本發(fā)明屬于免疫檢測分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
：動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病種，在過去很長一段時間內(nèi)始終是醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)研究的重點(diǎn)。因?yàn)樗占懊鎻V，在人體內(nèi)潛伏期長，往往以局部缺血、心絞痛、心肌梗塞、中風(fēng)、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆發(fā)，已成為現(xiàn)階段最常見的死因。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)是心血管疾病中一種新的炎癥酶，屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶，能水解氧化低密度脂蛋白(LDL)，產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游離脂肪酸(oxidizedfreefattyacids，ox-FA)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。越來越多的研究證實(shí)，Lp-PLA2活性能反映動脈粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度，并與易損斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。它可作為缺血性卒中獨(dú)立的預(yù)測因子，可提供傳統(tǒng)危險因子評估以外的預(yù)測信息，測定其水平有助于指導(dǎo)預(yù)防策略。Lp-PLA2與其他炎性因子(如C-反應(yīng)蛋白等)相比，受其他危險因素的影響較小，檢測具有更高的靈敏度和特異性，目前已被用作預(yù)測心血管事件的風(fēng)險指標(biāo)，用以對患者心血管疾病進(jìn)行早期診斷、療效觀察及預(yù)后評估。大量臨床研究證實(shí)，Lp-PLA2與其他心血管疾病標(biāo)志物聯(lián)檢，可以更進(jìn)一步提高診斷的敏感性和特異性。目前，臨床上用于測定Lp-PLA2的方法有ELISA法和免疫比濁法兩種。ELISA法實(shí)驗(yàn)過程受影響因素多，很容易造成結(jié)果失真，重復(fù)性準(zhǔn)確性較差；免疫比濁法檢測靈敏度低，很容易受血脂濃度影響產(chǎn)生假性升高，且不適用于 大批量、自動化式檢測平臺?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是繼ELISA之后發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫測定技術(shù)。它將化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合，與目前常見的免疫分析法相比具有更高的靈敏度、特異性，且具有檢測時間短、測量線性范圍寬、穩(wěn)定性好、操作簡便快捷、便于自動化、安全無污染等諸多優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于傳染病、肥胖相關(guān)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、遺傳病、腫瘤的早期診斷、動植物檢驗(yàn)檢疫等眾多領(lǐng)域，并已逐漸成為標(biāo)記免疫分析的一個重要方向。目前，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在人Lp-PLA2免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用方面仍是空白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法，旨在解決化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在人Lp-PLA2免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用方面仍是空白的問題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒包括：標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以胎牛血清為基質(zhì)，由脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度包括1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/rnL、0ng/mL共6個濃度，質(zhì)控品分為質(zhì)控低值和質(zhì)控高值，濃度范圍依次為150±15ng/mL、300±35ng/mL。進(jìn)一步載體為微孔板、磁性顆?；蛩芰瞎?。進(jìn)一步用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。進(jìn)一步化學(xué)發(fā)光底物液為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷或魯米諾。進(jìn)一步分析緩沖液為含有1％牛血清白蛋白和0.05％吐溫-20的10mM磷酸 鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。進(jìn)一步濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒制備方法，該脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒制備方法包括以下步驟：步驟一，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；步驟二，制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體：載體為微孔板或塑料管時，包被載體通過以下方法制備：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫18-25℃干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；封閉緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30％；載體為磁性顆粒時，包被載體通過以下方法制備：吸取3mL內(nèi)含2％磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調(diào)整 