專利名稱：適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、水稻、油菜中外源基因定性、定量檢測及拷貝數(shù)檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用。屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)在20世紀(jì)廣泛滲入農(nóng)業(yè)，高科技改變了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的研究和生產(chǎn)模式，為我們提供了更豐富的食品和醫(yī)療產(chǎn)品。以農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)化最發(fā)達(dá)的美國為例，美國市場50％以上大豆、玉米、棉花等農(nóng)作物是轉(zhuǎn)基因品種。
(一)轉(zhuǎn)基因植物定性、定量檢測中的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因研究進(jìn)展針對消費(fèi)者的需求，國際生物貿(mào)易和食品工業(yè)等部門對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品逐步實(shí)施了IP管理(Identity Preservation)，確保轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品(如大豆和玉米)在生產(chǎn)和運(yùn)送過程中分開處理。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國際上有30多個國家和地區(qū)要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識。我國政府對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品生物安全管理工作十分重視，2001年5月23日，國務(wù)院發(fā)布了第304號令《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，在該條例的第四章第二十八條明確規(guī)定了在中華人民共和國境內(nèi)銷售列入農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)當(dāng)有明顯的標(biāo)識。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度依賴于對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測。轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測方法主要有兩種，一種是基于DNA的檢測方法，一種是基于蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測方法。
實(shí)際檢測工作中，基于DNA為基礎(chǔ)的檢測方法得到廣泛使用。轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測過程涉及樣本的采集、DNA抽提、定性PCR檢測、定量PCR檢測、作出結(jié)論等過程。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測可通過分析其引入DNA的序列來檢測，實(shí)際檢測工作中需要了解插入的DNA的一些信息或者可能的候選序列。轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的PCR檢測主要采取的策略是檢測一個或多個“通用的”轉(zhuǎn)基因序列(通常是35s啟動子、Nos終止子等)，然后檢測一系列特異DNA序列。
歐盟和其他國家加強(qiáng)了對GMOs釋放到環(huán)境中的監(jiān)督管理，建立并強(qiáng)制實(shí)行了包含對GMOs產(chǎn)品的標(biāo)簽制度。自愿性的標(biāo)簽則根據(jù)產(chǎn)品中GMO的含量而定。因此通過DNA或蛋白質(zhì)分析，對產(chǎn)品中GMO含量進(jìn)行精確定量非常重要。從90年代初期開始，以PCR為基礎(chǔ)的定量PCR技術(shù)得到迅猛發(fā)展。一般來說，定量PCR方法有三種類型PCR-ELISA(PCR-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)檢測、競爭性定量PCR(Quantitative Competitive PCR，QC-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)。由于PCR-ELISA和競爭性定量PCR方法在實(shí)際檢測中有一定的局限性，因此沒有得到廣泛使用。
另外，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測工作中，需要使用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因作為內(nèi)源的參照，現(xiàn)在根據(jù)已有的報(bào)道，常用invertase基因作為轉(zhuǎn)基因玉的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，lectin andβ-actin基因作為大豆的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。此外也有文獻(xiàn)報(bào)道將5個拷貝的apx基因和拷貝數(shù)在1-2拷貝數(shù)之間的BnACCg8基因分別作為番茄和油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。但是國際上有關(guān)轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄和水稻定性和定量PCR檢測的低拷貝，且拷貝數(shù)恒定的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)分子還沒有報(bào)道。
(二)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)分析研究進(jìn)展在轉(zhuǎn)基因植物的研究和產(chǎn)業(yè)化過程中，從原始的眾多轉(zhuǎn)基因植物中篩選、檢測到拷貝數(shù)低、遺傳相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物的工作量很大，外源基因整合到植物的基因組中的拷貝數(shù)會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平以及后代的穩(wěn)定表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因植物后代遺傳不穩(wěn)定是一個十分復(fù)雜的問題，很多轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)過田間種植后，外源基因表達(dá)量低或不能表達(dá)，這種現(xiàn)象通常稱為基因沉默(gene silencing)。大量研究證明許多因素都與基因沉默現(xiàn)象有關(guān)?，F(xiàn)有研究結(jié)果普遍認(rèn)為由于植物遺傳轉(zhuǎn)化中外源基因在植物體染色體上的整合具有很大的隨機(jī)性，如外源基因插入到植物細(xì)胞的重要基因中，可能致死或失活，如在不同位點(diǎn)上或同一位點(diǎn)上插入多個外源基因時(shí)，基因失活的頻率更高。
一般認(rèn)為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體上是外源蛋白質(zhì)得以穩(wěn)定表達(dá)的前提。而外源基因的這種整合可以是單拷貝或者多拷貝的，整合的拷貝數(shù)將影響重組蛋白的表達(dá)。因此，外源基因在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)檢測是轉(zhuǎn)基因植物乃至植物功能基組研究的一個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)目前，檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)的方法有1，SB(Southern blot analysis)技術(shù)，該技術(shù)是一種在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中普遍使用的測定拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法，它是于1975年由英國分子生物學(xué)家E.M.Southern所發(fā)明的。其基本過程為將一定量的DNA樣品用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割成不同長度的DNA片段，然后在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳后的凝膠經(jīng)堿變性處理，使DNA解離成單鏈，然后用毛細(xì)管虹吸法或電轉(zhuǎn)移法，使凝膠上的單鏈DNA片段，按凝膠上相同的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜，經(jīng)適當(dāng)洗滌、晾干。如果是硝酸纖維素膜，還要在75～80℃烤箱中加溫2小時(shí)或經(jīng)354nm紫外照射3～5分鐘進(jìn)行固定，即可用于雜交。
純化的探針DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等標(biāo)記。雜交后的膜在暗盒中進(jìn)行放射自顯影后，即在一定的位置顯示同標(biāo)記探針特異地結(jié)合的陽性DNA條帶。
該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是1)靈敏度高在理想條件下，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也可以被清晰的檢測出來。2)用途廣泛可以同時(shí)用于構(gòu)建DNA的分子酶切圖譜和遺傳圖譜。但是該方法費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，需要大量的DNA樣品，同時(shí)在操作過程往往需要接觸對人體有害的放射性同位素。
