本發(fā)明涉及一種玻璃化冷凍觀察裝置及其在玻璃液篩選、組織平衡時(shí)間優(yōu)化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

組織冷凍保存在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值己得到公認(rèn)，并取得了一些成就，但進(jìn)展仍然緩慢，其中玻璃化冷凍法最早于2002年應(yīng)用于在卵巢組織冷凍保存研究中，原理是高濃度冷凍保護(hù)液在快速降溫時(shí)可形成玻璃化液，無(wú)細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成，更適合冷凍保存結(jié)構(gòu)復(fù)雜的人卵巢組織，2013年第一例玻璃化凍存卵巢組織片自體移植后嬰兒出生。玻璃液濃度越高，玻璃態(tài)越易形成，但隨濃度升高其對(duì)組織毒性也越大，如何篩選出最適合人卵巢組織的玻璃液配伍及濃度就成為提高人卵巢組織冷凍保存效果的關(guān)鍵步驟；同時(shí)人卵巢組織在不同玻璃液中所需的滲透平衡時(shí)間也不同，過(guò)短無(wú)法保證在冷凍過(guò)程不受冷凍損傷，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加玻璃液對(duì)組織的化學(xué)毒性和滲透毒性，如何快速確定最合適的平衡時(shí)間也是提高冷凍效果的重要環(huán)節(jié)。

目前常用篩選最優(yōu)玻璃液及組織平衡時(shí)間的方法有：①組織形態(tài)學(xué)分析；②移植后或體外培養(yǎng)性激素水平的測(cè)定；③組織細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化；④組織細(xì)胞的凋亡情況；⑤卵泡的增殖發(fā)育能力等。這些方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，不靈活，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)玻璃液配伍的問(wèn)題，極易使后續(xù)檢測(cè)成為無(wú)效工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種玻璃化冷凍觀察裝置，所述玻璃化冷凍觀察裝置應(yīng)用在最優(yōu)玻璃液篩選和組織平衡時(shí)間優(yōu)化時(shí)，可便捷地觀察快速冷凍和復(fù)融過(guò)程中不同玻璃液的玻璃化狀態(tài)和組織在玻璃液中平衡過(guò)程中表面積變化，完成初步玻璃態(tài)篩查工作和組織平衡時(shí)間的優(yōu)化及確定，具有快速、簡(jiǎn)單方便的特點(diǎn)，極大減少無(wú)效工作。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：提供一種玻璃化冷凍觀察裝置，包括：

立式顯微鏡，所述立式顯微鏡連接拍攝裝置，用于觀察和拍攝玻璃化冷凍——復(fù)融過(guò)程及組織在玻璃液中的平衡過(guò)程；

設(shè)有中空部的隔離盒，置于所述立式顯微鏡的置物臺(tái)上，所述中空部呈圓柱形，包括上下相通的第一中空部和第二中空部，且所述第一中空部的直徑擴(kuò)大形成所述第二中空部，使得第二中空部與第一中空部交界處形成環(huán)形平臺(tái)，用于承載觀察材料和通過(guò)所述立式顯微鏡置物臺(tái)下方光線；

培養(yǎng)皿，置于所述隔離盒的第二中空部，用于放置觀察材料。

優(yōu)選地，所述隔離盒呈長(zhǎng)方體形，長(zhǎng)、寬、高分別為15厘米、15厘米和5厘米。隔離盒長(zhǎng)寬的尺寸與立式顯微鏡置物臺(tái)（ 熱臺(tái)）面積相匹配，并且大于培養(yǎng)皿的面積；隔離盒高度設(shè)置為5厘米，既方便立式顯微鏡調(diào)節(jié)焦聚，又不會(huì)使培養(yǎng)皿中加入液氮后在顯微鏡的置物臺(tái)（ 熱臺(tái)）表面產(chǎn)生水霧。

