專利名稱：一種芯片原位聚合酶鏈反應(yīng)檢測目標基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種芯片原位聚合酶鏈反應(yīng)檢測目標基因的方法，具體地講是一種在基因芯片表面上進行原位聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對目標基因進行檢測的方法。
背景技術(shù)：
基因芯片是指將大量基因探針分子固定于固體支持物(如硅片、玻璃、塑料和尼龍膜等)上，然后與標記的樣品進行雜交，反應(yīng)結(jié)果用熒光法、酶標法、同位素法檢出，再用掃描儀等儀器進行數(shù)據(jù)采集，最后用計算機軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用該技術(shù)可將大量的基因探針同時固定于支持物上，所以一次可對大量核酸分子進行檢測分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、效率低等不足。目前，該技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域主要有基因表達譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預(yù)測、藥物篩選、基因測序等。
目前用基因芯片來分析檢測樣品，待測樣品與芯片雜交之前都必需進行擴增和標記，通過擴增來實現(xiàn)對待測基因片段的長度的降低和待測量的增加，一般用于基因芯片檢測的片段長度都在200-300個堿基左右，而對于大片段和探針的雜交，由于其二級結(jié)構(gòu)的存在而影響了其和探針的有效結(jié)合，因而對大片段的檢測一直是基因芯片這種檢測手段的一個技術(shù)難題。目前國內(nèi)有報道用機械打碎或非限制性酶切來降低片段的長度，但這兩種方法操作復(fù)雜，并且由于是對目的片段的隨機打斷故重現(xiàn)性不好，因此都不能從根本上解決對大片段目的基因的檢測問題。國內(nèi)張先恩等發(fā)明的一種固相載體上校讀PCR檢測基因突變的方法(申請?zhí)?1133630.7)提出利用一對外引物和內(nèi)引物對待測基因進行固相PCR檢測，是以臨床樣品或以引物擴增產(chǎn)物為模板。直接以臨床樣品為模板，在固相PCR反應(yīng)中相應(yīng)存在內(nèi)引物和外引物相互競爭的問題而影響了PCR的擴增效率；以外引物的擴增產(chǎn)物為模板然后在進行固相PCR反應(yīng)，實際上還是需要了樣品雜交前的預(yù)擴增，因此也不是一種十分理想的檢測方法。而且采用巰基硅烷化修飾玻片，商品化的這種玻片十分少，給這種方法的應(yīng)用推廣帶來了難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就基因芯片中大片段與核酸探針的雜交提出了一種新的檢測方法—芯片原位PCR法對目標基因進行檢測，從而實現(xiàn)了樣品的處理、標記的同步化和原位檢測，既省去了以往基因芯片檢測前樣品的擴增、標記又解決了大片段待測基因樣品和探針的雜交問題，是基因芯片雜交技術(shù)中的一種突破。
本發(fā)明采用如下技術(shù)路線根據(jù)目標基因設(shè)計一對特異性引物，上游引物的5’端連接有15-20個堿基長的多聚胸腺嘧啶(polyT)結(jié)構(gòu)，這種上游引物的5’端再經(jīng)氨基修飾后點于醛基修飾的玻片上，然后以待測樣品的基因組脫氧核糖核酸(DNA)為模板，在芯片上進行原位PCR反應(yīng)，利用DNA聚合酶的特異性來實現(xiàn)對特定目的片段的擴增，在引物延伸過程中加入地高辛標記的dUTP，隨后采用傳統(tǒng)酶標技術(shù)對延伸產(chǎn)物進行檢測，使檢測結(jié)果通過底物顏色呈現(xiàn)于尼龍膜或硝酸纖維膜表面，檢測結(jié)果可直接目測或用廉價的光學(xué)掃描儀讀取數(shù)據(jù)。利用本方法可以實現(xiàn)對多位點的同步檢測，也可以用于對多個SNP位點的檢測。
本發(fā)明的實驗過程如下引物設(shè)計遵循各個引物的退火溫度(Tm值)大致相等的原則，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，每個待測基因設(shè)計一對引物。芯片的制備上游引物5’端氨基修飾且連有15-20個堿基長的poly(T)的臂結(jié)構(gòu)，通過Cartesian microarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾載波片(購于基因公司)表面，室溫下固定48-72h。