2，毛細(xì)管電泳法(CE，capillary electrophoresis)該技術(shù)是在90年代初發(fā)展起來的，它是一種通過PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行核酸定量分析的方法，在一定的范圍內(nèi)，紫外吸收值與相應(yīng)的質(zhì)濃度成線性關(guān)系，不需要特異性標(biāo)記探針，還可以同時(shí)作PCR特征鑒定，對PCR混合物中各組分如核苷酸，引物，引物二聚體，異二聚體，非特異性產(chǎn)物進(jìn)行觀察。在毛細(xì)管電泳中，應(yīng)用SDS緩沖液，以PCR混合物中每一組分單獨(dú)進(jìn)樣校正洗脫時(shí)間，然后通過計(jì)算電泳圖譜面積，直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
其主要優(yōu)點(diǎn)是所需要的樣品和試劑量低，且具有分辨率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、分析時(shí)間短和易于實(shí)現(xiàn)自動化的特點(diǎn)。
但是以下一些因素將影響它的結(jié)果1)PCR循環(huán)次數(shù)影響CE峰的形成，在PCR平臺期易于形成雜交分子，增加新譜峰。2)進(jìn)樣方式如電遷移進(jìn)樣，壓力進(jìn)樣，可帶來結(jié)果的偏差。3)電滲流的影響，在進(jìn)樣結(jié)束時(shí)電滲流會除去介面的部分樣品分子，影響定量結(jié)果。
3，熒光原位雜交技術(shù)(FISH，fluorescence in situhybridization)該技術(shù)是80年代末開始發(fā)展起來的，它結(jié)合了免疫熒光和分子雜交技術(shù)，是一項(xiàng)重要的非放射性標(biāo)記原位雜交技術(shù)。其原理主要是將DNA探針用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記，使標(biāo)記的探針原位雜交到染色體切片上，再用與熒光素分子耦聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異結(jié)合，經(jīng)洗脫和與熒光標(biāo)記的親和性試劑共培養(yǎng)，在探針雜交位點(diǎn)便可見不連續(xù)的熒光信號。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)FISH操作簡單、雜交速度快(一般2天內(nèi)可完成)、標(biāo)記探針穩(wěn)定(一般標(biāo)記后可使用兩年)、結(jié)果直觀、背景低，不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，且不需要放射性同位素；2)FISH可在同一次雜交中使用多個探針、進(jìn)行多種顏色的分析；3)FISH既期分裂相，也可用于間期核，從而大大拓寬了FISH的應(yīng)用范圍；4)DNA序列能被定位在目標(biāo)范圍從載玻片上分散的中期細(xì)胞染色體到懸浮固定保存細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的間期核中；5)快速而且精確的測定拷貝數(shù)，能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞拷貝數(shù)的研究，而且可以在活組織檢查的腫瘤切片上進(jìn)行操作；6)特異性高，可以精確定位，可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。
但是，同時(shí)FISH技術(shù)目前也存在一些問題。主要包括1)FISH檢測染色體異常時(shí)，仍然只能針對特定的一條或幾條染色體；2)探針制備技術(shù)比較困難，探針的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了實(shí)際工作中無窮無盡變化的需要；3)FISH技術(shù)開展起來相對比較昂貴；4)FISH主要用于對植物DNA重復(fù)序列和多拷貝基因家族作圖，而不適宜進(jìn)行單拷貝基因的FISH，這是因?yàn)閱慰截惢虼蠖鄼z出率低，Gustafson等以0.7kb的單拷貝DNA序列作探針，檢出率只有6％左右，并且在染色體上是單點(diǎn)檢出，在如此低的檢出率條件下，如果沒有大量的樣本群體和仔細(xì)的分析統(tǒng)計(jì)，很難區(qū)分信號點(diǎn)和背景雜點(diǎn)。
4，狹線轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)(slot blot analysis)該技術(shù)是Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的快速檢測特異核酸分子的核酸雜交技術(shù)。其基本步驟是通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后再按如同Southern印跡雜交一樣的方式同核酸探針分子進(jìn)行雜交。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中，使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測的核酸樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并且有規(guī)律的排列成線，因此得名。同時(shí)，該技術(shù)也可以用于核酸樣品的定量檢測，通過在實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)加已知其濃度的靶核酸序列作為對照樣品來檢測核酸混合物中某種特殊DNA序列的相對含量，同時(shí)使用光密度測定法也可以對狹線印跡的相應(yīng)雜交信號作定量分析。此方法具有簡便，直觀，快速，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在一般實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行。但是對待測DNA樣品和標(biāo)準(zhǔn)對照質(zhì)粒DNA樣品的純度要求很高，且要求含量測定要精確。
5，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在1996年由美國Applied Biosystems公司推出，它通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)定量PCR中反應(yīng)信號的檢測貫穿于整個反應(yīng)過程，最初DNA分子的量(N0)和Ct值之間的線性-對數(shù)關(guān)系可以通過下列公式來表示Log(N0)＝a-b·CtA和b是常量，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。實(shí)時(shí)PCR定量的線性動力學(xué)范圍為5～7個數(shù)量級，適于高通量和常規(guī)分析；通過對一個內(nèi)源基因進(jìn)行定量可以進(jìn)行相對定量，無需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析；大大減少了PCR后污染的機(jī)會。文獻(xiàn)中有關(guān)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測技術(shù)研究的報(bào)導(dǎo)增長迅速。實(shí)時(shí)熒光PCR一般使用Ct(每個反應(yīng)熒光信號達(dá)到設(shè)定域值所需要的循環(huán)數(shù))定量，Ct與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)成線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
以最常用的TaqMan方法為例，其工作原理為在PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，5’端和3’端分別標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)，如FAM(6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處)等和一個淬滅熒光基團(tuán)，如TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明，熒光發(fā)射峰值在582nm處)等，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，不出現(xiàn)熒光信號變化；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，使淬滅基團(tuán)的淬滅作用被解除，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。其主要優(yōu)點(diǎn)是a.不需要進(jìn)行PCR的后處理，最大限度的減少了操作過程中可能導(dǎo)致的污染；b.快速，便宜；c.避免使用具有危害的放射性同位素；d.僅需要少量的DNA樣品；e.提供一個廣泛的定量動力學(xué)范圍，能對拷貝數(shù)差異較大的不同樣品進(jìn)行精確定量；f.由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用。
本發(fā)明適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，包含編碼油菜高效移動蛋白HMG I/Y基因(high mobility group protein I/Y)、棉花內(nèi)源基因SadI(stearoyl-ACP desaturase)、番茄內(nèi)源基因Lat52和水稻SPS(sucrose phosphate synthase)基因、并根據(jù)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測的外源基因的引物和探針，其中，所述HMG I/Y基因的長度為143個bp的DNA片段，SadI基因的長度為106個bp的DNA片段，Lat52基因的長度為91個bp的DNA片段，水稻SPS基因的長度為81bp的DNA片段。
其中，所述任一項(xiàng)的核苷酸序列具備種內(nèi)一致性，即所有的油菜品種含有HMG I/Y基因，棉花品種含有SadI基因，番茄品種含有Lat52基因，水稻品種含有SPS基因。
所述任一項(xiàng)的核苷酸序列還具備種間特異性，即在其它物種里沒有該基因或該DNA片段。
所述HMG I/Y基因在油菜基因組中的拷貝數(shù)是1；Lat52基因在番茄基因組中拷貝數(shù)是1；SadI基因在棉花基因組中是2拷貝；SPS基因在水稻基因組中是1拷貝。
利用這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，并根據(jù)這些設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測的外源基因的引物和探針，用于定性、定量檢測轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、油菜和水稻轉(zhuǎn)基因成分。