體積至6mL；加入5mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，置于4℃內(nèi)混勻30min；加入12mg碳二亞胺，置于4℃內(nèi)孵育過夜；用pH7.4、100mmol/LPBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L；調(diào)節(jié)pH至7.4，抗體終濃度為1mg/mL，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，清洗液為pH6.0、10mmol/LPBS緩沖液；步驟三，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶標(biāo)記物：用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，置于4℃保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；步驟四，制備化學(xué)發(fā)光底物液：上述堿性磷酸酶標(biāo)記抗體對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)，AMPPD化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；上述辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾，魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法為：基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯(lián)苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調(diào)整pH至8.0；基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調(diào)整pH至7.6；步驟五，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300；步驟六，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內(nèi)含1％吐溫-20；步驟七，組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。本發(fā)明提供的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法，采用雙抗體夾心反應(yīng)模式，可以對人血樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2分子進(jìn)行專一的定量檢測。它既有效地利用了化學(xué)發(fā)光的技術(shù)原理，又在酶聯(lián)免疫分析的基礎(chǔ)上應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，具有靈敏度高、檢測范圍寬、穩(wěn)定性好、操作簡便快速無污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明與其他開放式全自動化學(xué)發(fā)光檢測平臺相結(jié)合，可以有效縮短檢測時間，降低檢測成本和人力花費(fèi)。項(xiàng)目開發(fā)的產(chǎn)品市場前景廣闊，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著；與酶聯(lián)免疫、免疫比濁等方法相比較，本發(fā)明簡化了操作步驟，縮短了檢測時間、大大提高了測定的靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明使用的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體具有高度特異性，得到的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法可以取代其他試劑盒來進(jìn)行脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的定量檢測。與國外試劑盒相比，本發(fā)明試劑盒不僅價格低廉，而且操作簡便，靈敏度高，便于在臨床上大規(guī)模推廣使用。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒制備方法流程圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的實(shí)施例1所制備的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品線形圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及制備方法與美國PLAC公司脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫測定試劑盒檢測200例心血管病人相關(guān)性的結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。本發(fā)明實(shí)施例的一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒包括：標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液；標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品是以胎牛血清為基質(zhì)，由脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原稀釋而成，其中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度包括1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL共6個濃度，質(zhì)控品分為質(zhì)控低值和質(zhì)控高值，濃度范圍依次為150±15ng/mL、300±35ng/mL；載體為微孔板、磁性顆?；蛩芰瞎埽挥糜跇?biāo)記的酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；化學(xué)發(fā)光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷或魯米諾；分析緩沖液為含有1％牛血清白蛋白和0.05％吐溫-20的10mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4；濃縮洗滌液為含有1％吐溫-20的20mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.2-7.4。如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒制備方法包括以下步驟：S101：制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；S102：制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體；S103：制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶標(biāo)記物；S104：制備化學(xué)發(fā)光底物液；S105：制備分析緩沖液；S106：制備濃縮洗滌液；S107：組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。本發(fā)明具體的方法如下：步驟一，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；步驟二，制備包被有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的載體：載體為微孔板或塑料管時，包被載體可通過以下方法制備：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25℃)干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述 