用于檢測亞砜化活性的亞精胺生物標志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過檢測由參與微生物過程的微生物產(chǎn)生的亞精胺生物標志物的存在來評價所述過程中的亞砜化活性的方法。
【專利說明】用于檢測亞砜化活性的亞精胺生物標志物發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及一種通過檢測由參與微生物過程的微生物產(chǎn)生的生物標志物亞精胺的存在來評價所述方法中的亞砜化(sulfoxiding)活性的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在微生物過程，如生物浸出中，亞砜化活性是基礎，由此礦物質中存在的還原硫的組分，尤其，如硫化物、硫代硫酸鹽或元素硫，被氧化，最終產(chǎn)生硫酸。一方面，此過程允許直接溶解礦物質中與硫化物相關的金屬，而另一方面，通過產(chǎn)生硫酸，其允許常規(guī)的氧化礦物質的酸浸出，溶解礦物質中存在的金屬。
[0004]在亞砜化微生物中，涉及硫或硫還原組合物存在的工業(yè)方法中最常見和普遍發(fā)現(xiàn)的是嗜酸氧化硫硫桿菌(Acdith1bacillus th1xidans)。
[0005]請求人B1sigma SA已經(jīng)獲得了嗜酸氧化硫硫桿菌的特定菌株，LicanantayDSM1318株的專利權(參見B1sigma SA.CL2001-05的專利或其同族US$700, 343B2)，其在硫組分的氧化中顯示出改善的特性，防止礦物質的鈍化(passivising)。LicanantayDSN173218株可以方便地用于任何微生物過程中，尤其是需要亞砜化活性的任何生產(chǎn)性微生物過程中。
[0006]迄今為止，評價微生物過程中的亞砜化活性的方式是通過測定這樣的方法中存在的亞砜化微生物(如，嗜酸氧化硫硫桿菌)的數(shù)量，例如，測量反應器或生物浸出堆中存在的微生物的數(shù)量。評價微生物的濃度是復雜的，因為其首先需要分離存在的微生物，然后特異性地鑒定它們。在所有這些階段中都存在困難，因為這些微生物常常與固體礦物質、非常酸性的溶液和高濃度的鹽相關，這干擾了標準微生物學或分子生物學過程，特別地，必須對其進行改變，以能夠評價這些微生物。此外，特異性鑒定的過程通常是緩慢的，使得不能用作即時操作的控制參數(shù)。
[0007]然后產(chǎn)生了需求，需要一種允許快速評價微生物過程中的亞砜化活性的方法。
[0008]本發(fā)明的方法解決了這一技術問題，提供了一種評價亞砜化活性的方法，快速且特異性地確定生物標志物亞精胺的存在。
[0009]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了令人驚訝地，亞砜化活性與培養(yǎng)物的上清液中或微生物程序的流出物中的亞精胺的存在相關。
[0010]亞精胺(NH2-(CH2)4-NH-(CH2)3NH2)，是與腐胺一起的，為所有活的生命體中最大量和最廣泛分布的聚胺。它們的功能尚未得到清楚地確定，但估計它們與核酸的保護相關，并且在分裂、生長、分化和細胞死亡中是十分重要的。在嗜熱微生物，如一些亞砜化微生物中，認為亞精胺參與對抗溫度變化的核酸和蛋白質的保護。
[0011]發(fā)明人已經(jīng)確定了亞砜化細菌，如嗜酸氧化硫硫桿菌，主要產(chǎn)生亞精胺，而其他革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生腐胺。
[0012]令人驚訝地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通常以胞內形式發(fā)現(xiàn)的亞精胺，在不溶性硫化合物存在下，以及在可溶性硫化合物(如，例如連四硫酸鹽)的存在下(但程度較低)，被亞砜化微生物以顯著的數(shù)量分泌至上清液或胞外培養(yǎng)基中。不希望被理論限制，中間分泌的亞精胺是針對所需生物膜的形成的群聚感應(quorum sensing)的信號是可能的，所述生物膜是針對對不溶性硫組合物的亞砜化活性。根據(jù)以上內容，已經(jīng)開發(fā)了本發(fā)明的方法，當檢測亞精胺生物標志物存在時，證明了微生物過程中的亞砜化活性。
[0013]我們在現(xiàn)有技術中沒有發(fā)現(xiàn)任何文獻描述了生物標志物用于確定微生物過程中的亞砜化活性的用途。
[0014]同樣，雖然亞精胺已經(jīng)用作生物標志物，但其應用與本發(fā)明的那些非常不同。例如，Higuchi CM 和 Wang ff.(J.Cell.B1chem.1995 年 2 月;57 (2): 256-61)描述了亞精胺作為結直腸粘膜異常增殖的生物標志物的用途，作為結直腸癌的預測劑。Einspahr JG等人(CancerEpidem1l B1markers Prev.2006年 10月;15 (10): 1841-8)測定了患有皮膚曬傷和光化性角化病的病人活檢樣本中的亞精胺濃度，作為化學預防皮膚癌的生物標志物。Reynoso Orozco R.等人(Interciencia2008Ma33 (5) 384-388)描述了聚胺作為腫瘤活性生物標志物的用途，并且使用它們來測定芬芳橄欖(Bursera fagaroides)的抗腫瘤活性。在另一個領域中，Shoeb F.等人(Plant Science2011 年 5 月；160 (6) 1229-1235)揭示了腐胺和亞精胺之間的比例作為植物再生能力生物標志物的用途，特別是在水稻植物中。概括地，亞精胺已經(jīng)用作增殖活性的生物標志物，并且用于離微生物過程和亞砜化活性非常遠的環(huán)境中。
[0015]附圖描述
[0016]圖1.