利用參照基因分析外源基因在轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、油菜和水稻中的拷貝數(shù)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過發(fā)掘新的棉花、水稻、油菜和番茄等內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，建立一種快速、有效、高通量的轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因的拷貝數(shù)檢測技術(shù)，利用該技術(shù)可以從眾多轉(zhuǎn)基因植物中高通量篩選低拷貝的轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)，基于拷貝數(shù)快速篩選、鑒定研究，對轉(zhuǎn)基因作物可進(jìn)行快速育種。
利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行定量檢測的方法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)主要通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中外源基因的拷貝數(shù)，同時(shí)確定樣品中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)。通過內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)基因的比例來確定轉(zhuǎn)基因成分在食品中的比例。
檢測前先利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子(待擴(kuò)增的外源和內(nèi)源基因片段連接后構(gòu)建在質(zhì)粒載體上以便較準(zhǔn)確繪出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線)確定陽性標(biāo)準(zhǔn)品中內(nèi)源基因和外源基因的相對比值(T/C；Target/control)值。
相對某一轉(zhuǎn)基因作物品系來說，T/C值是一個比較穩(wěn)定的系數(shù)。它反應(yīng)了外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)之間的比值，主要是由儀器的性能決定的。如果定量PCR儀型號發(fā)生變動，則T/C值需要重新調(diào)校。
檢測樣品時(shí)，利用標(biāo)準(zhǔn)分子確定樣品中外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)的拷貝數(shù)，根據(jù)下列公式即可計(jì)算出樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。
因此，選用具備種間特異性，種內(nèi)一致性，在基因組中拷貝數(shù)較低(幾個拷貝或者單拷貝)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在整個定量過程中顯得尤為重要。
本發(fā)明是根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的三個主要特征，即種內(nèi)非特異性、不同種間的特異性、單拷貝或低拷貝數(shù)，利用生物信息學(xué)、GENBANK和EMBL等數(shù)據(jù)庫、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在棉花、番茄、水稻、油菜中尋找到四個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，分別為棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SAD I、番茄的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因LAT52、水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS、油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMGI/Y。
從上述獲得的棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SAD I、番茄的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因LAT52、水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS、油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMG I/Y，設(shè)計(jì)GC比含量相當(dāng)和擴(kuò)增片段大小相近的Taqman引物和探針，并且優(yōu)化最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。
優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件及體系，建立轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因外源基因拷貝數(shù)的檢測系統(tǒng)。
優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件及體系，建立轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄、水稻中外源基因(如抗生素標(biāo)記基因)的定性，定量PCR檢測系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的三個主要特征種內(nèi)非特異性、不同種間的特異性、單拷貝或低拷貝數(shù)，利用生物信息學(xué)、GENBANK和EMBL等數(shù)據(jù)庫、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在棉花、番茄、水稻、油菜中尋找到4個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，分別為棉花的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SADI、番茄的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因LAT52、水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS和油菜的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMGI/Y。通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行了這些內(nèi)源基因的靈敏度和精確度試驗(yàn)。同時(shí)利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因作為轉(zhuǎn)基因作物拷貝數(shù)恒定的內(nèi)源參照基因建立轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄和水稻中外源基因拷貝數(shù)檢測的高通量、快速的熒光定量PCR分析技術(shù)。同時(shí)也利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因建立適合于轉(zhuǎn)基因棉花、油菜、番茄和水稻中的外源基因的定性、定量PCR檢測方法。


附圖1，HCM I/Y片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。
附圖2，SadI片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。
圖3，LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。
圖4，SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。
圖5，HMGI/Y種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。
圖6，SADI種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。
圖7，LAT52種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。
圖8，SPS種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。
圖9 HMG I/Y種間特異性鑒定結(jié)果照片。
圖10 HMG I/Y蕓薹屬內(nèi)特異性鑒定結(jié)果照片。
圖11 SADI種間特異性鑒定結(jié)果照片。
圖12 LAT52種間特異性鑒定結(jié)果照片。
圖13 SPS種間特異性(禾本科內(nèi))鑒定結(jié)果照片。
圖14 SPS種間特異性鑒定結(jié)果照片。
圖15.SADI定性PCR檢測靈敏度照片。
圖16 SPS定性檢測靈敏度照片。
圖17 HMG I/Y定量靈敏度檢測結(jié)果。
圖18 SADI定量靈敏度檢測結(jié)果。
圖19 SPS定量靈敏度檢測結(jié)果。
圖20 Southern-Blot分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)過程(一).實(shí)驗(yàn)材料1，非轉(zhuǎn)基因植物非轉(zhuǎn)基因棉花，如GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、蘇棉310、保鈴棉1560BG、保鈴棉D(zhuǎn)P410B、保鈴棉32B、保鈴棉33B、保鈴棉99B、顯性無腺體、徐州142、中棉所常規(guī)棉、中棉30等。
非轉(zhuǎn)基因水稻，如寒豐，農(nóng)虎6號，9520，秀水04，申香粳6號，太湖糯，20566，D5黑河愛暉，C43βg94-1，C26 PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一號等。
非轉(zhuǎn)基因番茄，如871、1687、1685、1866、1867、822、麗春、西粉一號、西粉二號、西粉三號、西粉五號、西粉八一號、毛紅801、毛G1號、毛粉802、早豐、中豐、早魁、紅雜14號、紅雜16號、紅雜18號、紅雜20號、紅雜25號等。
