本發(fā)明涉及光譜分析技術(shù)中拉曼分析芯片領(lǐng)域，尤其涉及一種有、無受體二氧化鈦納米金屬膜拉曼芯片及制作方法。

背景技術(shù)：

用表面近場增強拉曼散射(SERS)效應(yīng)原理建立的表面近場增強拉曼光譜(SERSp)分析技術(shù)，最常采用的是一種用納米銀粒子與液相樣品摻比混合吸進毛細管的拉曼樣品池；此外有多種拉曼樣品池技術(shù)方案已公開，例如：在毛細管內(nèi)壁先構(gòu)筑TiO₂納米管陣列，通過Sn離子偶聯(lián)再將銀納米粒子修飾在TiO₂管陣列表面的毛細管樣品池“CN102706857A，一種多功能表面增強拉曼散射基底的制備方法”；在毛細管內(nèi)制備三維多孔有序的SiO₂反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體，再利用原位還原或者靜電吸附方法在SiO₂反蛋白石結(jié)構(gòu)內(nèi)修飾金納米粒子的毛細管樣品池“CN103257134A，一種基于毛細管的表面增強拉曼散射基底的制備方法”；用納米銀粒子與液相樣品摻比混合注入納米金屬柱群的小盒型微流通道拉曼芯片“CN203929645U，一種表面增強拉曼散射探測芯片及其制備方法”，等；當前，后三者的靈敏度比前者約低1～2個數(shù)量級。

多年來，在許多實驗室的研究工作中開發(fā)、應(yīng)用的在平板上制作“微米-納米”的坑、三角形錐、納米碳管、纖維絲等多種有序、無序陣列片基，或直接用濾膜、濾紙作片基，再滴上納米銀或金溶膠或修飾上銀或金納米粒子，作SERS基底；也有直接在透明平板上修飾銀或金納米粒子膜的SERS基底，有序的納米坑、錐陣列SERS片基已有商品面市，使用者都需要自己配制銀納米溶膠使用，這不僅有需要自己配制銀膠的不方便，而且增強因子對許多低豐度痕量樣品分析靈敏度都還不夠高。

當前，使用液相樣品與銀納米粒子摻配混合注入各種拉曼樣品池方式都存在三個局限和問題：一、銀納米粒子的拉曼增強活性功能容易被空氣中的氧化過程衰降和破壞，其拉曼增強活性的儲存壽命期限很短、大約兩周，因此，至今尚無拉曼增強活性儲存期長的銀納米粒子商品面市。許多拉曼分析研究室用的銀納米粒子多為自己配制，即配即用，此種情況在常規(guī)拉曼分析服務(wù)檢測中是很不方便的，渴望有貯存活性期長的、使用方便的銀納米粒子-拉曼樣品池芯片商品面市；二、對液相樣品SERS定量檢測低豐度痕量物質(zhì)，不僅靈敏度還不夠高，檢測結(jié)果的均勻性、穩(wěn)定性和重復(fù)性也不夠好，定量分析是多年來尚未解決好的一個關(guān)鍵問題；三、對氣相樣品由于銀粒子較大，將銀納米粒子摻配均勻混合氣相樣品非常困難，因此氣相樣品摻配混合銀納米粒子的拉曼樣品池芯片均不適用。

國內(nèi)外的微流控通道型的SERS拉曼芯片已公開的不外兩種，其一是SERS金屬納米粒子在微流控通道內(nèi)摻比與液相樣品混合可以流動的拉曼芯片，其二是SERS金屬納米粒子在微流控通道內(nèi)被修飾固定在微流控通道內(nèi)，液相和氣相樣品均可在微流控通道內(nèi)流動的拉曼芯片；國內(nèi)前述例舉CN102706857A，和CN203929645U即為其一，CN103257134A即為其二拉曼芯片。國外，如Tachan Park(Tachan Park(Tachan Park，Lab Chip，2005，5：437-442)報道的將銀溶膠與兩種寡核苷酸的混合溶液注入微流控通道即為前者拉曼芯片，此類方法與我們常規(guī)應(yīng)用的液相樣品與納米銀粒子摻比混合吸進毛細管的拉曼樣品池有同樣的局限和缺點；Gang L Li等(Appl.Phys.Lett.，2005，87，074101)報道的先用光刻技術(shù)在基板上先制備半球二甲基硅氧烷，再在其上用電子束蒸發(fā)局部沉積銀納米膜，組裝成后一種微流控通道拉曼芯片，這種方法不僅工藝復(fù)雜、設(shè)備昂貴、靈敏度也不夠高。

