25分鐘，自然冷卻至室溫（約20分鐘）；然后1× PBS洗3遍，共15分鐘。

4、組織芯片置于3%H₂O₂（1×PBS配制）30分鐘；以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶造成的非特異性背景染色；然后1×PBS洗3遍，共15分鐘。

5、用一抗稀釋液適度稀釋一抗加到組織芯片上，即先做免疫組化染色第一輪的一抗孵育。4℃濕盒過夜；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

6、V9000（或PV9003）試劑盒（中杉金橋）的試劑一加到組織芯片上(二抗孵育)，室溫20分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘；PV9000（或PV9003）試劑盒的試劑二再加到組織芯片上，室溫30分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘；（Streptavidin-HRP根據(jù)不同公司抗體說明書決定二抗孵育的時間和溫度）。

7、按試劑盒說明配制AEC顯色液（中杉金橋），加到組織芯片上，室溫避光孵育，顯微鏡下觀察（視抗體顯色紅色陽性信號，決定終止顯色時間，5～20分鐘）。自來水洗5-10分鐘終止顯色。

8、組織芯片置于蘇木素液中核染，室溫5～8秒，自來水洗5-10分鐘終止顯色。

9、用明膠甘油封片。

10、顯微鏡下觀察，在組織芯片上運用Leica LAS V4.2軟件選采組織切片中陽性區(qū)域照相，或用全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)對組織芯片進行高通量掃描照相分析。

以上完成第一輪免疫組化染色，更換實驗過程中所使用的一抗、二抗，按上述1-10步驟進行后續(xù)5輪的免疫組化染色實驗。其中，后續(xù)5輪中，第2步因為需要脫色的對象與第1輪不同，第2步需進行適應性調(diào)整，具體可為：置組織芯片于80%乙醇中浸泡，顯微鏡下檢查，紅色陽性信號需完全消失，然后1×PBS洗3遍，共15分鐘。

需要說明的是，步驟5中一抗的稀釋度可通過預實驗獲得，所述預實驗的具體步驟方法可采用上述的預實驗方法進行。

其中，部分實驗結(jié)果如圖3所示。圖3中AEC顯紅色陽性信號，Ab1-Ab6為6種不同抗體染色，NC為同批次另張陰性對照組織切片染色（放大倍數(shù)均為200×）。注：Ab1：HIF-2a抗體，Ab2：LT-IgG-1（人肺癌組織來源IgG抗體1），Ab3：OS-IgG-2（人宮頸癌組織來源IgG抗體2），Ab4：IgG抗體；Ab5：CT-IgG-1（人結(jié)腸癌組織來源IgG抗體1），Ab6：MTC02抗體。

三、組織芯片上TUNEL原位雜交實驗。

1、將組織芯片置于預熱至60℃～80℃雙蒸水中，待甘油明膠完全溶解，蓋玻片自然脫落。

2、置組織芯片于80%乙醇中浸泡，然后顯微鏡下檢查，待紅色陽性信號完全褪色；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

3、組織芯片置于預熱20分鐘的表位抗原修復蒸鍋，持續(xù)25分鐘，自然冷卻至室溫（約20分鐘）；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

4、內(nèi)源性過氧化氫酶封閉：組織芯片置于3%H₂O₂ 20分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

5、根據(jù)TUNEL試劑盒（南京凱基）說明書配制TdT酶反應液：45μL Equilibration buffer加入1μL Biotin-11-dUTP和4μL TdT Enzyme；根據(jù)組織芯片樣本大小滴加TdT酶反應液產(chǎn)生連接反應，濕盒中37℃避光60分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘；（Biotin-11-dUTP在TdT酶的催化下與斷裂DNA片段的3’OH結(jié)合）

6、根據(jù)TUNEL試劑盒（南京凱基）說明書配制Streptavidin-HRP反應液：49.5μL 1×PBS加入0.5μL Streptavidin-HRP 濕盒中37℃避光反應30分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

7、顯色液按TUNEL試劑盒（南京凱基）說明書配制DAB新鮮混合試劑，加到組織芯片上，室溫顯色反應0.5-5分鐘；1×PBS洗3遍，共15分鐘。

8、組織芯片置于蘇木素液中，室溫5-8秒，自來水洗5-10分鐘終止顯色。

9、用明膠甘油封片。

10、顯微鏡下觀察，在組織芯片上運用Leica LAS V4.2軟件選采組織切片中陽性區(qū)域照相，或用全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)對組織芯片進行高通量掃描照相分析。