非轉(zhuǎn)基因油菜，如滬油12、滬油50、安437、蘇991246、蘇97-2126、蘇油1號、浙雙758、嘉興9308、中雙6號、華農(nóng)大-1以及歐洲品種PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58等。
其他常見的作物，如錦葵科的向日葵；茄科的馬鈴薯、茄子、煙草、辣椒；劍麻；木槿；豆科的大豆、綠豆、紅豆、扁豆、豇豆；禾本科的大麥、小麥、玉米；十字花科的擬南芥；楊梅；人參果；胡蘿卜。
2、酶與試劑植物材料DNA提取試劑盒為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和上海出入境檢驗(yàn)檢疫局聯(lián)合研制的食品DNA抽提試劑盒。
限制性內(nèi)切酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶及其緩沖液購自TakarapGEM-7Zf(+)/Hae III Markers、λDNA/EcoR+Hind III Markers、DL2000 Marker購自華美生物工程公司。
TaqMan探針及引物由上海申友生物技術(shù)公司合成其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。
3、實(shí)驗(yàn)儀器DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(MJ Research Inc.)Rotor-Gene 2000定量PCR儀(Corbett Research，Australia)BECKMAN公司的DUR640核酸和蛋白分析儀DNA測序儀(Applied Biosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)包括暗箱、數(shù)碼照相機(jī)、計(jì)算機(jī)、掃描儀、噴墨打印機(jī)、光敏打印機(jī)、Tianon UV-2000紫外分析儀、Gis凝膠圖象分析軟件(上海天能公司)其他儀器包括離心機(jī)，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，天平等。
(二).實(shí)驗(yàn)方法及過程1.候選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的查找轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測中需要使用的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因必須符合3個條件種內(nèi)非特異性、種間特異性、低拷貝性(為提高檢測靈敏度，最好為單拷貝基因)。首先通過查閱文獻(xiàn)來選取相應(yīng)的單拷貝基因，其次通過網(wǎng)上BLAST來確定該基因與其他作物的同源性，最后通過定量與定性PCR檢測和Southern檢測來確定該內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的可用性。
2.植物DNA的提取與檢測1)植物DNA的提取a)取適量的水稻樣品放在研缽中，加入液氮將樣品研磨成粉末，稱取約70mg-100mg磨碎的樣品轉(zhuǎn)入1.5ml的Eppendorf管中；b)視材料量的多少，加入600-700ul已預(yù)熱的Buffer A，輕輕混勻后，65℃水浴保溫1小時(shí)，期間間或振蕩混勻；c)在管中加入等體積酚/氯仿(600-700μl)，上下顛倒充分混勻，靜置抽提10min；d)12000rpm×10分鐘離心，吸取上清到一新的Eppendorf管中；e)加入與上清等體積的異丙醇(約600μl)，混勻，常溫放置10min后，12000×g離心10min，去上清，保留沉淀；f)在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用槍頭將其充分混勻后，于37℃放置約1小時(shí)；
g)取出后補(bǔ)加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混勻，靜置片刻；h)12000rpmg×5min離心，取上清(約180μl)，加入1/10體積3M NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃放置30min；i)12000rpm×10min離心，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm×5min離心，棄上清，室溫晾干，溶于50μl無菌ddH2O中。
2)DNA檢測取3μl提取的DNA溶液電泳，選用的電泳膠為1％的瓊脂糖凝膠，根據(jù)其亮度和擴(kuò)散程度來判斷DNA的質(zhì)量。利用紫外分光光度計(jì)測定所提DNA的濃度與純度。
3.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及外源基因引物、探針的設(shè)計(jì)利用Primer Primier5.0和Beacon Designer2.0軟件設(shè)計(jì)針對油菜，棉花，番茄，水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因以及外源HPT，GUS，NPTII基因的特異性引物和探針。引物和探針設(shè)計(jì)時(shí)盡量使他們的動力學(xué)性質(zhì)相似，采取的原則是不發(fā)生錯配、盡可能的減少引物自身及相互間形成引物二聚體的可能，選擇3’端穩(wěn)定性較5’端穩(wěn)定性低的引物，引物的GC％為40％～65％，Tm值在50℃-65℃，此外探針的Tm值應(yīng)高于引物的Tm值約10℃。根據(jù)上述原則選擇合適的引物和探針，必要時(shí)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行修改，見下列表1、表2。
表1為定性、定量PCR檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物和探針序列。
表2為定性、定量PCR檢測的外源基因的引物和探針序列。
表1名稱核苷酸序列(5’-3’) 長度(bp)位置(bp)SADFCCAAAGGAGGTGCCTGTTCA 20 4834-4853SAD I SADRTTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC 24 4917-4940SADPTCACCCACTCCATGCCGCCTCACA 24 4856-4879LATFAGACCACGAGAACGATATTTGC 22 1384-1406LAT52 LATRTTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA 24 1452-1475LATPCTCTTTGCAGTCCTCCCTTGGGCT 24 1424-1448SPSFTTGCGCCTGAACGGATAT 18 1055-1072SPS SPSRCGGTTGATCTTTTCGGGATG 20 1116-1135SPSPGACGCACGGACGGCTCGGA 19 1096-1114HMGFGGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG 22 449-470HMG I/Y HMGRCTTCTTCGGCGGTCGTCCAC 20 528-547HMGPCGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT 24 495-518表2名稱核苷酸序列(5’-3’) 長度(bp)GUSFTTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATC 26GUSGUSRCACCACGGTGATATCGTCCAC 21GUSPAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTG 27HPTFCTATTTCTTTGCCCTCGGACGA 22HPTHPTRGGACCGATGGCTGTGTAGAAG 21HPTPCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCC24NPTFAAGATGGATTGCACGCAGGTT 21NPTII NPTRAGAGCAGCCGATTGTCTGTTG 21NPTPCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACC284.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定性檢測鑒定1)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種內(nèi)非特異性鑒定
HMG I/Y種內(nèi)非特異性鑒定以國產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因品種滬油12、滬油50、安437、蘇991246、蘇97-2126、.蘇油1號、浙雙758、嘉興9308、中雙6號、華農(nóng)大-1以及歐洲品種PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的HMCF/HMCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
SadI種內(nèi)非特異性鑒定以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、蘇棉310、保鈴棉1560BG、保鈴棉D(zhuǎn)P410B、保鈴棉32B、保鈴棉33B、保鈴棉99B、顯性無腺體、徐州142、中棉所常規(guī)棉、中棉30基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的SADF/SADR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
Lat52種內(nèi)非特異性鑒定以番茄品種871、1687、1685、1866、1867、822、麗春、西粉一號、西粉二號、西粉三號、西粉五號、西粉八一號、毛紅801、毛G1號、毛粉802、早豐、中豐、早魁、紅雜14號、紅雜16號、紅雜18號、紅雜20號、紅雜25號基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的LATF/LATR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