2004年發(fā)明人指導(dǎo)研究生發(fā)表論文“北京納米結(jié)構(gòu)和材料的光電子和光譜國際會議論文，SPIE，5635：31-37”中，已公開我們在理論模擬中發(fā)現(xiàn)的納米“銀箔/銀粒子”-膜存在“常規(guī)熱點”+“非常規(guī)熱點”，此種結(jié)構(gòu)設(shè)計熱點的密集度特別高，其靈敏度將因此獲得特別的增加。2013年，又指導(dǎo)研究生發(fā)表論文“J.Phys.Chem.C 2013，117，6861-6871，Controlled Preparation of Uniform TiO2-Catalyzed Silver Nanoparticle Films for Surface-Enhanced Raman Scattering”公開了可控制作均勻的二氧化鈦SERS納米銀粒子膜論文，該論文初步研究了一些可控的生長方法，在二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”-膜的前期研究中是有很好進展的；但限于當時我們的認識水平局限，最關(guān)鍵的兩項控制和三項最佳控制標準參量沒有解決：一、影響SERS納米銀粒子膜質(zhì)量最靈敏、最關(guān)鍵的、需要控制的環(huán)節(jié)——要求光催化控制生長實現(xiàn)多數(shù)銀粒子緊挨、間隙接近0，＜3nm的同時，多數(shù)銀粒子的直徑與激勵激光束的波長正好共軛——問題沒有 解決；二、沒有注意到二氧化鈦薄膜厚度產(chǎn)生的多次反射，由于有銀箔的反向反射參與，比較嚴重地干擾激勵樣品光束的相干性質(zhì)量，從而降低SERS膜的增強效率，這個重要問題當時我們沒有注意到，因而對二氧化鈦膜厚的控制問題沒有研究和解決；三、同樣非常重要的是SERS膜的生產(chǎn)工藝全過程中有三個關(guān)鍵工藝的最佳控制標準參量沒有討論和提出，它對保證生產(chǎn)每件SERS膜的質(zhì)量，特別是保證產(chǎn)品的一致性和穩(wěn)定性非常重要，這是當前國內(nèi)外開發(fā)高性能的SERS芯片尚未解決的難題，不解決此問題也就不能開發(fā)成為高性能的SERS芯片。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一種有、無受體二氧化鈦納米金屬膜拉曼芯片，拉曼芯片由兩部分組成，載體和表面增強拉曼散射活性膜，簡稱為SERS-膜；載體有毛細管型、小盒型和微流控通道型三種類型，SERS-膜分為有和無“受體”修飾的二氧化鈦納米金屬膜兩種類型；SERS-膜在上述三種載體的內(nèi)壁或透明窗口貼壁生長，其制作步驟：第一步采用溶膠凝膠方法鍍二氧化鈦納米薄膜并散粒晶態(tài)化；第二步在二氧化鈦薄膜表面用可控的光催化方法生長納米金屬膜，為納米“銀箔/銀粒子”膜，它是高靈敏度的二層SERS-膜；第三步依據(jù)拉曼分析目標物“給體”分子的需要，利用“氫鍵結(jié)合力”或“免疫結(jié)合力”，將具有特異配位結(jié)合力的“受體”分子修飾在上述二層SERS-膜的表面，成為特異性好、超高靈敏度的三層SERS-膜，第三層的“受體”分子種類數(shù)根據(jù)拉曼分析多目標物“給體”分子種類數(shù)的需要設(shè)計，成為多受體修飾的三層SERS-膜，二層SERS-膜拉曼芯片是無受體修飾的拉曼芯片，它是有受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)品，用三層SERS-膜組裝成為超高靈敏度的三層SERS-膜拉曼芯片。

實現(xiàn)納米“銀箔/銀粒子”膜是個難題，它的基本要求是：銀箔很薄納米級，銀粒子又要很結(jié)實緊貼在銀箔上緊挨，多數(shù)銀粒子尺度又要與激勵激光束的波長共振耦合；納米“銀箔/銀粒子”二層SERS-膜的特征是，在透明度很好的玻璃基底上，貼壁鍍二氧化鈦溶膠-凝膠薄膜——經(jīng)高溫焙烤、退火，將其散點式的轉(zhuǎn)化為銳鈦礦型隨機點陣斑點結(jié)晶化膜，薄膜厚度等于或接近激勵激光束在薄膜中的半波長或四分之一波長——通過紫外光催化生長納米“銀箔/銀粒子”膜，該方法利用銳鈦礦型結(jié)晶化隨機點陣的各斑點光催化效率很高，而該點陣背景基底仍為非晶化的二氧化鈦凝膠薄膜，其光催化效率又極低的特性，自然生長出納米“銀箔/銀粒子”膜，要求該膜的銀箔很薄，多數(shù)銀粒子緊挨，其銀納米粒子的直徑等于或接近λ/2或λ/4。