芯片上的原位PCR反應(yīng)配制PCR反應(yīng)混合液，在混合液中加入地高辛標記-dUTP，混合液滴加于芯片方陣上，用Sigma公司司產(chǎn)的蓋片(coverwell)封片，然后置于PCR儀內(nèi)反應(yīng)。
芯片的洗脫及顯色PCR結(jié)束后，用洗液搖洗去除游離成份及非特異性雜交分子，然后和抗地高辛抗體(anti-digoxigenin-AP)反應(yīng)，滴加顯色液(NBT/BCIP Stock Solution)并蓋膜使其顯色于膜上。


圖1本發(fā)明—芯片原位PCR檢測目標基因方法的原理圖(1)加入目標基因后，目標基因和芯片上固定的特異性引物探針進行雜交反應(yīng)；(2)目標基因和特異性探針能夠互補配對就能進行延伸反應(yīng)而被檢測到，而和探針不匹配的目標基因就不能延伸，因而無信號出現(xiàn)。
圖2用本發(fā)明方法對質(zhì)粒pCAMBIA1301檢測，對其所含的GUS、35S、hptII、aadA基因檢測的結(jié)果圖。位點2、4是陰性對照，位點1、3、5、6分別對應(yīng)于GUS、35S啟動子、hpt、aadA基因，位點7是陽性對照。
具體實施實例實施實例1利用本發(fā)明提供的方法探討了對轉(zhuǎn)基因植物中常用的質(zhì)粒載體pCAMBIA1301的檢測，對質(zhì)粒中含有的4個基因GUS、35S啟動子、hpt、aadA做出了初步的檢測。運用的芯片原位PCR方法，減少了傳統(tǒng)芯片檢測前的樣品的擴增和標記步驟，能夠一步實現(xiàn)對質(zhì)粒pCAMBIA1301中的4個基因的檢測，在檢測時間上大大縮短，又克服了多步PCR的繁瑣，為以后用生物芯片對轉(zhuǎn)基因水稻以及轉(zhuǎn)基因植物的全面檢出提出了一種可行性方法。具體檢測步驟是1、引物設(shè)計針對在轉(zhuǎn)基因水稻中常出現(xiàn)的35S啟動子、報告基因hpt、aadA、GUS基因的保守序列，遵循各個引物的退火溫度(Tm值)大致相同的原則，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，序列如下

2、芯片的制備上游引物5’端氨基修飾且連有16個堿基長的poly(T)的臂結(jié)構(gòu)，將上游引物用去離子水溶解(吸光值2O.D+40ulH2O)，并與點樣緩沖液(ArrayIt公司2×點樣緩沖液spotting solution)等體積混合，通過Cartesian microarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾載波片表面，室溫下固定72h。
3、芯片上的原位PCR反應(yīng)PCR擴增體系如下試劑 每份用量10×緩沖液 1.5uldNTP(5∶2)(2.5mM) 1.2uldig-dUTP 0.5ul模板(15ng/ul) 1.5ul引物(reverse，10pmol/ul) 1ul×4Taq酶(1U/ul) 1ulH2O 5.3ul總體積 15ul取PCR混合液50ul滴于芯片方陣上，然后用coverwell封片，置于PCR儀上采用如下程序進行循環(huán)94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min-58℃退火1min-72℃延伸30s，共10個循環(huán)，最后72℃延伸5min。
4、芯片的洗脫及顯色PCR結(jié)束后，去除coverwell后置于洗液I(0.1×SSC 0.1％SDS)中室溫搖洗10-30分鐘，洗液II(100mM順丁烯二酸(maleic acid)、150mM NaClPH7.5、0.3％(v/v)Tween 20)搖洗5分鐘，吸干洗液后于方陣上滴加15-20ul抗體，蓋上蓋玻片后避光室溫反應(yīng)30分鐘。最后經(jīng)洗液II、檢測緩沖液沖洗、吸干后，滴加顯色液并蓋膜使其顯色于膜上，室溫避光顯色30min-2h。
權(quán)利要求
1.一種芯片原位PCR檢測目標基因的方法，其特征在于根據(jù)目標基因設(shè)計一對特異性引物，上游引物的5’端連接有15-20個堿基長的多聚胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)，這種上游引物的5’端再經(jīng)氨基修飾后點于醛基修飾的玻片上，然后以待測樣品的基因組脫氧核糖核酸為模板，在芯片上進行原位PCR反應(yīng)，利用DNA聚合酶的特異性來實現(xiàn)對特定目的片段的擴增，在引物延伸過程中加入地高辛標記的dUTP，隨后采用傳統(tǒng)酶標技術(shù)對延伸產(chǎn)物進行檢測，使檢測結(jié)果通過底物顏色呈現(xiàn)于尼龍膜或硝酸纖維膜表面，檢測結(jié)果可直接目測或用廉價的光學(xué)掃描儀讀取數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)樣品的處理、標記同步化和原位檢測。
