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一種氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法與流程

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一種氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明屬于藥品檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法。



背景技術(shù):

人體維持生命活動(dòng)需要攝入多種氨基酸,一些需要補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的患者通常需要臨床腸內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)支持。蛋氨酸是構(gòu)成人體的必需氨基酸之一,參與蛋白質(zhì)合成,是氨基酸注射液中的主要成分之一。蛋氨酸分子式中含1個(gè)巰基,具有還原性,易氧化降解為蛋氨酸亞砜。中長(zhǎng)鏈脂肪乳/氨基酸(16)/葡萄糖(16%)注射液的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)(貝朗醫(yī)療公司,標(biāo)準(zhǔn)號(hào):JX20110281)中采用柱前衍生對(duì)樣品中蛋氨酸亞砜進(jìn)行檢測(cè)。在光化學(xué)領(lǐng)域,有學(xué)者用L-8500氨基酸分析儀對(duì)照相明膠中蛋氨酸亞砜進(jìn)行檢測(cè)。

但柱前衍生對(duì)樣品中蛋氨酸亞砜進(jìn)行檢測(cè),峰型及分離度差,易受衍生試劑及陰性干擾,對(duì)色譜柱及液相系統(tǒng)損傷大。老型機(jī)L-8500氨基酸分析儀測(cè)定明膠中蛋氨酸亞砜存在一些不足,如重復(fù)性不理想、耗時(shí)長(zhǎng)等。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是,現(xiàn)有技術(shù)中采用前衍生對(duì)樣品中蛋氨酸亞砜進(jìn)行檢測(cè),峰型及分離度差,易受衍生試劑及陰性干擾,對(duì)色譜柱及液相系統(tǒng)損傷大;而老型機(jī)L-8500氨基酸分析儀測(cè)定明膠中蛋氨酸亞砜存在如重復(fù)性不理想、耗時(shí)長(zhǎng)等不足。

為解決上述問(wèn)題,我們結(jié)合具體實(shí)際情況采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè),建立了一種穩(wěn)定、迅速、準(zhǔn)確地測(cè)定氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供一種氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法,氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法,采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè);所用的流動(dòng)相為B1、B6,其組成見(jiàn)下表:

所用的衍生反應(yīng)試劑R1、R2、R3,其組成見(jiàn)下表:

梯度洗脫和衍生反應(yīng)步驟如下表所示:

檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm,記錄色譜圖。

作為優(yōu)選的,采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)時(shí),以日立專用離子交換樹(shù)脂為填充劑。

作為優(yōu)選的,實(shí)驗(yàn)過(guò)程為:精密量取本品1.00ml,置于10ml量瓶中,加0.02mol/L的 鹽酸溶液制成供試品溶液,取20μl注入氨基酸分析儀,按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。另取蛋氨酸亞砜對(duì)照品適量,精密稱定,加0.02mol/L的鹽酸溶液制成含蛋氨酸亞砜濃度為5μg/ml的溶液,采用如權(quán)利要求1所述方法測(cè)定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

理論板數(shù)按蛋氨酸亞砜峰計(jì)算應(yīng)不低于1000,蛋氨酸亞砜峰與其他峰分離度大于1.0。

本發(fā)明的有益效果在于:

1.通過(guò)對(duì)比研究,原標(biāo)準(zhǔn)程序采用B1、B2、B3、B4、B6為流動(dòng)相,試劑耗費(fèi)大,流動(dòng)相種類多。而改進(jìn)后短程序僅采用B1、B6為流動(dòng)相,試劑耗費(fèi)少,且譜圖較簡(jiǎn)潔。

2.原標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)試需要53.8分鐘,本發(fā)明的檢測(cè)方法僅需要29.5分鐘,大大減少了檢測(cè)時(shí)間,效率更高。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹,顯而易見(jiàn)地,下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例,對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講,在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下,還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是原標(biāo)準(zhǔn)程序(53.8min)樣品譜圖;