優(yōu)選地，所述第一中空部在距離所述隔離盒表面1厘米處直徑擴(kuò)大形成所述第二中空部。即第二中空部的高度為1厘米，該高度與玻璃培養(yǎng)皿的深度相配合，使玻璃培養(yǎng)皿恰好能嵌入第二中空部。

優(yōu)選地，所述第一中空部的直徑為9厘米，所述第二中空部的直徑為10.5厘米。第二中空部的直徑為10.5cm，方便置入直徑10cm透明玻璃培養(yǎng)皿，并且玻璃培養(yǎng)皿側(cè)壁本身的厚度使其置入第二中空部時(shí)，能與第二中空部的側(cè)壁緊貼，使得玻璃培養(yǎng)皿不易晃動(dòng)；此外，第二中空部的直徑大于第一中空部的直徑，使得第二中空部與第一中空部交界處形成環(huán)形平臺(tái)，這樣玻璃培養(yǎng)皿置于第二中空部時(shí)，玻璃培養(yǎng)皿的底部置于環(huán)形平臺(tái)上，環(huán)形平臺(tái)可托住玻璃培養(yǎng)皿。

優(yōu)選地，所述隔離盒由具有耐超低溫和保溫性能的材料制成。耐超低溫和保溫性能的材料可以對(duì)培養(yǎng)皿中加入的液氮或溫水起到一定保溫作用。

本發(fā)明一方面還提供所述玻璃化冷凍觀察裝置在玻璃液篩選中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）玻璃液快速冷凍觀察

A．在所述培養(yǎng)皿中倒入液氮，調(diào)節(jié)所述立式顯微鏡的焦距；

B．用內(nèi)徑0.5微米的單精子卵胞漿顯微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）用注射針吸取一定體積待檢測(cè)玻璃液，置于所述培養(yǎng)皿中標(biāo)記好的對(duì)焦位置；

C．拍攝并記錄所述玻璃液的變化，觀察指標(biāo)包括快速冷凍過(guò)程中晶體、碎片的形成；

（2）玻璃液復(fù)融觀察

A．在所述培養(yǎng)皿中倒入37℃水，調(diào)節(jié)所述立式顯微鏡的焦距；

B．取出所述液氮中冷凍后的ICSI注射針置于所述培養(yǎng)皿中標(biāo)記好的對(duì)焦位置；

C．拍攝并記錄玻璃液變化情況，觀察指標(biāo)包括復(fù)融過(guò)程中冰晶、去玻璃和再結(jié)晶形成情況。

本發(fā)明另一方面還提供所述玻璃化冷凍觀察裝置在組織平衡時(shí)間優(yōu)化中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）在所述培養(yǎng)皿中加入一定量的玻璃液；

（2）將組織置于所述玻璃液中，滲透平衡一定時(shí)間；

（3）調(diào)整焦距，拍攝記錄組織表面積變化。

進(jìn)一步地，在所述步驟（2）之前還包括將所述組織置于等滲磷酸鹽緩沖液中的步驟。

具體地，所述玻璃化冷凍觀察裝置在組織平衡時(shí)間優(yōu)化中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）在所述培養(yǎng)皿中加入一定量的玻璃液；

（2）將組織置于等滲磷酸鹽緩沖液中；

（3）再將組織移入所述玻璃液中，滲透平衡一定時(shí)間；

（4）調(diào)整焦距，每間隔一分鐘鏡下拍照一次，拍攝記錄組織表面積變化；

（5）以組織在所述等滲磷酸鹽緩沖液中的表面積為百分之百等滲表面積，計(jì)算置于所述玻璃液內(nèi)的組織表面積占等滲表面積的百分比，比較不同時(shí)間點(diǎn)組織表面積與等滲表面積的比值，最小比值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)為所述玻璃液最佳滲透脫水時(shí)間。