目前，幾乎所有高靈敏度的SERS拉曼活性基底都存在分析結(jié)果的重復(fù)性差、一致性和穩(wěn)定性不好問題，用于絕對定量分析誤差太大，這是一個十多年來學(xué)界、產(chǎn)家攻關(guān)未獲結(jié)果的難題；其根本的原因是銀粒子膜的制作要求十分精細、苛刻——要求銀粒子的大小與激勵激光束波長共振耦合的同時，銀粒子必須緊挨，其間距≤2nm，難于做到，而且要求各塊銀粒子膜產(chǎn)品都能達到相同標準，就更難；如果銀粒子的平均間距都大于4納米，SERSp的拉曼信號就將下界一個數(shù)量級；因此，在SERS銀粒子膜的制作工藝中如果沒有嚴格的控制方法和控制標準，將無法解決SERSp分析結(jié)果的重復(fù)性差、一致性和穩(wěn)定性問題。為解決此問題，本發(fā)明提出納米“銀箔/銀粒子”二層SERS-膜及其最佳制作控制方法和創(chuàng)建最佳控制標準參量，其特征是：三項最佳設(shè)計指標：二氧化鈦最佳膜厚d_best＝λ/2n或λ/4n，n是膜的平均折射率，銀粒子的最佳直徑φ_best＝λ/2或λ/4和銀粒子的最佳間距Δ_best接近0≤2nm；在制作最佳納米“銀箔/銀粒子”二層SERS-膜的關(guān)鍵工藝中，分別設(shè)置最佳控制標準參量，保證產(chǎn)品高靈敏度、高一致性、高穩(wěn)定性：一、調(diào)整二氧化鈦薄膜厚度d，是通過二氧化鈦溶膠-凝膠制膜提拉速度，即液面脫離片基的速度υ完成的，膜厚d與液面脫離速度υ的關(guān)系d-υ曲線通過在線的預(yù)備實驗建立；通過在生產(chǎn)線上創(chuàng)建最佳控制標準參量系統(tǒng)A循環(huán)的多次調(diào)正實驗，建立最佳控制標準參量υ_st；通過實測薄膜的熒光可見透過率光譜曲線的理論擬合方法，給出膜厚d數(shù)值，當建立了薄膜透過率曲線的第一峰位W與d關(guān)系曲線之后，就可以比較簡單地通過W直接讀出薄膜的厚度d；最后通過A循環(huán)的調(diào)正，要求d_st等于或接近理論設(shè)計的最佳指標λ/2n或λ/4n；二、控制二氧化鈦薄膜的最佳焙烤溫度T_st和時間t_st，要求轉(zhuǎn)化為散粒銳鈦礦型晶化的隨機點陣斑點的密度恰到好處，使實施光催化結(jié)果多數(shù)銀納米粒子的中心間距等于或接近λ/2或λ/4，在此條件下，當銀粒子緊挨時，正好滿足多數(shù)銀納米粒子的直徑等于或接近λ/2或λ/4，創(chuàng)建最佳焙烤溫度標準參量T_st和時間t_st，需要通過A循環(huán)的調(diào)正來完成；三、用在線創(chuàng)建最佳控制標準參量系統(tǒng)B循環(huán)的調(diào)正實驗控制光催化生長時間τ，創(chuàng)建最佳控制標準兩個參量：以在線檢測的TiO₂-545nm譜線發(fā)射峰位為底的SPR峰 高H₅₄₅和光催化時間τ_st，前者為主，因為它直接與SPR相關(guān)，后者為輔是參考標準；實施上述三項最佳控制標準參量的總目的，達到或接近理論最佳設(shè)計的三項指標，其中最關(guān)鍵的是要使多數(shù)銀納米粒子緊挨，間隙接近0≤2nm，這是最重要的對拉曼增強因子影響最敏感的參量，通過原子力顯微鏡成像檢測、分析，和紫外可見吸收光譜的檢測，最后還需要通過R6g的SERSp有關(guān)的比較實驗驗證、確認。