2.按權(quán)利要求1所述的一種芯片原位PCR檢測目標基因的方法，其特征在于包括如下步驟(1)引物設(shè)計遵循各個引物的退火溫度(Tm值)大致相同的原則，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，一個目標基因設(shè)計一對引物；(2)芯片的制備上游引物5’端氨基修飾且連有15-20個堿基長的polyT的臂結(jié)構(gòu)，通過Cartesian microarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾載波片表面，室溫下固定48-72h；(3)芯片上的原位PCR反應(yīng)PCR混合液滴于芯片方陣上，用蓋片封片，然后置于PCR儀內(nèi)反應(yīng)；(4)芯片的洗脫及顯色PCR結(jié)束后，用洗液搖洗去除游離成份及非特異性雜交分子，然后和抗地高辛抗體反應(yīng)，滴加顯色液并蓋膜使其顯色于膜上。
3.按權(quán)利要求1或2所述的一種芯片原位PCR檢測目標基因的方法，其特征在于用于質(zhì)粒載體pCAMBIA1301的檢測的具體步驟是(1)引物設(shè)計遵循各個引物的退火溫度(Tm值)大致相同的原則，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，序列如下
(2)芯片的制備上游引物5’端氨基修飾且連有16個堿基長的polyT的臂結(jié)構(gòu)，將上游引物用去離子水溶解并與點樣緩沖液等體積混合，通過Cartesian microarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾載波片表面，室溫下固定72h；(3)芯片上的原位PCR反應(yīng)PCR擴增體系如下試劑 每份用量10×緩沖液1.5uldNTP(5∶2)(2.5mM) 1.2uldig-dUTP 0.5ul模板(15ng/ul) 1.5ul引物(reverse，10pmol/ul) 1ul×4Taq酶(1U/ul) 1ulH2O 5.3ul總體積15ul取PCR混合液50ul滴于芯片方陣上，然后用coverwell封片，置于PCR儀上采用如下程序進行循環(huán)94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min-58℃退火1min-72℃延伸30s，共10個循環(huán)，最后72℃延伸5min；(4)芯片的洗脫及顯色PCR結(jié)束后，去除coverwell后置于0.1×SSC 0.1％SDS洗液I中室溫搖洗10-30分鐘，100mM順丁烯二酸、150mM NaCl PH7.5、0.3v/v％Tween20洗液II搖洗5分鐘，吸干洗液后于方陣上滴加15-20ul抗體，蓋上蓋玻片后避光室溫反應(yīng)30分鐘；最后經(jīng)洗液II、檢測緩沖液沖洗、吸干后，滴加顯色液并蓋膜使其顯色于膜上，室溫避光顯色30min-2h。
4.按權(quán)利要求3所述的一種芯片原位PCR檢測目標基因的方法，其特征在于所述的上游引物用去離子水溶解的吸光值2O.D+40ulH2O。
全文摘要
一種利用基因芯片的檢測方法，是在芯片表面進行原位PCR反應(yīng)對待測基因進行檢測的方法。將普通PCR反應(yīng)中的上游引物連接poly(T)的臂結(jié)構(gòu)后，5’端氨基修飾后連接于醛基修飾的玻片等載體上，在芯片表面上進行的一種芯片原位PCR反應(yīng)。利用本發(fā)明能有效解決目前基因芯片雜交中小片斷探針和待測大片段不能有效雜交的問題，實現(xiàn)了樣品處理和標記同步化和原位檢測。本發(fā)明可用于SNP檢測、轉(zhuǎn)基因植物檢測、疾病檢測等方面。
文檔編號C12Q1/68GK1557964SQ20041001601
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月19日
發(fā)明者趙建龍, 高秀麗, 楊劍波, 景奉香 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所, 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究