本發(fā)明的玻璃化冷凍觀察裝置可以用于包括但不限于腎臟組織、肝臟組織、胚胎組織、卵巢組織在玻璃液中的平衡時(shí)間的優(yōu)化。

優(yōu)選地，所述玻璃化冷凍觀察裝置應(yīng)用于卵巢組織在玻璃液中的平衡時(shí)間的優(yōu)化。

本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有篩選最優(yōu)玻璃液及組織平衡時(shí)間方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、不靈活、不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)玻璃液配伍問(wèn)題、易使后續(xù)檢測(cè)成為無(wú)效工作的情況，本發(fā)明玻璃化冷凍觀察裝置應(yīng)用在最優(yōu)玻璃液篩選和組織平衡時(shí)間優(yōu)化時(shí)，可便捷地觀察快速冷凍和復(fù)融過(guò)程中不同玻璃液的玻璃化狀態(tài)和組織在玻璃液中平衡過(guò)程中表面積變化，完成初步玻璃態(tài)篩查工作和組織平衡時(shí)間的優(yōu)化及確定，具有快速、簡(jiǎn)單方便的特點(diǎn)，極大減少無(wú)效工作。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的玻璃化冷凍觀察裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為圖1中的隔離盒的剖視圖；

圖3為圖1中培養(yǎng)皿置于隔離盒中的狀態(tài)剖面圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

請(qǐng)參見(jiàn)圖1、圖2和圖3，玻璃化冷凍觀察裝置包括立式顯微鏡1、隔離盒2和培養(yǎng)皿3。立式顯微鏡1包括鏡頭裝置101、置物臺(tái)102和置物臺(tái)102下方的光源103，立式顯微鏡1連接有拍攝裝置，用于觀察和拍攝玻璃化冷凍——復(fù)融過(guò)程以及組織在玻璃液中的平衡。

隔離盒2置于立式顯微鏡的置物臺(tái)102上，隔離盒2呈長(zhǎng)方體形，由具有耐超低溫和保溫性能的材料制成，長(zhǎng)、寬、高分別為15厘米、15厘米和5厘米，中央設(shè)有中空部21，中空部21呈圓柱形，包括上下相通的第一中空部211和第二中空部212，第一中空部211的直徑為9厘米，在距離隔離盒2表面1厘米處直徑擴(kuò)大為10.5厘米并形成第二中空部212，使得第二中空部212與第一中空部211交界處形成環(huán)形平臺(tái)。隔離盒2用于承載觀察材料和通過(guò)立式顯微鏡1的置物臺(tái)102下方光源103的光線。

培養(yǎng)皿3為透光的玻璃培養(yǎng)皿，直徑10厘米，置于隔離盒2的第二中空部212，由于第二中空部212的直徑為10.5cm、高度為1厘米，該高度與玻璃培養(yǎng)皿3的深度相配合，使玻璃培養(yǎng)皿3恰好能嵌入第二中空部212。直徑10cm的透明玻璃培養(yǎng)皿3置入第二中空部212時(shí)，玻璃培養(yǎng)皿3側(cè)壁本身的厚度使其與第二中空部212的側(cè)壁緊貼，使得玻璃培養(yǎng)皿3不易晃動(dòng)；此外，玻璃培養(yǎng)皿3置于第二中空部212時(shí)，玻璃培養(yǎng)皿3的底部置于第二中空部212與第一中空部211交界處形成的環(huán)形平臺(tái)上，環(huán)形平臺(tái)可托住玻璃培養(yǎng)皿3。

玻璃化冷凍觀察裝置的使用方法：立式顯微鏡1連接拍攝裝置，將隔離盒2置于立式顯微鏡1的置物臺(tái)102上，使隔離盒2中央的中空部21位于置物臺(tái)102下方光源103的中央，玻璃培養(yǎng)皿3的中央位置根據(jù)觀察物形狀做不同固定標(biāo)記。