包被緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽溶液，所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；所述稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；所述包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；所述封閉緩沖液為pH7.2-7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；所述封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30％；載體為磁性顆粒時，包被載體可通過以下方法制備：吸取3mL內(nèi)含2％磁顆粒的PBS溶液，用磁力架分離，用去離子水清洗；用清洗液清洗磁顆粒并調(diào)整體積至6mL；加入5mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，置于4℃內(nèi)混勻30min；加入12mg碳二亞胺，置于4℃內(nèi)孵育過夜；用pH7.4、100mmol/LPBS緩沖液清洗磁顆粒；加入Tris和EDTA，使終濃度依次為50mmol/L和4mmol/L；調(diào)節(jié)pH至7.4，抗體終濃度為1mg/mL，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述清洗液為pH6.0、10mmol/LPBS緩沖中液；步驟三，制備脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶標(biāo)記物：用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；用于標(biāo)記的酶為辣根過氧化物酶時，酶標(biāo)記抗體的制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體 酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；步驟四，制備化學(xué)發(fā)光底物液：上述堿性磷酸酶標(biāo)記抗體對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物為3-(2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)，所述AMPPD化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；上述辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾，所述魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法為：基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯(lián)苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調(diào)整pH至8.0；基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調(diào)整pH至7.6；步驟五，制備分析緩沖液，分析緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300；步驟六，制備濃縮洗滌液，濃縮洗滌液為pH7.2-7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內(nèi)含1％吐溫-20；步驟七，組裝脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、分析緩沖液及濃縮洗滌液組裝成脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。結(jié)合以下的實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用效果做進(jìn)一步的說明：實(shí)施例1：本發(fā)明實(shí)施例的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、包被載體、堿性磷酸酶酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液AMPPD、分析緩沖液、濃縮洗滌液；其中：1.標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品用下述方法制成：用pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液與胎牛血清按體積比3∶1比例混合配制成基礎(chǔ)緩沖液，用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為1000、500、250、100、50、0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品；用基礎(chǔ)緩沖液將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2重組抗原稀釋成濃度為300ng/mL高值質(zhì)控品和150ng/mL低值質(zhì)控品，高、低質(zhì)控品的濃度測定范圍經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定為300±35ng/mL、150±15ng/mL；2.包被微孔板的制備步驟為：脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體用包被緩沖液稀釋，取待包被載體，將經(jīng)過稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體負(fù)載于載體上，包被結(jié)束后，吸去包被緩沖液，再加入封閉緩沖液，置于37℃封閉2小時或4℃封閉過夜；棄去封閉液，室溫(18-25℃)干燥3-4小時后加入干燥劑密封包裝，得到脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體包被載體，所述包被緩沖液為pH7.2、10mmol/L磷酸鹽溶液，所述脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的稀釋濃度為5ug/mL；所述稀釋的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體在載體上的包被量可為每孔100ul；所述包被的條件可置于37℃包被2小時或4℃包被過夜；所述封閉緩沖液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300及3％蔗糖；所述封閉緩沖液的加入量可為每孔300ul；所述封閉后包被載體的干燥環(huán)境相對濕度小于30％；3.堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的制備方法為：采用戊二醛交聯(lián)法將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，用pH7.2、10mmol/LPBS緩沖液充分透析，在透析后的結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、20mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；4.化學(xué)發(fā)光底物液AMPPD的配制方法為：稱取24g三羥甲基氨基甲烷、160gNaCl、4gKCl，吸取0.5mLProclin300、200mLAMPPD，用去離子水定容至1000mL；試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品線形圖如圖2所示；5.分析緩沖液的制備配方為：pH7.4、10mmol/LPBST緩沖液，內(nèi)含1％BSA、0.1％Proclin300；6.濃縮洗滌液的制備配方為：pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液，內(nèi)含1％吐溫-20：7.