SPS種內(nèi)非特異性鑒定以水稻品種寒豐，農(nóng)虎6號，9520，秀水04，申香粳6號，太湖糯，20566，D5黑河愛暉，C43βg94-1，C26 PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一號基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種間特異性鑒定HMG I/Y種間特異性鑒定取十字花科的油菜、擬南芥，茄科的煙草、茄子、番茄、尖椒，傘形花科的蘿卜，豆科的扁豆、角豆，薔薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麥、大麥的基因組DNA為PCR反應(yīng)為模板，取十字花科蕓苔屬內(nèi)種大白菜、小白菜、甘藍(lán)、花椰菜的基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的HMCF/HMCR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
SadI種間特異性鑒定選用錦葵科的棉花、向日葵；茄科的馬鈴薯，番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；木槿；豆科的大豆、綠豆、紅豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；人參果；胡蘿卜基因組DNA作為PCR反應(yīng)膜板，選用相應(yīng)的SADF/SADR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
Lat52種間特異性鑒定取十字花科的油菜、擬南芥，茄科的煙草、茄子、番茄、尖椒，傘形花科的蘿卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，薔薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麥、大麥的基因組DNA為PCR反應(yīng)為模板，選用相應(yīng)的LATF/LATR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
SPS種間特異性鑒定選用錦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；豆科的大豆、綠豆、禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；胡蘿卜基因組DNA作為PCR反應(yīng)膜板，選用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行35個循環(huán)；最后，72℃延伸5分鐘后結(jié)束，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
5.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定量檢測鑒定1)定量反應(yīng)體系的優(yōu)化建立為了獲得高效靈敏的定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)，我們設(shè)計(jì)了不同引物探針濃度(引物初始濃度為25pM，探針初始濃度為10pM)比例的定量PCR反應(yīng)體系(見表3)，通過相同的定量PCR反應(yīng)條件，篩選熒光值上升較快，熒光信號強(qiáng)并且反應(yīng)重復(fù)性好的體系作為定量檢測的反應(yīng)體系。
表3為優(yōu)化定量反應(yīng)體系不同引物探針濃度表(單位ul)。
表3 單位ul 2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種內(nèi)非特異性鑒定
HMG I/Y種內(nèi)非特異性鑒定以國產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因品種滬油12、滬油50、安437、蘇991246、蘇97-2126、.蘇油1號、浙雙758、嘉興9308、中雙6號、華農(nóng)大-1以及歐洲品種PGCP15、PGCH23、PGCH55、PGCH57、PGCH58基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的HMCF/HMCR引物對和HCM PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
SadI種內(nèi)非特異性鑒定以GK12、SGK321、GK19、GK22、9409、蘇棉310、保鈴棉1560BG、保鈴棉D(zhuǎn)P410B、保鈴棉32B、保鈴棉33B、保鈴棉99B、顯性無腺體、徐州142、中棉所常規(guī)棉、中棉30基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的SADF/SADR引物對和SAD PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
Lat52種內(nèi)非特異性鑒定以番茄品種871、1687、1685、1866、1867、822、麗春、西粉一號、西粉二號、西粉三號、西粉五號、西粉八一號、毛紅801、毛G1號、毛粉802、早豐、中豐、早魁、紅雜14號、紅雜16號、紅雜18號、紅雜20號、紅雜25號基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的LATF/LATR引物對和LAT PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
SPS種內(nèi)非特異性鑒定以水稻品種寒豐，農(nóng)虎6號，9520，秀水04，申香粳6號，太湖糯，20566，D5黑河愛暉，C43βg94-1，C26 PR106，D20BaSmati，C21中育早18，D57kholt marshi，P2C1花育一號基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對和SPS PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
3)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種間特異性鑒定HMG I/Y種間特異性鑒定取十字花科的油菜、擬南芥，茄科的煙草、茄子、番茄、尖椒，傘形花科的蘿卜，豆科的扁豆、角豆，薔薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麥、大麥的基因組DNA為PCR反應(yīng)為模板，取十字花科蕓苔屬內(nèi)種大白菜、小白菜、甘藍(lán)、花椰菜的基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，選用相應(yīng)的HMCF/HMCR引物對和HCM PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94變性30秒，60退火20秒，72延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
SadI種間特異性鑒定選用錦葵科的棉花、向日葵；茄科的馬鈴薯，番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；木槿；豆科的大豆、綠豆、紅豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；人參果；胡蘿卜基因組DNA作為PCR反應(yīng)膜板，選用相應(yīng)的SADF/SADR引物對和SAD PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
Lat52種間特異性鑒定取十字花科的油菜、擬南芥，茄科的煙草、茄子、番茄、尖椒，傘形花科的蘿卜，豆科的扁豆、角豆、大豆、，薔薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、小麥、大麥的基因組DNA為PCR反應(yīng)為模板，選用相應(yīng)的LATF/LATR引物對和LAT PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
SPS種間特異性鑒定選用錦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；豆科的大豆、綠豆、禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；胡蘿卜基因組DNA作為PCR反應(yīng)膜板，選用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對和SPS PROBE按照優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).其PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘后，進(jìn)入PCR反應(yīng)循環(huán)94℃變性30秒，5℃退火30秒，72℃延伸30秒；共進(jìn)行45個循環(huán)。
6.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性、定量檢測靈敏度和精確度實(shí)驗(yàn)1)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性檢測靈敏度SadI定性PCR檢測靈敏度非轉(zhuǎn)基因棉花DNA以TE稀釋為下列濃度100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng/μl，每個定性PCR反應(yīng)取1μl，使反應(yīng)中的DNA含量分別為100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng。利用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對和定性鑒定的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
SPS定性檢測靈敏度非轉(zhuǎn)基因水稻DNA以TE稀釋為下列濃度500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，每個定性PCR反應(yīng)取1μl，使反應(yīng)中的DNA含量分別為500，50，5，0.5，0.05，0.005ng。利用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對和定性鑒定的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后吸取10μl產(chǎn)物在2％的瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測。
2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量檢測靈敏度SadI定量檢測靈敏度非轉(zhuǎn)基因棉花DNA以TE稀釋為下列濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每個定量PCR反應(yīng)取1μl，使反應(yīng)中的DNA含量分別為5100、10、1、0.1、0.01、0.001ng。利用相應(yīng)的SADF/SADR引物對和SAD PROBE利用定量鑒定的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
