專利名稱：核酸以及鑒定真菌菌株致病型的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害防治領域，具體地，涉及一種核酸、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。
背景技術：
大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一種植物致病真菌,它可以導致植物(特別是棉花)發(fā)生黃萎病。但是，不同致病型的大麗輪枝菌菌株的致病表現(xiàn)差別很大，例如某些高致病型的菌株感染棉花后會導致棉花的嚴重病害而引起農(nóng)田產(chǎn)量的下降，而某些低致病型的菌株感染棉花后僅導致棉花的輕微病害且對農(nóng)田產(chǎn)量影響較小。此外，大麗輪枝菌的致病型還表現(xiàn)出一定的潛伏性，即高致病型菌株在感染當年可能不致病，而在次年大范圍地嚴重致病。如果能夠檢測出農(nóng)田中大麗輪枝菌的主要菌株類型，并對其致病型作出準確的判
斷，就可以結合藥物防治和輪作等農(nóng)業(yè)手段抑制病害的發(fā)生，從而增加經(jīng)濟效益和社會效.、/■
Mo

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決如何準確判斷大麗輪枝菌菌株的致病型的技術問題，提供一種核酸、一種鑒定真菌菌株致病型的方法和一種試劑盒。SEQ ID NO:1所示的序列為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在高致病型的大麗輪枝菌菌株的基因組序列中出現(xiàn)而在低致 病型的大麗輪枝菌的基因組序列中不出現(xiàn)的序列。因而，對于某一致病型待測的大麗輪枝菌菌株，只要鑒定該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可獲知該大麗輪枝菌菌株是否為高致病型大麗輪枝菌。具體地，如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則判斷該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。并且，如果該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列，就能夠充分證明該大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列。由此，本發(fā)明的發(fā)明人得到了本發(fā)明的技術方案。為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種核酸，該核酸具有SEQ IDNO: I所示的序列，或者具有SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列所示的序列，并且所述SEQ IDNO:1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。另一方面，本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補的核酸。另一方面，本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae),該方法包括以下步驟:(I)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；(2)檢測所述待測樣本中是否存在第一分子標記，所述第一分子標記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述待測樣本中不存在所述第一分子標記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述待測樣本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互補核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。通過上述技術方案，本發(fā)明鑒定的高致病型的大麗輪枝菌的導致棉花發(fā)生黃萎病的平均病情指數(shù)為56.6 ;本發(fā)明鑒定的低致病型的大麗輪枝菌的導致棉花發(fā)生黃萎病的平均病情指數(shù)為12.0。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列，或者具有SEQ ID NO:I所示的序列中的特異性序列，并且所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。其中，術語“大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列”是指已經(jīng)公布在公共數(shù)據(jù)庫中的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列，具體是指文獻(Klosterman SJ et.al, Comparative genomics yields insights into nicheadaptation of plant vascular wilt pathogens.PLoS Pathog.201IJul ；7 (7):el002137.Epub 2011 Jul 28.)中提及的數(shù)據(jù)庫(http://www.broadinstitute.0rg)中公布的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列。其中，SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列可以基于SEQ ID NO:1所示的序列和大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列，通過本領域常規(guī)的序列比對(blast)方法得到。例如，本領域技術人員可以憑借已公開的計算機程序(商業(yè)化的和免費的均可，例如NCB1-PRMERBLAST)，窮舉SEQ ID NO:1所示的序列的所有可能的片段，然后
將其與大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列進行--比對，如果該片段僅
出現(xiàn)于SEQ ID NO:1所示的序列中，而不出現(xiàn)于SEQ ID NO:1所示的序列以外的序列中，該片段即為SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列。其中，本發(fā)明中所述的SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列是用于鑒定SEQID NO:1所示的序列是否存在的，因此SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度沒有特別的要求，本領域技術人員可以根據(jù)所選取的檢測方法進行常規(guī)的選擇。例如，所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度可以為15-5000bp。其中，為了使SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈式反應(PCR)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的擴增祀(amplified target)序列，優(yōu)選情況下，所述SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特異性序列的長度為100-5000bp，更優(yōu)選為 lOO-lOOObp，進一步優(yōu)選為100_500bp，更進一步優(yōu)選為150_250bp。