半成品及成品組成：上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品，隨機(jī)抽取三批進(jìn)行特異性、精密度、靈敏度及穩(wěn)定性檢驗(yàn)，合格后組裝為脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用塑料管替代實(shí)施例1步驟2中的微孔板，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；用磁性顆粒替代實(shí)施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)施例2：一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒包括以下組分：1.標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品(同實(shí)施例1)：2.包被載體(同實(shí)施例1)3.辣根過氧化物酶標(biāo)記物，其制備方法為：溶解2mg辣根過氧化物酶于 1mL去離子水中，加入0.4mL50mmol/L過碘酸鈉溶液，4℃緩慢搖動30min，用pH4.4、1mmol/L醋酸鈉緩沖液透析過夜，加入2mg脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體，4℃震蕩過夜，使用400ul200mmol/LNaBH4溶液進(jìn)行還原，經(jīng)pH7.4、20mmol/LPBS緩沖液透析過夜后用HPLC二次純化，收集蛋白峰，加入等體積甘油，-20℃以下保存；標(biāo)記好的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體酶結(jié)合物可用20％胎牛血清稀釋液稀釋至工作濃度，可置于4℃保存至有效期，所述胎牛血清稀釋液為pH7.4、10mmol/LPBST溶液，內(nèi)含20％胎牛血清、5％蔗糖、0.1％Proclin300、0.01％食品紅；4.化學(xué)發(fā)光底物液魯米諾，其配制方法為：基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物A液，含有1.75g魯米諾、0.05g4-羥基聯(lián)苯、0.011g4-碘苯硼酸、9.8g硼酸、4.5g硼砂，用去離子水定容后調(diào)整pH至8.0；基于1000mL化學(xué)發(fā)光底物B液，含有0.34g過氧化脲、1mL吐溫-20、51.6gNa2HPO4·12H2O、8.5gNaH2PO4·2H2O，用去離子水定容后調(diào)整pH至7.6；5.分析緩沖液(同實(shí)施例1)；6.濃縮洗滌液(同實(shí)施例1)；7.半成品及成品組成(同實(shí)施例1)；實(shí)驗(yàn)證明：用塑料管替代實(shí)施例1步驟2中的微孔板，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；用磁性顆粒替代實(shí)施例1步驟2中的微孔板，并在所述試劑盒中放入空白微孔板或塑料管，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.3或7.4的包被緩沖液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.2的包被緩沖液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.2或7.3的封閉緩沖液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.4的封閉緩沖液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)驗(yàn)證明：用pH為7.2或7.3的濃縮洗滌液替代實(shí)施例1步驟2中的pH值為7.4的濃縮洗滌液，其他同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；實(shí)施例3：以下給出采用實(shí)施例1中制備的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測臨床樣本中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的具體操作方法：1.樣本處理：待測樣本為血漿時，用EDTA抗凝管取血2mL，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；待測樣本為血清時，用普通管或促凝管取血2mL，4℃下放置30分鐘后，1500r/min離心10分鐘，收集上清液；2.樣本檢測：將樣本、分析緩沖液加到固相有脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體的微孔板中，反應(yīng)30min后，樣本中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與固相抗體特異性結(jié)合，洗去游離成分，加入酶標(biāo)記物避光反應(yīng)30min，被酶標(biāo)記的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗體與抗原、固相抗體形成“夾心”復(fù)合物，洗去游離成分，加入發(fā)光底物液，避光反應(yīng)5min后測定各孔發(fā)光值RLU，樣本的RLU與其中的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2抗原濃度正相關(guān)，樣本濃度依據(jù)樣本的RLU數(shù)值可進(jìn)行定量計(jì)算；實(shí)施例4：以下給出按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實(shí)施例1中制備的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果見表1：表1檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果靈敏度≤10ng/mL符合標(biāo)準(zhǔn)精密度CV(％)批內(nèi)＜5％，批間＜10％符合標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確性平均回收率101.51％±1.23％符合標(biāo)準(zhǔn)特異性與類似物的交叉反應(yīng)率≤0.01％符合標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性各試劑組分置于37℃至少7天，仍保持穩(wěn)定符合標(biāo)準(zhǔn)說明本發(fā)明的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)指標(biāo)符合國家體外診斷試劑規(guī)范；實(shí)施例5：以下給出使用實(shí)施例1中制備的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒與美國PLAC公司脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2酶聯(lián)免疫測定試劑盒共同檢測150份心血管病人樣本的相關(guān)性結(jié)果；1.臨床樣本的來源：從天津市武警總醫(yī)院收集心血管病人血清樣本150份，其中動脈粥樣硬化患者81例，冠心病患者69例；2.使用實(shí)施例1的試劑盒(按實(shí)施例3操作)和PLAC試劑盒(按其說明書操作)分別對150份血清樣本進(jìn)行檢測；3.兩種試劑盒的測定結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩種方法檢測的結(jié)果高度相關(guān)，見附圖3，相關(guān)系數(shù)r＞0.98，P＜0.01，說明兩種方法具有同等的使用價值，但本發(fā)明制備的一種脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒成本低廉，操作簡便、快速，更易于推廣；以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3