[0017]來自含有5ng/ μ L亞精胺的溶液的質譜；在146觀察到特征性峰，1648m/z。
[0018]圖2.
[0019]在用于生產(chǎn)嗜酸氧化硫硫桿菌株Licanantay DSM17318生物質的反應器中檢測亞精胺的圖，S元素和不同的細胞生長時間:指數(shù)生長期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，如實施例1.1中所述。
[0020]圖3.
[0021]來自用于實施例2.1中所述的硫酸生產(chǎn)柱的流出物的質譜，其中在146觀察到亞精胺的特征性峰，148m/z。
[0022]發(fā)明描述
[0023]本發(fā)明涉及證明微生物過程中的亞砜化活性的方法，檢測胞外培養(yǎng)基中生物標志物亞精胺的存在。亞精胺，(NH2- (CH2) 4-NH- (CH2) 3NH2)，是生物來源的分子，當通過本發(fā)明的亞砜化微生物在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和分泌時，只能存在于硫氧化過程中。
[0024]發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了亞砜化過程中最重要的微生物，嗜酸氧化硫硫桿菌，在不溶性硫化合物(如，硫化物、硫代硫酸鹽和元素硫)的存在下，以及在可溶性硫化合物(如，例如，連四硫酸鹽)的存在下(程度較低)，以極大的量在胞外培養(yǎng)基中分泌亞精胺。這些相同的硫化合物是這些細菌的亞砜化活性的底物，其中還原的硫化合物被氧化，最終產(chǎn)生硫酸。也就是說，亞砜化活性與胞外培養(yǎng)基中亞精胺生物標志物的存在相關。
[0025]亞砜化活性在許多微生物過程，例如，生物浸出、從元素硫生產(chǎn)硫酸、生產(chǎn)亞砜化生物質等中是非常重要的。亞砜化活性在生物采礦中如此重要，使得在該過程中通過連續(xù)接種礦物質來摻入具有亞砜化活性的微生物是生物浸出過程的慣例，所述微生物如嗜酸氧化硫硫桿菌(參見，專利B1sigma SA.CL2911-06或其同族(US7837760))。盡管如此，由于礦物質的性質，亞砜化微生物常常暴露于抑制其活性或將其消除的有毒物質。為此，能夠快速確定在生產(chǎn)性微生物過程(如，生物浸出、硫酸的生產(chǎn)或亞砜化生物質的生產(chǎn))中是否真實存在亞砜化活性是非常重要的。
[0026]本發(fā)明解決了這一技術問題，如在亞精胺生物標志物的情況下，因為其通過測量胞外培養(yǎng)基中分泌的代謝產(chǎn)物，允許快速確定該過程中是否存在亞砜化活性，而不需要定量亞砜化微生物。
[0027]可以通過本領域可利用的任一種方法來檢測亞精胺，如，例如，薄層色譜(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、基于改性酚酞的比色法或質譜。對其沒有偏見，發(fā)明人認為優(yōu)選的檢測方法是質譜。
[0028]為了通過質譜檢測微生物過程的上清液或流出物中的亞精胺，必須將樣品過濾，以消除存在的大分子，便利地使用3kDA截留大小的濾器，隨后必須將其蒸發(fā)并懸浮于水中。通過質譜檢測由此制得的樣品，其中使其接受溶液A至B的梯度，其中A是水中0.1%的甲酸溶液，而B是乙腈中0.1%的甲酸溶液。如果樣品中存在亞精胺，則在譜中觀察到146的峰，1648m/z，參見圖1，其中顯示了 5ng/μ L亞精胺溶液的質譜分析的譜。
[0029]在Tanima D 等的出版物(Tanima，D 等，(Tanima，D 等，O B1mol.Chem.2009，7，4689-4694))中描述了基于改性酚酞的亞精胺的比色檢測方法，其允許通過簡單目測具有特征性粉色的酚酞來鑒定亞精胺。
[0030]如我們已經(jīng)指出的，由于所用的檢測方法在本發(fā)明的方法中不是關鍵的，所以可以通過本領域現(xiàn)有技術中可利用的或將來可能開發(fā)的任一種方法來鑒定亞精胺。其中，本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)亞砜化微生物的胞外培養(yǎng)基中的胞內分子的意義，即，這樣的分子亞精胺是亞砜化活性的生物標志物。
實施例
[0031]在具有或不具有亞砜化活性的不同微生物過程的流出物中測定亞精胺的存在。
[0032]實施例1.嗜酸氣化硫硫桿菌和嗜酸氣化亞鐵硫桿菌(Acidith1baciIIusferrooxidans)培養(yǎng)物中亞精胺生物標志物的檢測。