實(shí)施例2

用玻璃化冷凍觀察裝置來(lái)篩選玻璃液，包括以下步驟：

（1）玻璃液快速冷凍觀察

A．在玻璃培養(yǎng)皿3中倒入液氮，調(diào)節(jié)立式顯微鏡1的焦距；

B．用內(nèi)徑0.5微米ICSI注射針4吸取一定體積待檢測(cè)玻璃液，置于玻璃培養(yǎng)皿3中標(biāo)記好的對(duì)焦位置；

C．拍攝并記錄所述玻璃液的變化，觀察指標(biāo)包括快速冷凍過(guò)程中晶體、碎片的形成；

（2）玻璃液復(fù)融觀察

A．在玻璃培養(yǎng)皿3中倒入37℃水，調(diào)節(jié)立式顯微鏡1的焦距；

B．取出上述液氮中冷凍后的ICSI注射針4置于玻璃培養(yǎng)皿3中標(biāo)記好的對(duì)焦位置；

C．拍攝并記錄玻璃液變化情況，觀察指標(biāo)包括復(fù)融過(guò)程中冰晶、去玻璃和再結(jié)晶形成情況。

任何玻璃在冷凍和/或復(fù)融過(guò)程中出現(xiàn)如下變化均認(rèn)為不是完全玻璃化。

（1）晶體形成：水分子從液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)的冰；

（2）碎片：在快速降溫和升溫過(guò)程中在組織細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，特別是當(dāng)組織內(nèi)外溫差大時(shí)更為明顯；

（3）去玻璃化：在冷凍后復(fù)融升溫過(guò)程中，在玻璃液中形成冰核和冰晶的現(xiàn)象；

（4）再結(jié)晶：是比較復(fù)雜的過(guò)程，出現(xiàn)在冷凍后復(fù)融升溫的過(guò)程中，玻璃液中的冰晶形成后體積發(fā)生變化，小體積冰晶皺縮而大體積冰晶變得更大。

實(shí)施例3

玻璃化冷凍觀察裝置在卵巢組織在玻璃液中的平衡時(shí)間優(yōu)化中的應(yīng)用，由于實(shí)驗(yàn)用卵巢塊形狀不規(guī)則，無(wú)法計(jì)量其體積變化，因此可通過(guò)測(cè)量其表面積變化來(lái)觀察卵巢塊在玻璃液中的滲透行為。所述應(yīng)用包括以下步驟：

（1）在玻璃培養(yǎng)皿3中加入一定量的玻璃液；

（2）將卵巢組織置于等滲磷酸鹽緩沖液中；

（3）再將卵巢組織移入玻璃液中，滲透平衡一定時(shí)間；

（4）調(diào)整立式顯微鏡1的焦距，每間隔一分鐘鏡下拍照一次，拍攝記錄組織表面積變化，通過(guò)Image plus6.0圖象分析軟件測(cè)量其表面積；

（5）以卵巢組織在等滲磷酸鹽緩沖液中的表面積為百分之百等滲表面積，計(jì)算置于玻璃液內(nèi)的組織表面積占等滲表面積的百分比，比較不同時(shí)間點(diǎn)組織表面積與等滲表面積的比值，最小比值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)為所述玻璃液最佳滲透脫水時(shí)間。

每枚卵巢塊為一個(gè)實(shí)驗(yàn)單位，每組觀測(cè)6~10枚卵巢塊。

本發(fā)明玻璃化冷凍觀察裝置應(yīng)用在最優(yōu)玻璃液篩選和組織平衡時(shí)間優(yōu)化時(shí)，可便捷地觀察快速冷凍和復(fù)融過(guò)程中不同玻璃液的玻璃化狀態(tài)和組織在玻璃液中平衡過(guò)程中表面積變化，完成初步玻璃態(tài)篩查工作和組織平衡時(shí)間的優(yōu)化及確定，具有快速、簡(jiǎn)單方便的特點(diǎn)，極大減少無(wú)效工作。

本領(lǐng)域技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和精神，可以有多種變形方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，以上所述僅為本發(fā)明較佳可行的實(shí)施例而已，并非因此局限本發(fā)明的權(quán)利范圍，凡運(yùn)用本發(fā)明說(shuō)明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)變化，均包含于本發(fā)明的權(quán)利范圍之內(nèi)。