SPS定量檢測靈敏度非轉(zhuǎn)基因水稻DNA以TE稀釋為下列濃度50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/ul，每個定量PCR反應(yīng)取1μl，使反應(yīng)中的DNA含量分別為50，5，0.5，0.05，0.005，0.0025ng。利用相應(yīng)的SPSF/SPSR引物對和SPS PROBE利用定量鑒定的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。
3)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量檢測重復(fù)性和重演性實(shí)驗(yàn)上述油菜，棉花，番茄，SPS內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
7.Southern檢測鑒定內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)1)非轉(zhuǎn)基因油菜、棉花、番茄，水稻基因組DNA的提取用CTAB法抽提油菜、棉花、番茄和水稻的DNA，具體方法如下所示取40g材料在液氮中磨成粉末。將所得粉末移至預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，立即加入20ml預(yù)熱至65℃的2×CTAB提取緩沖液，充分混勻，65℃水浴保溫15-30分鐘，期間輕輕搖動?；旌衔锢鋮s后加入等體積的的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕搖使管內(nèi)混合物成乳濁液，室溫12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清加入0.01體積的RNAase貯液，混勻后37℃保溫30分鐘。加入0.7體積的異丙醇室溫沉淀15分鐘，用玻璃鉤鉤出白色絮狀沉淀，放入76％乙醇、0.2M NaAc的溶液中冰上放置20分鐘，再將沉淀轉(zhuǎn)移至70％乙醇中旋轉(zhuǎn)5分鐘，離心棄上清，再加入70％乙醇。將DNA轉(zhuǎn)移至另一干凈管中，空氣干燥15分鐘，加入適量TE溶解。4℃儲存?zhèn)溆谩?br> 2)基因組DNA的純化將上述DNA溶液加入等體積水稀釋后再加入2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M NaAc(PH＝5.2)，溫和地混勻，-20℃靜置沉淀4小時(shí)，13000轉(zhuǎn)，4℃離心20分鐘。沉淀用70％的乙醇洗滌后凍干溶解于無菌重蒸水中，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度及純度。
3)非轉(zhuǎn)基因油菜、棉花、番茄，水稻基因組DNA酶切、電泳、變性、中和和轉(zhuǎn)膜。
酶切取油菜、棉花、番茄基因組DNA 10μg用EcoRI(Takara公司)酶切，水稻基因組DNA 10μg用HindIII(Takara公司)酶切，一次加入10×Buffer10μl，限制性內(nèi)切酶5μl，用無菌水補(bǔ)至100μl，混合均勻后37℃酶切過夜(10-12小時(shí))；微型凝膠電泳酶切鑒定，若呈現(xiàn)一條連續(xù)地的、熒光由深至淺的均勻條帶，則說明酶切結(jié)果良好。
電泳凝膠制備采用0.8％瓊脂糖，電泳采用1V/cm，電泳約10-12小時(shí)或者過夜。
變性將凝膠置于變性溶液(含1.5M NaCl，0.5M NaOH)中于旋轉(zhuǎn)平臺上振搖浸泡45分鐘使DNA變性，之后用重蒸水大致漂洗凝膠中和將凝膠置于中和液(1M Tris-HCl(Ph 7.4)，1.5M NaCl)中于旋轉(zhuǎn)平臺上振搖中和，15分鐘以后更換一次中和液繼續(xù)溫和震蕩30分鐘。
轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備一張Whatman濾紙包住一個玻璃平板，將其放于一方磁盤中的平臺上，使濾紙下緣浸入轉(zhuǎn)移緩沖液(10×SSC)中。待濾紙全部浸透后用玻璃棒趕走濾紙與玻璃板之間的氣泡。裁出一張稍大于凝膠的硝酸纖維素慮膜，用重蒸水徹底浸潤后改用20×SSC浸泡5分鐘以上。在慮膜上做與凝膠相應(yīng)的標(biāo)記。從中和液中取出凝膠，背面朝上放在平臺上濕的3MM濾紙上，并趕走氣泡。用保鮮膜蓋住凝膠四周以防盤內(nèi)液體直接從邊緣滲透到上層紙巾。將浸潤的硝酸纖維素膜覆蓋住凝膠并趕走氣泡，其上再蓋上兩張與凝膠大小相同并用2×SSC浸潤的的3MM濾紙并趕走氣泡。最后再在上面放一厚疊裁好的紙巾，紙巾上壓一塊玻璃板，板上壓一重物(如500克的砝碼)以形成液體自流池經(jīng)凝膠向硝酸纖維素膜上行的流路，使凝膠中變性的DNA被洗脫遷移并吸附至纖維素濾膜上。維持液體毛細(xì)遷移8-24小時(shí)后，每當(dāng)紙巾浸濕后須更換紙巾。
烤膜轉(zhuǎn)移結(jié)束后揭去紙巾及上面的3MM濾紙，翻轉(zhuǎn)凝膠和纖維素濾膜，放在一張干的3MM濾紙上。用鉛筆透過凝膠標(biāo)記出加樣孔在纖維素膜上的位置，之后剝離棄掉凝膠。用6×SSC溶液室溫浸泡濾膜5分鐘以除去濾膜上沾有的凝膠碎片。取出濾膜置紙巾上室溫晾干30分鐘以上，之后用兩張3MM濾紙夾住濾膜在真空爐中80℃干烤2小時(shí)。
4)用于Southern印跡分析的DNA探針的標(biāo)記，雜交，洗膜，顯影預(yù)雜交按每平方厘米硝酸纖維素濾膜0.2毫升用量配制適量SDS-磷酸預(yù)雜交液。將烤干的濾膜浮于6×SSC液面上待其完全濕潤后沉入液面內(nèi)泡2分鐘。然后將濕濾膜裝入雜交桶中中，加入配好的預(yù)雜交液，趕盡濾膜與瓶壁接觸處的氣泡，置42℃雜交爐中2小時(shí)。
探針標(biāo)記用隨機(jī)引物法標(biāo)記探針，試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。以定性檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，制備32P標(biāo)記的探針。具體方法為取2.5ng模板DNA和2μl隨機(jī)引物補(bǔ)水至終體積為，95℃變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，然后依次加入2.5μl緩沖液，2.5μl dNTP溶液，1μl Klenow酶(約5U)和3μl[α-32P]dCTP，總體積為25μl，充分混勻后于37℃反應(yīng)30分鐘以上，95℃變性探針5分鐘，置于冰上約5分鐘后，加入預(yù)雜交液中按所需的雜交溫度進(jìn)行雜交反應(yīng)18-24小時(shí)。
洗膜雜交完畢后取出雜交桶，倒棄雜交液至廢物缸中，往雜交桶中倒入一定量的0.2*SSC/0.1％SDS洗膜液，在室溫下輕輕振蕩5-10分鐘，期間用monitor檢測雜交信號，更換洗膜液，直至背景信號基本洗凈，隨后取出濾膜放于紙巾上吸去大部分液體。
壓片濾膜外包裹一張保鮮膜，放入曝光夾中壓入X光片及增感屏，置-70℃曝光適當(dāng)時(shí)間(幾小時(shí)至幾天)。
顯影在暗室中將X光片放入顯影液內(nèi)，輕輕晃動約5-10分鐘，待出現(xiàn)相應(yīng)的圖象結(jié)果后，將X光片轉(zhuǎn)入定影液中定影，即得最終的Southern結(jié)果(三).實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.候選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的查找及網(wǎng)上Blast結(jié)果根據(jù)T.Masek，et al(2000)的報(bào)道，編碼油菜high-mobility-group HMG I/Y protein的HCM I/Y基因?yàn)橐粏慰截悆?nèi)源基因(GeneBank NO.AF127919)，其全基因DNA序列見附圖1。圖1 HCM I/Y片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。其中，加下劃線部分為PCR引物位置，粗體部分為定量PCR探針位置。
將該基因在GENEBANK上分析結(jié)果表明找不到連續(xù)50bp與其同源的DNA的DNA片段，我們選擇了417-559之間長度為143個bp的特異性DNA片段作為內(nèi)標(biāo)。
根據(jù)Qin Liu，et al的報(bào)道，編碼棉花stearoyl-ACPdesaturase的SAD1基因?yàn)橐粏慰截悆?nèi)源基因(Genebank No.X95988)，我們選擇的DNA序列見圖2，圖2 SadI片段的核苷酸序列及定性定量PGR引物和探針核苷酸序列和位置。其中，加下劃線部分為PCR引物位置，粗體部分為定量PCR探針位置。
將該基因在GENEBANK上進(jìn)行BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，找不到連續(xù)50bp與其同源的DNA的DNA片段，我們選擇了4834-4940之間長度為106個bp的特異性DNA片段作為內(nèi)標(biāo)。
根據(jù)Twell D.，et al(1989)的報(bào)道，番茄的LAT52基因?yàn)橐粏慰截悆?nèi)源基因(GeneBank NO.19263)，其全基因DNA序列見附圖3。圖3LAT52片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。其中，加下劃線部分為PCR引物位置，粗體部分為定量PCR探針位置。
將該基因在GENEBANK上進(jìn)行BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，找不到連續(xù)50bp與其同源的DNA的DNA片段，我們選擇了1385-1476之間長度為91個bp的特異性DNA片段作為內(nèi)標(biāo)。
根據(jù)Juan Jose Valdez-Alarcon et al(1996)的報(bào)道，編碼水稻sucrose phosphate synthase的SPS基因?yàn)橐粏慰截悆?nèi)源基因(GeneBank NO.U33175)，其全基因DNA序列為見附圖4。圖4 SPS片段的核苷酸序列及定性定量PCR引物和探針核苷酸序列和位置。其中，加下劃線部分為PCR引物位置，粗體部分為定量PCR探針位置。
將該基因在GENEBANK上進(jìn)行BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在800bp-1600bp為水稻特異性片段，我們在1055-1135bp處設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針。