[0033]1.1)使用嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318的元素硫的生物質生產(chǎn)反應器。
[0034]對于菌株嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318，使用元素硫作為底物，分析了生物質生產(chǎn)反應器的不同生長階段培養(yǎng)物的方式，在此過程中，存在高亞砜化活性。
[0035]使所述培養(yǎng)物生長于KMDO，25X 培養(yǎng)基，((NH4)2S04，247，5mg/L ；NaH2PO4.H20，36，5mg/L ；KH2PO4,13，125mg/L ；MgS04 *7H20,25mg/L ;CaCl2，5, 25mg/L)中，含有 I %元素硫，pHl.8，連續(xù)攪拌，并且在30°C下。
[0036]在指數(shù)生長期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，從所述培養(yǎng)物獲取樣品。并且通過以下實驗方案，通過質譜來分析。
[0037]樣品的制備:
[0038]-從所述培養(yǎng)物或者從流出物獲取5mL樣品。
[0039]-用0，22μ m孔徑的濾器過濾樣品，以收集胞外培養(yǎng)基。
[0040]通過質譜檢測亞精胺:[0041 ]-將10 μ L制得的樣品注入HPLC設備中
[0042]-使樣品通過反相柱AgilentZorbax Extend C18 (產(chǎn)品編號727700-902)運行。
[0043]-使其接受A至B溶液的梯度，其中A是水中0.1 %的甲酸溶液，而B是乙腈中
0.1 %的甲酸溶液。時間:0至5分鐘。
[0044]-通過正向模式的電離作用將其離子化，并且通過質譜來檢測。
[0045]-如果樣品中存在亞精胺，則在譜中將觀察到146的峰，1648m/z。
[0046]結果表明了胞外培養(yǎng)基中亞精胺的存在，并且可以在圖2中看到。觀察到在元素硫的存在下，在嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318的3個生長階段中，在上清液中存在亞精胺，并且亞精胺的濃度隨著時間提高，在生長指數(shù)期(Tl)為0.03單位的相對豐度(A.r.)，在早靜止期(T2)為0.09A.r.，在晚靜止期(T3)為0.12A.r.。
[0047]1.2)使用嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Wenelen DSM16786，在Fe+2存在下，沒有元素硫的生物質生產(chǎn)反應器。
[0048]對于菌株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Wenelen DSM16786，使用硫酸亞鐵作為底物，分析了生物質生產(chǎn)反應器的不同生長階段培養(yǎng)物的方式，在此過程中，不存在亞砜化活性。
[0049]使所述培養(yǎng)物生長于KMD0.25X培養(yǎng)基中，含有6g/l Fe+2，pHl.8，連續(xù)攪拌，并且在30°C下。
[0050]在指數(shù)生長期(Tl)、早靜止期(T2)和晚靜止期(T3)，從所述培養(yǎng)物獲取樣品。并且通過實施例1.1描述的實驗方案，通過質譜來分析，其中沒有可能檢測到胞外基質中亞精胺的存在。
[0051]實施例2.具有亞砜化活性的生產(chǎn)性微生物過程中生物標志物亞精胺的檢測。
[0052]2.1)硫酸生產(chǎn)柱。
[0053]從元素硫分析了硫酸生產(chǎn)柱的流出物。這是完全亞砜化的過程。
[0054]所用的硫酸生產(chǎn)柱為I米高，具有12cm的直徑，并且裝載有:
[0055]-12.5kg的石英，具有低于3/8英寸(0，4cm)和高于1/4英寸(0.63cm)范圍的大小
[0056]-1kg元素S (濃度為80Kg S/噸石英)
[0057]-1*108細胞/g S，接種嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Wenelen DSM16786。
[0058]該柱在20°C下運行，并且在開路中以lL/h/m2的速率用實驗室水澆灌。在10天過程中，澆灌具有PH3，并且在隨后的數(shù)日，沒有調節(jié)pH，使用自然通風(也就是說，沒有空氣注入)。
