本發(fā)明涉及免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能應(yīng)用于不同種類食源性致病菌的可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法。
背景技術(shù)：
免疫檢測是目前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛的一種方法，通常用于疾病診斷，動植物生理活動研究、微生物鑒定、病理研究以及免疫研究等。傳統(tǒng)的免疫檢測方法有免疫沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等。免疫檢測通常采用免疫標(biāo)記，如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、放射性核素等，應(yīng)用較廣泛的是酶標(biāo)記技術(shù)。
目前，雖然人們生活水平得到極大提高，但是食品衛(wèi)生狀態(tài)一直處于令人堪憂的境地，為檢測各種致病菌，免疫檢測技術(shù)在食品衛(wèi)生安全方面彰顯其重要性。
例如，夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的抗原即可與載體上的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的材料后加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。這種ELISA檢測體系中的酶標(biāo)記只能采用對應(yīng)抗原的酶標(biāo)記抗體，雖然具有針對性，但是檢測的致病菌單一，如涉及到多種致病菌時，需要分別檢測，費(fèi)時費(fèi)力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，提供一種可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法，其可應(yīng)用于多種致病菌的同時檢測，達(dá)到快速檢測的目的。
一種可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法，其包括如下步驟：
抗體包被微孔板；
以HRP標(biāo)記伴刀豆球蛋白，形成酶標(biāo)記復(fù)合物；
向包被有抗體的微孔板中加入待測樣本反應(yīng)，洗板、甩干后加入酶標(biāo)記復(fù)合物，溫育；
洗板溫育后，向微孔板中加入底物，測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)光吸收值，根據(jù)該吸收值來確定待測抗原含量。
上述可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法中，通過HRP和伴刀豆球單白(即ConA)交聯(lián)修飾得到伴刀豆球單白-HRP復(fù)合物，以下簡稱ConA-HRP復(fù)合物，具有酶標(biāo)記二抗與細(xì)菌結(jié)合的能力，因此能應(yīng)用于多種致病菌檢測，由于該復(fù)合物與細(xì)菌的結(jié)合位點(diǎn)不同于抗體的結(jié)合位點(diǎn)，因此應(yīng)用于夾心法檢測細(xì)菌時能提高檢測靈敏度。另外由于ConA-HRP復(fù)合物能與多種細(xì)菌結(jié)合，因此能應(yīng)用于多種致病菌的同時檢測，達(dá)到快速檢測的目的。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例的可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法原理示意圖。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明實(shí)施例提供的可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法，其包括如下步驟：
S01：抗體包被微孔板；
S02：以HRP標(biāo)記伴刀豆球蛋白，形成酶標(biāo)記復(fù)合物；
S03：向包被有抗體的微孔板中加入待測樣本反應(yīng)，洗板、甩干后加入酶標(biāo)記復(fù)合物，溫育；
S04：洗板溫育后，向微孔板中加入底物，測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)光吸收值，根據(jù)該吸收值來確定待測抗原含量。
具體地，所述抗體是細(xì)菌免疫制備的單克隆抗體，可來源于山羊、兔或小鼠等動物?？贵w是細(xì)菌免疫制備的單克隆抗體，其免疫原是食源性致病菌，例如可以是但不限于沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、空腸彎曲菌中的至少一種。所述伴刀豆球蛋白是從刀豆中提取出來的凝集素，所述凝集素是四聚體球蛋白，分子量為102,000，每個亞基（即為四聚體之一）含237個氨基酸殘基，每個亞基分子量25,500，結(jié)合一個Ca2+和一個Mn2+，每個凝集素含一個糖結(jié)合部位。上述方法中，步驟S01和S02無先后順序。
如圖1所示，簡略示意出上述方法的檢測原理：預(yù)先將辣根過氧化酶（HRP）和伴刀豆球單白(ConA)交聯(lián)修飾得到ConA- HRP復(fù)合物（即酶標(biāo)記復(fù)合物），用抗體包被微孔板，洗滌后；加入待檢測的抗原，再加入ConA- HRP復(fù)合物，利用伴刀豆球單白能與細(xì)菌上糖蛋白結(jié)合特點(diǎn)，在微孔板上形成能牢固結(jié)合的單克隆抗體（Ab）—細(xì)菌—ConA-HRP復(fù)合物，把多余的未結(jié)合上細(xì)菌的ConA- HRP復(fù)合物洗去后，加入適量的底物如TMB后，HRP把底物分解成有色物質(zhì)，從而達(dá)到檢測效果。本發(fā)明實(shí)施例的檢測方法的檢測靈敏度可達(dá)到102 cfu/mL。
步驟S01具體包括如下過程：取抗體，用磷酸鹽緩沖液稀釋終濃度5～8 μg /mL，加入到微孔板進(jìn)行包被，包被體積為100～150 μL/孔，包被條件為4℃，過夜。
步驟S02中，酶標(biāo)記復(fù)合物的形成包括如下步驟：1）將ConA溶液于碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中4℃透析過夜，換液2～3次；2）在避光條件下，制備氧化的HRP溶液；3）將氧化好的HRP溶液加入到所要標(biāo)記的ConA溶液中，充分混勻，透析交聯(lián)2-3小時；4）用NaBH4溶液將交聯(lián)完畢的ConA－HRP溶液還原；5）將還原完畢的ConA -HRP溶液置于pH值為7.2的PBS溶液中，4℃透析18小時以上，然后收獲標(biāo)記好的ConA－HRP溶液，備用。