其中，為了使SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特異性序列可以作為聚合酶鏈式反應(PCR)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的引物(primer)序列，或者作為核酸雜交(如Southern Blot)法鑒定SEQ ID NO:1所示的序列的探針(probe)序列，優(yōu)選情況下，所述SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特異性序列的長度為15-99bp，更優(yōu)選為18-50bp，進一步優(yōu)選為20-40bp，更進一步優(yōu)選為22_35bp。本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補的核酸。需要說明的是，本發(fā)明如上所述的各種核酸中，除堿基序列外，均無特別的要求，本領域技術人員可以對如上所述的各種核酸進行各種修飾，修飾后的核酸也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌，該方法包括以下步驟:⑴制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；(2)檢測所述待測樣本中是否存在第一分子標記，所述第一分子標記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟
(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述待測樣本中不存在所述第一分子標記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述待測樣本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互補核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。其中，制備待測樣本的步驟可以按照本領域常規(guī)的制備用于檢測核酸的樣本的方法進行，本發(fā)明沒有特別的要求，例如可以從棉花植株上采集組織，并且將采集的組織在含有抗性的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且篩選、辨別和分離大麗輪枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版))中所述的方法提取大麗輪枝菌的基因組DNA，即可制備得到待測樣本。其中，檢測所述待測樣本中是否存`在第一分子標記的方法可以為本領域常規(guī)的檢測核酸的方法，本發(fā)明沒有特殊的要求，例如可以為測序法(如雙脫氧核糖核苷酸中止測序法和芯片測序法)、PCR法(如實時定量PCR法)和核酸雜交法(如Southern Blot法)中的至少一種。其中，判斷所述檢測結果顯示所述待測樣本中是否存在所述第一分子標記或具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸可以按照本領域常規(guī)的方法和標準進行，例如可以通過設置外參和/或內(nèi)參進行平行檢測，并且通過平行檢測結果來進一步判斷。另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒含有如上所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，各種大麗輪枝菌的菌株屬于經(jīng)過合法渠道獲得的遺傳資源。需要說明的是，SEQ ID NO:1所示的序列中，出現(xiàn)多個由連續(xù)的n(n為a，c，g，或t)組成的片段，該片段表示在不同的大麗輪枝菌菌株中可以自由改變的堿基序列，其不影響大麗輪枝菌菌株的致病型的判斷。實施例1本實施例用于說明待測樣本的制備。具體地，是從80個不同的大麗輪枝菌菌株(編號為VDGl至VDG80)的基因組DNA的制備。切取棉花植株離地表約10_35cm處的莖，切成Imm3左右大小的小塊，接種在在含有抗生素(氨芐青霉素、利福平和鏈霉素，濃度均為lOOyg/ml)的PDA培養(yǎng)基(含有馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L)上，25°C下培養(yǎng)7天，根據(jù)大麗輪枝菌的標準菌落形態(tài)鑒別大麗輪枝菌的菌落。得到鑒別的大麗輪枝菌的菌落即作為大麗輪枝菌菌株樣品。按照上述方法，從80個不同的棉花植株中取得80個不同的大麗輪枝菌菌株，將上述80個不同的大麗輪枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科學出版社，2007年出版)中所述的方法，分別提取基因組DNA樣本，得到待測樣本1-80。實施例2本實施例用于說明上述80個不同的大麗輪枝菌菌株的致病型的檢測結果。參照文獻(朱荷琴，馮自力，李志芳，趙麗紅，師勇強.蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種(系)的抗黃萎病性.中國棉花，2010,37(12):15-17)中的蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法，對實施例1中所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株進行棉花苗期致病型鑒定。以所述的80個不同的大麗輪枝菌菌株在接種健康棉花植株后的病情指數(shù)來表征致病型的高低。具體地 ，將大麗輪枝菌在查比克培養(yǎng)基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的瓊脂)上培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，用無菌水洗下孢子得到孢子懸液，并將孢子懸液中的孢子濃度調(diào)整至5X IO6個/ml。然后，播種在紙缽的棉花幼苗至少有一片真葉展開時接種，向紙牒底部注入IOmL孢子懸浮液，將紙缽放入紙牒中，接種棉苗30株以上。接種后4周發(fā)病情況，調(diào)查采用5級分級法，分級標準:0級，健苗、無病狀；1級，1-2片子葉表現(xiàn)病狀、子葉變黃、真葉不顯病狀；2級，子葉和I片真葉表現(xiàn)病狀；3級、2片真葉表現(xiàn)病狀；4級，全部葉片表現(xiàn)病狀，嚴重時葉片脫落，頂心枯死。根據(jù)調(diào)查結果，計算出病情指數(shù)，公式如下所示:
病情指數(shù)=nmmmxmmmm] xl00 總株數(shù)X發(fā)病最高級的代表數(shù)值(4)本實施例檢測得到了上述80個不同的大麗輪枝菌菌株的致病型，通過上述鑒別標準，鑒定出其中61個大麗輪枝菌菌株的病情指數(shù)均高于35，屬于高致病型，而另外19個大麗輪枝菌菌株的病情指數(shù)均低于20，不屬于高致病型。上述61個屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDG10、VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40和VDGl。上述19個不屬于高致病型的大麗輪枝菌菌株分別為:VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51。實施例3按照Illumina公司的測序儀Genome Analyzer的說明書(Solexa技術)中規(guī)定的方法，測定大麗輪枝菌菌株(編號為VDGl以及VDG2)的全基因組序列。
本實施例得到了上述2個不同的大麗輪枝菌菌株的全基因組序列，通過序列比對，鑒定出VDGl的全基因組序列中含有SEQ ID NO:1所示的序列，而VDG2的全基因組序列中不含有SEQ ID NO:1所示的序列。通過上述相同的方法，鑒定出上述80個不同的大麗輪枝菌菌株中的61個(分別為 VDG3、VDG63、VDG61、VDG18、VDG35、VDG32、VDG73、VDG31、VDG33、VDG26、VDG55、VDG23、VDG57、VDG36、VDGl1、VDG67、VDG47、VDG5、VDG29、VDG59、VDG49、VDG44、VDG21、VDG48、VDG8、VDG50、VDG25、VDG43、VDG37、VDG46、VDG16、VDG4、VDG68、VDG6、VDG52、VDG34、VDG7、VDG45、VDG12、VDG76、VDG27、VDGlO, VDG41、VDG64、VDG17、VDG54、VDG39、VDG75、VDG20、VDG13、VDG22、VDG38、VDG19、VDG28、VDG14、VDG9、VDG53、VDG15、VDG42、VDG40 和 VDG1)的基因組的序列中均存在SEQ ID NO:1所示的序列；并且，另外的19個大麗輪枝菌菌株(分別為VDG70、VDG69、VDG71、VDG24、VDG79、VDG65、VDG56、VDG77、VDG74、VDG30、VDG80、VDG60、VDG2、VDG58、VDG66、VDG62、VDG72、VDG80 和 VDG51)不存在所述 SEQ ID NO:1 所示的序列。根據(jù)實施例2和實施例3的結果可以確定，如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株不屬于高致病型；如果鑒定出大麗輪枝菌菌株的基因組的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，則該大麗輪枝菌菌株屬于高致病型。實施例4本實施例舉例說明SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列，并且所述SEQ IDNO:1所示的序列中的特異性序·列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。經(jīng)過PCR和分子雜交實驗驗證，如表I所示的片段均可以作為本發(fā)明所述的SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列:表ISEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列
權利要求
1.一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列，或者具有SEQ ID N0:1所示的序列中的特異性序列，并且所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特異性序列在大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的全基因組序列范圍內(nèi)僅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。
2.根據(jù)權利要求1所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為100-5000bp。
3.根據(jù)權利要求2所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為100-1000bp。
4.根據(jù)權利要求3所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為100-500bp，優(yōu)選為150-250bp。
5.根據(jù)權利要求1所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為15-99bp。
6.根據(jù)權利要求5所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為18-50bp。
7.根據(jù)權利要求6所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特異性序列的長度為20-40bp，優(yōu)選為22-35bp。
8.—種核酸,該核酸與權利要求1-7中任意一項所述的核酸互補。
9.一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae),該方法包括以下步驟: (1)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；· (2)檢測所述待測樣本中是否存在第一分子標記，所述第一分子標記為根據(jù)權利要求1-8中任意一項所述的核酸； (3)根據(jù)步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型，在所述待測樣本中不存在所述第一分子標記的情況下，則指示所述大麗輪枝菌的菌株不屬于高致病型；在所述待測樣本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互補核酸的情況下，則指示該大麗輪枝菌的菌株屬于高致病型。
10.一種試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)權利要求8所述的核酸，以及PCR試劑和/或分子雜交試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸具有SEQ ID NO1所示的序列，或者具有SEQ ID NO1所示的序列中的特異性序列。本發(fā)明還提供了與如上所述的核酸互補的核酸。本發(fā)明還提供了一種鑒定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株為大麗輪枝菌，該方法包括以下步驟(1)制備含有大麗輪枝菌的全基因組DNA的待測樣本；(2)檢測所述待測樣本中是否存在第一分子標記，所述第一分子標記為如上所述的核酸；(3)根據(jù)步驟(2)的檢測結果判斷大麗輪枝菌菌株的致病型。本發(fā)明還提供了一種試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK103243093SQ20121005231
公開日2013年8月14日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權日2012年3月1日
發(fā)明者戴小楓, 陳相永, 李蕾, 柳少燕, 王金龍, 陳捷胤, 田李 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所