部分實驗結(jié)果如圖4所示，圖4示出了在同一組織芯片上進行1次RNA原位雜交、6次免疫組化重染后，再進行TUNEL原位雜交染色的部分結(jié)果。其中，NBT-BCIP顯棕色陽性信號，TUNEL組A圖（放大倍數(shù)400×）為a圖（放大倍數(shù)100×）框中的放大區(qū)域，PC與NC為同批另張陽性對照與陰性對照的組織切片染色結(jié)果（放大倍數(shù)400×）。

如圖1-4所示，本發(fā)明成功的對同一組織芯片進行了mRNA原位雜交實驗、單色多重免疫組化染色實驗和DNA原位雜交實驗。

其中，在步驟二、三中的內(nèi)源性過氧化氫酶封閉步驟可不用每一次都進行，只要之前進行過一次內(nèi)源性過氧化氫酶封閉步驟，后續(xù)的免疫組化染色或DNA原位雜交實驗中，均可不在進行此步驟。在步驟二、三中重復進行內(nèi)源性過氧化氫酶封閉步驟，可有效保證每一次染色實驗的背景值處于較低的水平。

另外，上述具體實施例中的二抗、顯色劑和脫色劑，以及相關的實驗步驟，均可能根據(jù)需要進行調(diào)整。

另外，本發(fā)明還提供了另外一個具體實施例，在該實施例中，具體比較了表位抗原修復蒸鍋技術(shù)與微波抗原修復技術(shù)對免疫組化染色結(jié)果的影響。

在本具體實施例中，對相同來源的組織芯片，分別進行表位抗原修復蒸鍋技術(shù)與微波抗原修復技術(shù)為基礎的免疫組化染色實驗。其中，表位抗原修復蒸鍋技術(shù)為基礎的免疫組化染色實驗與上述具體實施例相同，微波抗原修復技術(shù)為基礎的免疫組化染色實驗具體為用微波抗原修復技術(shù)替換上述具體實施例中的表位抗原修復蒸鍋修復步驟，具體為：組織芯片置于適量（約200mL）0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波加熱3分鐘。然后每間隔2分鐘加熱20秒，持續(xù)加熱15-20分鐘（約6-7次），自然冷卻到室溫（約1小時），即完成抗原修復。在本具體實施例中，采用相同的抗原修復技術(shù)，對相同的蛋白，例如CD68或TAF1L，重復進行檢測，部分結(jié)果如圖5、6所示。

如圖5所示，其示出了采用表位抗原修復蒸鍋技術(shù)進行抗原修復的組織芯片進行7輪CD68檢測的部分結(jié)果圖。由圖5可知，在第1至7輪中，各輪的染色結(jié)果比較相似，顏色相差不大；同時，比較第1至7輪免疫組化染色后的陽性細胞百分比，也可知悉，它們的比例差別也不大。

而如圖6所示，其示出了采用微波抗原修復技術(shù)進行抗原修復的組織芯片進行5輪TAF1L檢測的部分結(jié)果圖。由圖6可知，第1輪和第5輪中的染色結(jié)果差異較大，尤其表現(xiàn)在顏色深淺上；另外，通過比較第1輪和第5輪免疫組化染色后的陽性細胞百分比，也可知悉，它們的比例差別比較大。

以上，采用表位抗原修復蒸鍋技術(shù)較微波修復技術(shù)，更適用于多重免疫組化染色，并且能夠在多重實驗中，更好的保證實驗結(jié)果的一致性，能夠?qū)ο嗤臉悠帆@得更多的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)。

另外，本申請人還提供了另外一個具體實施例，在該實施例中，具體比較了表位抗原修復蒸鍋技術(shù)與微波抗原修復技術(shù)對組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響。

在本實施例中，對相同來源的組織芯片，分別進行表位抗原修復蒸鍋技術(shù)與微波抗原修復技術(shù)為基礎的6次蘇木精-伊紅染色，其中，表位抗原修復蒸鍋技術(shù)為基礎的抗原修復步驟條件同上一具體實施例，微波抗原修復技術(shù)為基礎的抗原修復步驟條件同上一具體實施例。具體實驗結(jié)果如圖7所示。其中，steamer修復表示為表位抗原修復蒸鍋技術(shù)進行抗原修復。由圖7可知，采用表位抗原修復蒸鍋技術(shù)進行6次抗原修復的組織芯片的組織形態(tài)，在第6次染色后與第1次基本相同，而采用微波抗原修復技術(shù)進行6次抗原修復的組織芯片的組織形態(tài)，在第6次染色后的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)與第1次染色后的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)存在非常明顯的區(qū)別，已經(jīng)完全不能繼續(xù)使用了。

以上，采用表位抗原修復蒸鍋技術(shù)較微波修復技術(shù)，能夠更好的在多次免疫組化后，保證組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，對實驗結(jié)果的干擾小，也使得更多次的免疫組化實驗成為可能，能夠?qū)ο嗤臉悠帆@得更多的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。