圖2是放大后的原標(biāo)準(zhǔn)程序(53.8min)樣品譜圖;

圖3是改進(jìn)后短程序(29.5min)樣品譜圖;

圖4是改進(jìn)后短程序(29.5min)樣品放大后譜圖;

圖5是蛋氨酸亞砜線性關(guān)系曲線圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖,對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1:

一種氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的快速檢測(cè)方法,包括以下步驟:

精密量取本品1.00ml,置于10ml量瓶中,加0.02mol/L的鹽酸溶液制成供試品溶液,取20μl注入氨基酸分析儀,用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè),記錄色譜圖;另取蛋氨酸亞砜對(duì)照品適量,精密稱定,加0.02mol/L的鹽酸溶液制成含蛋氨酸亞砜濃度為5μg/ml的溶液,同法測(cè)定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。

采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所用的流動(dòng)相為B1、B6,其組成見(jiàn)下表:

所用的衍生反應(yīng)試劑R1、R2、R3,其組成見(jiàn)下表:

梯度洗脫和衍生反應(yīng)步驟如下表所示:

以日立專用離子交換樹(shù)脂為填充劑,檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm,記錄色譜圖。理論板數(shù)按蛋氨酸亞砜峰計(jì)算應(yīng)不低于1000,蛋氨酸亞砜峰與其他峰分離度大于1.0。

本實(shí)施例的檢測(cè)方法驗(yàn)證:

(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件:用日立專用離子交換樹(shù)脂為填充劑;采用廠商提供的B1-B6六種流動(dòng)相;R1-R3為反應(yīng)試劑;檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm(脯氨酸)、440nm(其它氨基酸)。

系統(tǒng)適用性:精密量取本品1.00ml,置于10ml量瓶中,加0.02mol/L的鹽酸溶液制成樣品溶液。取20μl注入氨基酸分析儀譜儀,使用蛋白質(zhì)水解方法分析,連續(xù)6針進(jìn)樣,記錄色譜圖。該雜質(zhì)峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%,保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于1.0%。

理論板數(shù)按蛋氨酸亞砜峰計(jì)算為742,與周圍其他峰能完全分離,峰面積的RSD為1.1%,保留時(shí)間的RSD為0.1%。

(2)專屬性

精密稱取蛋氨酸亞砜對(duì)照品51.46mg置于100ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻。再精密量取1.00ml,置10ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,作為蛋氨酸亞砜對(duì)照品儲(chǔ)備液(50μg/ml)。

分別取0.02mol/L鹽酸溶液,蛋氨酸亞砜溶液為5.095μg/ml(精密量取蛋氨酸亞砜對(duì)照儲(chǔ)備液1.00ml,置10ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻),蛋氨酸溶液為0.225mg/ml(精密量取蛋氨酸儲(chǔ)備液1.00ml,置10ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻),陰性溶液(精密量取陰性溶液儲(chǔ)備液1.00ml,置10ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻)和稀釋的樣品溶液(精密量取中試樣品1.00ml,置10ml量瓶中,用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻),按含量測(cè)定法,各進(jìn)樣20μl,記錄色譜圖。

結(jié)果表明:該含量測(cè)定方法中溶劑、陰性溶液對(duì)蛋氨酸亞砜的測(cè)定無(wú)干擾,專屬性強(qiáng)。

(3)檢測(cè)限與定量限

將蛋氨酸亞砜對(duì)照品儲(chǔ)備液不斷用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至不同濃度,按含量測(cè)定法,各進(jìn)樣20μl,記錄色譜圖。以信噪比10:1時(shí)的濃度確定其最低定量限,以信噪比3:1時(shí)的濃度確定其最低檢測(cè)限。

最低定量限驗(yàn)證:配制6份最低定量限濃度的溶液,所測(cè)6份溶液雜質(zhì)峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%,峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于5.0%。