步驟S03中，向包被有抗體的微孔板中加入待測樣本，待測樣本即為待測菌液，微孔板具有多個微孔，多個微孔中分別加入對照菌液、待測菌液等，37℃溫育60分鐘左右，在每孔加入抗ConA -HRP結(jié)合物，混勻后，37℃溫育60分鐘，洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液顯色，最后加入硫酸終止反應(yīng)，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
以下通過多個實(shí)驗(yàn)實(shí)施例來舉例說明上述可實(shí)現(xiàn)多種致病菌同步檢測方法的具體步驟以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例1 基于ConA- HRP復(fù)合物實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7檢測方法
1) 大腸桿菌O157:H7抗體包被板：取抗大腸桿菌O157:H7抗體，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋終濃度5～8 μg /mL，加入到微孔板進(jìn)行包被，包被體積為100～150 μL/孔。包被條件4℃過夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封閉2h，甩干備用。
2) ConA- HRP復(fù)合物的制備：①ConA的處理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中4℃透析過夜，換液2～3次。②辣根過氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步驟均需在避光條件下操作）取0.4ml的超純水加入HRP管中，充分混勻。 取1ml超純水加入過碘酸鈉（NaIO4）管中，充分混勻。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，邊加邊混勻，室溫暗置反應(yīng)20分鐘。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混勻，室溫暗置反應(yīng)30分鐘。③交聯(lián)：將上述氧化好的HRP溶液加入到所要標(biāo)記的ConA溶液中，充分混勻，室溫透析交聯(lián)2.5小時。交聯(lián)透析液為50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6)緩沖液。④還原：取0.5ml超純水加入硼氫化鈉（NaBH4）管，顛倒數(shù)次混勻。將交聯(lián)完畢的ConA－HRP溶液從透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反應(yīng)2小時，每隔30分鐘輕輕搖勻一次。⑤透析：將還原完畢的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析過夜（18小時以上）。換液3～4次，第一次換液時間間隔2小時。 ⑥收獲標(biāo)記好的ConA－HRP溶液，備用（可加等量甘油或其他蛋白保護(hù)劑）。
3) 取出抗體包被板，陰性對照1孔，陽性對照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待測菌液。陰陽性對照每孔加入50 μL對照菌液，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP結(jié)合物。混勻后，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃溫育30分鐘。 最后加入0.5M硫酸終止反應(yīng)，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例2 基于ConA- HRP復(fù)合物實(shí)現(xiàn)霍亂弧菌0139檢測方法
1) 霍亂弧菌0139抗體包被板：取抗霍亂弧菌0139抗體，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋終濃度5～8 μg /mL，加入到微孔板進(jìn)行包被，包被體積為100～150 μL/孔。包被條件4℃過夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封閉2h，甩干備用。
2) ConA- HRP復(fù)合物的制備：①ConA的處理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中4℃透析過夜，換液2～3次。②辣根過氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步驟均需在避光條件下操作）取0.4ml的超純水加入HRP管中，充分混勻。 取1ml超純水加入過碘酸鈉（NaIO4）管中，充分混勻。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，邊加邊混勻，室溫暗置反應(yīng)20分鐘。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混勻，室溫暗置反應(yīng)30分鐘。③交聯(lián)：將上述氧化好的HRP溶液加入到所要標(biāo)記的ConA溶液中，充分混勻，室溫透析交聯(lián)2.5小時。交聯(lián)透析液為50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6)緩沖液。④還原：取0.5ml超純水加入硼氫化鈉（NaBH4）管，顛倒數(shù)次混勻。將交聯(lián)完畢的ConA－HRP溶液從透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反應(yīng)2小時，每隔30分鐘輕輕搖勻一次。⑤透析：將還原完畢的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析過夜（18小時以上）。換液3～4次，第一次換液時間間隔2小時。 ⑥收獲標(biāo)記好的ConA－HRP溶液，備用（可加等量甘油或其他蛋白保護(hù)劑）。
3) 取出抗體包被板，陰性對照1孔，陽性對照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待測菌液。陰陽性對照每孔加入50 μL對照菌液，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP結(jié)合物?；靹蚝螅?7℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃溫育30分鐘。 最后加入0.5M硫酸終止反應(yīng)，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例3 基于ConA- HRP復(fù)合物實(shí)現(xiàn)沙門式菌檢測方法