2.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定性檢測鑒定1)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種內(nèi)非特異性鑒定
HMGI/Y種內(nèi)非特異性鑒定不同品種的油菜在設(shè)計(jì)的特異性HMCF/HMCR引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示在15個不同品種中都能擴(kuò)增出大小為146bp、專一的條帶，條帶大小與預(yù)期的一致。說明在油菜的不同品種中都含有候選基因HMCI/Y；從而說明油菜HMC I/Y基因具有種內(nèi)的非特異性。如圖5，圖5 HMGI/Y種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。其中，1.滬油12；2.滬油50；3.安437；4.蘇991246；5.蘇97-2126；6.蘇油1號；7.浙雙758；8.嘉興9308；9.中雙6號；10.華農(nóng)大-1；11.PGCP15；12.PGCH23；13.PGCH55；14.PGCH57；15.PGCH58；MW表示pGEM-7Zf(+)/Hae III。
SADI種內(nèi)非特異性鑒定不同品種的水稻在設(shè)計(jì)的特異性SADF/SADR引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示在15個不同品種中都能擴(kuò)增出大小為107bp、專一的條帶，條帶大小與預(yù)期的一致。說明在棉花的不同品種中都含有候選基因SADI；從而說明棉花SADI基因具有種內(nèi)的非特異性。見圖6，圖6 SADI種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果照片。M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.為空白對照；2.GK12；3.SGK321；4.GK19；5.GK22；6.9409；7.蘇棉310；8.保鈴棉1560BG；9.保鈴棉D(zhuǎn)P410B；10.保鈴棉32B；11.保鈴棉33B；12.保鈴棉99B；13.顯性無腺體；14.徐州142；15.中棉所常規(guī)棉；16.中棉30。
LAT52種內(nèi)非特異性鑒定不同品種的番茄在設(shè)計(jì)的特異性LATF/LATR引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示在23個不同品種中都能擴(kuò)增出大小為92bp、專一的條帶，條帶大小與預(yù)期的一致。說明在番茄的不同品種中都含有候選基因LAT52；從而說明番茄LAT52基因具有種內(nèi)的非特異性。見圖7，圖7 LAT52種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1.為空白對照；2.871；3.1687；4.1685；5.1866；6.1867；7.822；8.麗春；9.西粉一號；10.西粉二號；11.西粉三號；12.西粉五號；13.西粉八一號；14.毛紅801；15.毛G1號；16.毛粉802；17.早豐；18.中豐；19.早魁；20.紅雜14號；21.紅雜16號；22.紅雜18號；23.紅雜20號；24.紅雜25號。
SDS種內(nèi)非特異性鑒定不同品種的水稻在設(shè)計(jì)的特異性SPSF/SPSR引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳顯示在15個不同品種中都能擴(kuò)增出大小為81bp、專一的條帶，條帶大小與預(yù)期的一致。說明在水稻的不同品種中都含有候選基因SPS；從而說明水稻SPS基因具有種內(nèi)的非特異性。見圖8。圖8 SDS種內(nèi)非特異性鑒定結(jié)果。其中，M表示MARKER，1.寒豐(晚粳中熟)；2.農(nóng)虎6號(晚粳遲熟)；3.9520(晚粳早熟)；4.秀水04(晚粳中熟)；5.申香粳；6.號(中粳中熟，香稻)；7.太湖糯(晚粳糯)；8.20566(日本稻粳稻)；9.D5黑河愛暉(秈稻)；10.C43βg94-1(秈稻)；11.C26 PR106(秈稻)；12.D20BaSmati(秈稻，爪哇型)；13.C21中育早18(秈稻)；14.D57kholt marshi(秈稻)；15.P2C1花育一號(粳稻)。
2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種間特異性鑒定HMG I/Y種間特異性鑒定常見的植物和與油菜親緣關(guān)系較近的植物(十字花科的油菜、擬南芥、大白菜、小白菜、甘藍(lán)、花椰菜，茄科的煙草、茄子、番茄、尖椒，傘形花科的胡蘿卜，豆科的扁豆、角豆，薔薇科的梅，禾本科的水稻、玉米、大豆、小麥、大麥)在特異性引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物電泳分析顯示在常見植物和親緣關(guān)系較近的植物中沒有擴(kuò)增出特異性的條帶，而陽性樣品中有大小為146bp、專一的條帶，說明在常見的植物和與油菜親緣關(guān)系較近的植物中不含有油菜的HMC基因和與油菜HMC基因同源性較高的基因。因此，證明油菜HMC基因具有種間的特異性。見圖9和圖10，其中，圖9 HMG I/Y種間特異性鑒定結(jié)果，MW表示MARKER；1。轉(zhuǎn)基因油菜(滬油12)；2.擬南芥；3.胡蘿卜；4.茄子；5.甜椒；6.番茄；7.尖椒；8.煙草；9.梅；10.扁豆；11.角豆；12.玉米；13.大豆；14.寧麥；15.大麥；16.水稻。圖10 HMG I/Y蕓薹屬內(nèi)特異性鑒定結(jié)果。其中，MW表示MARKER；1.轉(zhuǎn)基因油菜(滬油12)；2.上海青菜-超矮青；3.甘藍(lán)-早夏16號；4.大白菜-夏薯1號；5.小白菜-雜交一代；6.甘藍(lán)-夏冠；7.花椰菜-一代金光。
SADI種間特異性鑒定常見的植物和與棉花親緣關(guān)系較近的植物(錦葵科的棉花、向日葵；茄科的馬鈴薯，番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；木槿；豆科的大豆、綠豆、紅豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；人參果；胡蘿卜)在特異性引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物電泳分析顯示在常見植物和親緣關(guān)系較近的植物中沒有擴(kuò)增出特異性的條帶，而陽性樣品中有大小為106bp、專一的條帶，說明在常見的植物和與棉花親緣關(guān)系較近的植物中不含有棉花的SADI基因和與棉花SADI基因同源性較高的基因。因此，證明棉花SADI基因具有種間的特異性。見圖11，圖11 SADI種間特異性鑒定結(jié)果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1棉花；泳道2~23分別為馬鈴薯；番茄；劍麻；木槿；大豆；綠豆；紅豆；扁豆；豇豆；水稻；大麥；小麥；玉米；油菜；茄子；煙草；擬南芥；辣椒；楊梅；向日葵；人參果；胡蘿卜。
LAT52種間特異性鑒定常見的植物和與番茄親緣關(guān)系較近的植物(錦葵科的棉花、向日葵；茄科的馬鈴薯、茄子、煙草、辣椒；劍麻；木槿；豆科的大豆、綠豆、紅豆、扁豆、豇豆；禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；人參果；胡蘿卜)在特異性引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物電泳分析顯示在常見植物和親緣關(guān)系較近的植物中沒有擴(kuò)增出特異性的條帶，而陽性樣品中有大小為91bp、專一的條帶，說明在常見的植物和與番茄親緣關(guān)系較近的植物中不含有番茄的LAT52基因和與番茄LAT52基因同源性較高的基因。因此，證明番茄LAT52基因具有種間的特異性。見圖12，圖12 LAT52種間特異性鑒定結(jié)果。其中，M表示Marker(pGEM-7Zf(+)/Hae III)；1番茄；泳道2~23分別為馬鈴薯；棉花；劍麻；木槿；大豆；綠豆；紅豆；扁豆；豇豆；水稻；大麥；小麥；玉米；油菜；茄子；煙草；擬南芥；辣椒；楊梅；向日葵；人參果；胡蘿卜。
SPS種間特異性鑒定常見的植物和與水稻親緣關(guān)系較近的植物(錦葵科的棉花、向日葵；茄科的番茄、茄子、煙草、辣椒；劍麻；豆科的大豆、綠豆、禾本科的水稻、大麥、小麥、玉米；十字花科的油菜、擬南芥；楊梅；胡蘿卜)在特異性SPSF/SPSR引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR產(chǎn)物電泳分析顯示在常見植物和親緣關(guān)系較近的植物中沒有擴(kuò)增出特異性的條帶，而陽性樣品中有大小為81bp、專一的條帶，說明在常見的植物和與水稻親緣關(guān)系較近的植物中不含有水稻的SPS基因和與水稻SPS基因同源性較高的基因。因此，證明水稻SPS基因具有種間的特異性。見圖13和圖14。圖13 SPS種間特異性(禾本科內(nèi))鑒定結(jié)果。M表示MARKER，1水稻2小麥3大麥4玉米。圖14 SPS種間特異性鑒定結(jié)果。M表示MARKER 1.水稻2.煙草3.大豆4劍麻5.油菜6.番茄7.葵花8.胡蘿卜9.茄子10.辣椒11.綠豆12.擬南芥13.梅。
3.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定量檢測鑒定1)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量反應(yīng)優(yōu)化條件根據(jù)不同引物探針濃度配比(表3)的定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行定量反應(yīng)，我們選出了熒光值上升快，信號強(qiáng)并且重復(fù)性好的反應(yīng)體系進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定量檢測鑒定以及外源基因拷貝數(shù)的測定(表4)表4內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果(單位ul)

2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種內(nèi)非特異性定量鑒定分別選用15個不同品種的油菜，棉花，水稻和23個不同品種的番茄DNA作為模板，選用相對應(yīng)的引物，探針，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示油菜，棉花，番茄，水稻的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異性的引物和探針在不同品種的油菜，棉花，番茄，水稻中均能分別檢測到相似的熒光信號，由此可以說明HMC I/Y基因在油菜品種中，SADI基因在棉花品種中，LAT52基因在番茄品種中，SPS基因在水稻品種中均具有種內(nèi)的非特異性。