結(jié)果表明:蛋氨酸亞砜的最低檢測(cè)限為0.510μg/ml,最低定量限為1.019μg/ml,6份最低定量限濃度的溶液,雜質(zhì)峰保留時(shí)間的RSD為0.3%,峰面積的RSD為1.0%。

(4)線性和范圍

配制蛋氨酸亞砜濃度分別為標(biāo)示量(50μg/ml)的20%(定量限濃度)、50%、75%、100%、125%、150%,各進(jìn)樣20μl,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,結(jié)果下表和圖5。

以蛋氨酸亞砜峰面積為縱坐標(biāo)、濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)作線性回歸,得回歸方程:y=20523x-36688,R=0.999,回歸曲線見(jiàn)圖5。結(jié)果表明:蛋氨酸亞砜濃度在1.019~7.642μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

(5)準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別精密稱取蛋氨酸亞砜對(duì)照品約12.5mg、12.5mg、12.5mg;25mg、25mg、25mg;37.5mg、37.5mg、37.5mg;置9個(gè)50ml量瓶,加陰性溶液(按照處方配制不含蛋氨酸)溶解,定容、搖勻。再分別精密量取5.00ml置于9個(gè)50ml量瓶中,加陰性溶液(按照處方配制不含蛋氨酸)溶解,定容、搖勻,作為準(zhǔn)確度待測(cè)溶液。照有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的檢測(cè)方法,依法測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算回收率和回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,各濃度下的平均回收率均應(yīng)在80%-120%之間。結(jié)果見(jiàn)下表:

結(jié)果表明,蛋氨酸亞砜含量測(cè)定方法在標(biāo)示量的50%~150%范圍內(nèi)準(zhǔn)確度良好。

(6)精密度試驗(yàn)—重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取Z1310001批復(fù)方氨基酸注射液(18AA)1.00ml,分別置于6個(gè)10ml容量瓶中,用水定容后搖勻,分別取20μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。蛋氨酸亞砜重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果記錄如下表:

由上表可知:重復(fù)性試驗(yàn)中蛋氨酸亞砜測(cè)定的RSD為1.1%,表明本含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

(7)耐用性-溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取Z1310001批復(fù)方氨基酸注射液(18AA),照含量測(cè)定法配制樣品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12小時(shí)各測(cè)定一次,計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見(jiàn)下表。

結(jié)果表明:復(fù)方氨基酸注射液(18AA)中蛋氨酸亞砜含量樣品溶液在12h內(nèi)測(cè)定,峰面積的RSD為1.5%,穩(wěn)定性結(jié)果良好。

(8)蛋氨酸亞砜含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)于采用本發(fā)明檢測(cè)方法和原標(biāo)準(zhǔn)程序方法兩種分析程序測(cè)定結(jié)果比較如下:

選用了復(fù)合氨基酸注射液(17AA)、復(fù)方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)、復(fù)方氨基酸(15) 雙肽(2)注射液、復(fù)方氨基酸注射液(18AA),按照上述測(cè)定方法上機(jī)測(cè)定,以53.8min標(biāo)準(zhǔn)程序分析結(jié)果為對(duì)照,分析29.5min短程序測(cè)定結(jié)果。結(jié)果如下表:

從上表可以看出,用29.5min短程序測(cè)定的蛋氨酸亞砜含量與53.8min標(biāo)準(zhǔn)程序的測(cè)定值間相對(duì)誤差不大于4%。在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的允許誤差范圍內(nèi)。

兩種分析程序測(cè)定結(jié)果比較,可看出其測(cè)定值的相對(duì)誤差均不大于4%,在允許誤差范圍內(nèi),該短程序的測(cè)定值是可靠的,可用于正常的分析,且省時(shí)、省試劑。

在L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀上應(yīng)用改良后的29.5min短程序測(cè)定γ-氨基丁酸穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確,可滿足科研實(shí)驗(yàn)的需要。

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