[0059]作為平均，柱的硫酸生產(chǎn)為0.6kg硫酸/噸石英/天。即，證實了該柱中存在亞砜化活性。
[0060]在柱運行的第16天，使用實施例1.1中描述的實驗方案，獲取流出物樣品，并且通過質譜分析，檢測流出物中亞精胺的存在。參見圖3。
[0061]作為陽性對照，將5ng/yL加入柱的流出物中，并使其接受實施例1.1中所述的相同亞精胺檢測實驗方案；如所預期的，在譜中觀察到了亞精胺的存在，參見圖1。
[0062]2.2)鐵離子生產(chǎn)柱。
[0063]分析了鐵離子生產(chǎn)柱的流出物，其中固定化細菌將柱進料中存在的亞鐵離子氧化成鐵離子；在此過程中，不存在明顯的亞砜化活性。
[0064]評價了鐵離子生產(chǎn)柱，具有以下特征。
[0065]柱高I米，直徑為12cm，裝載有:
[0066]礦物質浸出無菌礦物質
[0067]大小80%低于 1/2 英寸(1，25cm)
[0068]礦物質加載量 12kg
[0069]1*107細胞/g礦物質，接種嗜酸氧化硫硫桿菌Licanantay DSM17318和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Wenelen DSM16786。
[0070]該柱在20°C下運行，并且在開路中以5L/h/m2的速率用KMD0.25X澆灌，補充1g/L Fe+2 ο在38天過程中，澆灌在pHl.4下進行，并且在隨后的數(shù)日，沒有調節(jié)pH，使用自然通風(也就是說，沒有空氣注入)。
[0071]在第39天，使用實施例1.1中描述的實驗方案，獲取流出物樣品，并且通過質譜分析，其中沒有可能檢測到流出物中亞精胺的存在。
[0072]這些結果表明在其中存在亞砜化活性過程中(實施例1.1和2.1)，在胞外培養(yǎng)基中檢測到了亞精胺，而在其中不存在亞砜化活性的情況下(實施例1.2和2.2)，以胞外方式?jīng)]有檢測到亞精胺。以這種方式，證實了本發(fā)明方法的功效，其允許通過檢測由參與微生物過程的亞砜化微生物產(chǎn)生的生物標志物亞精胺的存在來證明所述過程中的亞砜化活性。
【權利要求】
1.檢測微生物過程的亞砜化活性的方法，其中是檢測胞外培養(yǎng)基中由參與所述微生物過程的亞砜化微生物產(chǎn)生的生物標志物亞精胺的存在。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中存在的亞砜化微生物主要是嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidith1bacillus th10xidans)類型。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中測定所述微生物過程的流出物中亞精胺的存在。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述微生物過程是使用亞砜化微生物從元素硫生產(chǎn)硫酸的過程。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中測定所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過程的上清液中亞精胺的存在。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過程是亞砜化微生物的生物質生產(chǎn)的反應器。
7.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述亞砜化微生物參與的生產(chǎn)性過程是生物浸取過程。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過薄層色譜(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、基于改性酚酞的比色法或質譜來檢測所述亞精胺生物標志物的存在。
【文檔編號】C12R1/01GK104508139SQ201280058977
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2012年11月29日 優(yōu)先權日:2011年12月2日
【發(fā)明者】P·瑪?shù)偌{茨貝朗熱, P·帕拉達瓦爾德坎托斯 申請人:拜奧希格馬股份有限公司