3)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因種間特異性定量鑒定分別選用油菜，棉花，番茄，水稻和其他與之具有親緣關(guān)系或者常見的植物DNA作為模板，選用相對應(yīng)的引物，探針，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示針對油菜HMC I/Y設(shè)計(jì)的引物探針只能擴(kuò)增油菜基因組DNA，針對棉花SADI設(shè)計(jì)的引物探針只能擴(kuò)增棉花基因組DNA，針對番茄LAT52設(shè)計(jì)的引物探針只能擴(kuò)增番茄基因組DNA，針對水稻SPS基因設(shè)計(jì)的引物探針只能擴(kuò)增水稻基因組DNA，獲得熒光信號，由此可以說明油菜HMC I/Y基因，棉花SADI基因，番茄LAT52基因，水稻SPS基因均具有種間的特異性。
4.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性、定量PCR檢測靈敏度和精確度實(shí)驗(yàn)1)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性檢測靈敏度SADI定性檢測靈敏度以非轉(zhuǎn)基因棉花DNA作為模板，用TE將DNA濃度稀釋為100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl不同的梯度，各取1μl進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示該定性PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.1ng.(圖15)。圖15.SADI定性PCR檢測靈敏度。其中，M表示MARKER；1-9分別表示DNA含量為100，50，10，5，1，0.5，0.1，0.01，0.001ng的PCR反應(yīng)結(jié)果。
SPS定性檢測靈敏度以非轉(zhuǎn)基因水稻為模板DNA，用TE將DNA濃度稀釋為500、50、5、0.5、0.05、0.005ng/μl，各取1μl進(jìn)行反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示該定性PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.05ng，見圖16。圖16 SPS定性檢測靈敏度。其中，M表示DL2000 MARKER，1500ng 252ng 35ng 40.50ng 50.05ng 60.005ng 7水對照。
2)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定量檢測靈敏度HMG I/Y定量檢測靈敏度以非轉(zhuǎn)基因油菜DNA為模板，用TE稀釋成下列濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每個定量PCR反應(yīng)取1μl，定量檢測結(jié)果顯示該定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.01ng。見圖17，圖17HMG I/Y定量靈敏度檢測結(jié)果。
SADI定量檢測靈敏度以非轉(zhuǎn)基因棉花DNA為模板，用TE稀釋成下列濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001ng/μl，每個定量PCR反應(yīng)取1μl，定量檢測結(jié)果顯示該定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.01ng。見圖18SADI定量靈敏度檢測結(jié)果。
SPS定量檢測靈敏度以非轉(zhuǎn)基因水稻DNA為模板，以TE稀釋成下列濃度50、5、0.5、0.05、0.005、0.0025ng/μl，每個定量PCR反應(yīng)取1μl，定量檢測結(jié)果顯示該定量PGR反應(yīng)系統(tǒng)的檢測靈敏度為0.005ng。見圖19SPS定量靈敏度檢測結(jié)果。
5.Southern檢測結(jié)果
Southern雜交結(jié)果顯示我們所選用的油菜HMG I/Y基因，水稻SPS基因，棉花SADI基因以及番茄LAT52基因?yàn)橐粏慰截惖膬?nèi)源基因，具有種內(nèi)一致性的特點(diǎn)。見圖20，油菜HMG I/Y Southern檢測結(jié)果。Southern-Blot分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)。其中，1.滬油12；2.滬油50；3.安437；4.蘇991246；5.蘇97-2126；6.蘇油1號；7.浙雙758；8.嘉興9308；9.中雙6號；10.華農(nóng)大-1。
6.外源基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果1)外源GUS，HPT，NPTII基因定量反應(yīng)條件優(yōu)化根據(jù)不同引物探針濃度配比(表3)的定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行定量反應(yīng)，我們選出了熒光值上升快，信號強(qiáng)并且重復(fù)性好的反應(yīng)體系進(jìn)行外源基因拷貝數(shù)的測定。見表5。
表5外源定量反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果(單位ul)

2)轉(zhuǎn)基因水稻外源GUS，HPT基因拷貝數(shù)測定，見表6、表7。
表6轉(zhuǎn)基因水稻外源HPT基因拷貝數(shù)測定


表7轉(zhuǎn)基因水稻外源GUS基因拷貝數(shù)測定


3)轉(zhuǎn)基因油菜外源GUS，NPTII基因拷貝數(shù)檢測，見表8、表9。
表8轉(zhuǎn)基因油菜外源GUS基因拷貝數(shù)測定


表9轉(zhuǎn)基因棉花外源NPTII基因拷貝數(shù)測定

權(quán)利要求
1.適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，包含編碼油菜高效移動蛋白HMG I/Y基因(high mobility group protein I/Y)、棉花內(nèi)源基因SadI(stearoyl-ACP desaturase)、番茄內(nèi)源基因Lat52和水稻SPS(sucrose phosphate synthase)基因、并根據(jù)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測的外源基因的引物和探針，其中，所述HMG I/Y基因的長度為143個bp的DNA片段，SadI基因的長度為106個bp的DNA片段，Lat52基因的長度為91個bp的DNA片段，水稻SPS基因的長度為81bp的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，特征在于所述任一項(xiàng)的核苷酸序列具備種內(nèi)一致性，即所有的油菜品種含有HMG I/Y基因，棉花品種含有SadI基因，番茄品種含有Lat52基因，水稻品種含有SPS基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，特征在于所述任一項(xiàng)的核苷酸序列還具備種間特異性，即在其它物種里沒有該基因或該DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，特征在于所述HMG I/Y基因在油菜基因組中的拷貝數(shù)是1；Lat52基因在番茄基因組中拷貝數(shù)是1；SadI基因在棉花基因組中是2拷貝；SPS基因在水稻基因組中是1拷貝。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，特征在于利用這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，并根據(jù)這些設(shè)計(jì)定性、定量PCR檢測的外源基因的引物和探針，用于定性、定量檢測轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、油菜和水稻轉(zhuǎn)基因成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的適合轉(zhuǎn)基因棉花等外源基因檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的應(yīng)用，特征在于利用參照基因分析外源基因在轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、油菜和水稻中的拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及適合于轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、水稻、油菜外源基因定性、定量PCR檢測及拷貝數(shù)分析的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其應(yīng)用。本發(fā)明依據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的種內(nèi)非特異性、種間特異性、單拷貝或低拷貝數(shù)，通過生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在棉花、番茄、水稻和油菜中尋找到4個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，分別為棉花的SADI、番茄的LAT52、水稻的SPS和油菜的HMGI/Y基因。應(yīng)用PCR方法進(jìn)行了這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的檢測靈敏度和精確度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)依據(jù)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因分別建立了轉(zhuǎn)基因棉花、番茄、水稻和油菜外源基因的定性、定量PCR檢測系統(tǒng)；根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的恒定拷貝數(shù)，建立轉(zhuǎn)基因水稻、油菜、棉花、番茄的外源基因拷貝數(shù)的熒光定量PCR檢測分析平臺。
文檔編號C12Q1/68GK1557966SQ200410016060
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月18日
發(fā)明者張大兵, 梁婉琪, 賈軍偉, 蘇振洪, 楊立桃, 丁嘉羽, 翁海波, 潘愛虎 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心