1) 沙門式菌抗體包被板：取抗沙門式菌抗體，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋終濃度5～8 μg /mL，加入到微孔板進(jìn)行包被，包被體積為100～150 μL/孔。包被條件4℃過夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封閉2h，甩干備用。
2) ConA- HRP復(fù)合物的制備：①ConA的處理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中4℃透析過夜，換液2～3次。②辣根過氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步驟均需在避光條件下操作）取0.4ml的超純水加入HRP管中，充分混勻。 取1ml超純水加入過碘酸鈉（NaIO4）管中，充分混勻。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，邊加邊混勻，室溫暗置反應(yīng)20分鐘。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混勻，室溫暗置反應(yīng)30分鐘。③交聯(lián)：將上述氧化好的HRP溶液加入到所要標(biāo)記的ConA溶液中，充分混勻，室溫透析交聯(lián)2.5小時。交聯(lián)透析液為50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6)緩沖液。④還原：取0.5ml超純水加入硼氫化鈉（NaBH4）管，顛倒數(shù)次混勻。將交聯(lián)完畢的ConA－HRP溶液從透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反應(yīng)2小時，每隔30分鐘輕輕搖勻一次。⑤透析：將還原完畢的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析過夜（18小時以上）。換液3～4次，第一次換液時間間隔2小時。 ⑥收獲標(biāo)記好的ConA－HRP溶液，備用（可加等量甘油或其他蛋白保護(hù)劑）。
3) 取出抗體包被板，陰性對照1孔，陽性對照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待測菌液。陰陽性對照每孔加入50 μL對照菌液，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP結(jié)合物?；靹蚝螅?7℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃溫育30分鐘。 最后加入0.5M硫酸終止反應(yīng)，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)施例4 基于ConA- HRP復(fù)合物實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7和沙門式菌檢測方法
1) 大腸桿菌O157:H7和沙門式菌抗體包被板：取抗大腸桿菌O157:H7和沙門式菌抗體，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋終濃度5～8 μg /mL，加入到微孔板進(jìn)行包被，包被體積為100～150 μL/孔。包被條件4℃過夜。1% BSA，0.01 M PBS，pH7.4，37℃封閉2h，甩干備用。
2) ConA- HRP復(fù)合物的制備：①ConA的處理：5mg/ml的ConA溶液于50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中4℃透析過夜，換液2～3次。②辣根過氧化物酶（HRP）的氧化：（以下步驟均需在避光條件下操作）取0.4ml的超純水加入HRP管中，充分混勻。 取1ml超純水加入過碘酸鈉（NaIO4）管中，充分混勻。 取溶好的NaIO4溶液45μl加入到溶好的HRP溶液中，邊加邊混勻，室溫暗置反應(yīng)20分鐘。 取乙二醇40μl加入到上述溶液中，充分混勻，室溫暗置反應(yīng)30分鐘。③交聯(lián)：將上述氧化好的HRP溶液加入到所要標(biāo)記的ConA溶液中，充分混勻，室溫透析交聯(lián)2.5小時。交聯(lián)透析液為50mM 碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6)緩沖液。④還原：取0.5ml超純水加入硼氫化鈉（NaBH4）管，顛倒數(shù)次混勻。將交聯(lián)完畢的ConA－HRP溶液從透析袋中取出置于棕色玻璃瓶中，加NaBH4溶液80μl，置4℃避光反應(yīng)2小時，每隔30分鐘輕輕搖勻一次。⑤透析：將還原完畢的ConA -HRP溶液置于10mM PBS (pH 7.2) 溶液中4℃透析過夜（18小時以上）。換液3～4次，第一次換液時間間隔2小時。 ⑥收獲標(biāo)記好的ConA－HRP溶液，備用（可加等量甘油或其他蛋白保護(hù)劑）。
3) 取出抗體包被板，陰性對照1孔，陽性對照1孔，其余各孔每孔加入50 μL待測菌液。陰陽性對照每孔加入50 μL對照菌液，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后每孔加入100 μL抗ConA -HRP結(jié)合物?；靹蚝?，37℃溫育60分鐘。用稀釋好的洗滌液洗板1～2次，甩干后加入底物TMB溶液。25℃溫育30分鐘。 最后加入0.5M硫酸終止反應(yīng)，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
使用上述實(shí)施例所述方法檢測大腸桿菌O157：H7、沙門式菌和霍亂弧菌0139與傳統(tǒng)ELISA法檢測的結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可知：本發(fā)明實(shí)施例方法的檢測靈敏度達(dá)到102 cfu/mL，而傳統(tǒng)的ELISA試劑盒檢測常見的致病菌的靈敏度則為103~4 cfu/mL，可見，本發(fā)明實(shí)施例方法的檢測靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測方法。
表1 各實(shí)施例方法與傳統(tǒng)ELISA法檢測致病菌參數(shù)對比。
需要說明的是，本發(fā)明并不局限于上述實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的創(chuàng)造精神，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以做出其他變化，這些依據(jù)本發(fā)明的創(chuàng)造精神所做的變化，都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。