為了超低豐度痕量分子的拉曼分析，需要在拉曼芯片二層SERS-膜的基礎(chǔ)上，修飾第三層與檢測目標物給體分子有特異結(jié)合位點的受體分子膜，其特征是，根據(jù)拉曼芯片分析檢測目標“給體”分子的配位結(jié)合要求，和“氫鍵結(jié)合力”或“免疫結(jié)合力”方式的選擇，利用氫鍵化學(xué)或免疫化學(xué)的已有經(jīng)驗，確定“受體”分子的種類，利用配位結(jié)合力修飾，將“受體”分子修飾在二層SERS納米“銀箔/銀粒子”膜的表面，成為三層SERS-膜；在修飾某些三層SERS-膜時，需要預(yù)先修飾過渡偶聯(lián)分子膜，而一些偶聯(lián)分子膜的界面與納米“銀箔/銀粒子”膜的銀質(zhì)界面親和特性不如金質(zhì)界面好時，需要在納米“銀箔/銀粒子”膜上，鍍一層金原子膜，使其成為納米金屬“銀箔/銀粒子鍍金”膜。

為了實現(xiàn)對超低豐度痕量檢測目標“給體”分子拉曼分析，氫鍵結(jié)合力和免疫結(jié)合力受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片可進一步提高其靈敏度、信噪比和特異性，在使用時需要配置樣品濃縮、富集系統(tǒng)和清洗系統(tǒng)，其特征是，在有氫鍵結(jié)合力和免疫結(jié)合力受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片的進、出樣品口，配置氣相或液相樣品可控微流動驅(qū)動器，驅(qū)使氣相或液相樣品的可控定量循環(huán)流動，使超低豐度痕量檢測目標“給體”分子在三層SERS-膜表面的“熱點”中有效實現(xiàn)“給體”分子的濃縮、富集，提高定量或半定量的拉曼分析靈敏度；隨后，利用很低拉曼活性的氣體或純凈水的流動，完成檢測目的物拉曼譜背景分子的清洗，提高檢測目標“給體”分子特征拉曼指紋譜的信噪比和特異性。

毛細管型二層SERS-膜拉曼芯片是中間產(chǎn)品，靈敏度高，重復(fù)性和一致性好，可以常年保持拉曼增強活性，使用很方便，其特征是，采用透明度很好的空心薄壁硬質(zhì)中性玻璃或石英玻璃毛細管，常規(guī)管型為圓形也可設(shè)計為非圓形，管的內(nèi)徑約數(shù)百微米，管長一般為10～120公分，緊貼毛細管內(nèi)壁用溶膠-凝膠法制作二氧化鈦薄膜，經(jīng)高溫焙烤退火后轉(zhuǎn)化為散粒品化薄膜，通過光催化生長納米“銀箔/銀粒子”膜，其中多數(shù)銀粒子緊挨、粒子尺度與激勵激光束波長共軛；毛細管內(nèi)用純凈水洗凈后，氮氣吹干，封口；毛細管的封口可用緊密蓋封、臘封，和拉錐封，拉錐封的芯片拉曼活性儲存壽命可已超過一年，在拉錐封口近處兩端各刻一條細線痕，使用時在此線痕處扮斷毛細管，打開封口，吸入液相樣品或注入氣相樣品提供拉曼檢測。

毛細管型拉曼芯片鍍SERS-膜的方法和設(shè)備的特征是，利用可控鍍膜提拉機與鍍膜液虹吸系統(tǒng)，構(gòu)建毛細管鍍SERS-膜設(shè)備，將鍍膜溶劑吸入/排出毛細管的方法制作SERS-膜，可控鍍膜提拉機(5)有一個可控的垂直移動提拉部件，用于提拉被真空橡皮塞密封的移動液池(6)，將多根毛細管(1)垂直插入真空橡皮塞(10)內(nèi)一小段，由鍍膜提拉機控制的移動液池(6)與固定液池(7)用真空橡皮(8)連通，組成虹吸系統(tǒng)，在加入適量的鍍膜溶液(9)之后，利用此虹吸鍍膜系統(tǒng)，毛細管中液面的上下移動，驅(qū)使鍍膜液在毛細管中的吸入/排出，用可控智能鍍膜提拉機的參數(shù)設(shè)置，自動操作完成鍍膜程序；溶膠-凝膠法制作毛細管中二氧化鈦薄膜的最佳厚度的控制，通過調(diào)整毛細管中液面下降排出二氧化鈦溶膠的速度完成；二氧化鈦薄膜和修飾“受體”分子膜均用上述方法制作，只要通過鍍膜提拉機控制參數(shù)適當設(shè)置即可自動完成；在完成最佳二氧化鈦薄膜工序后，將毛細管取出放在高溫烤爐中焙烤，精確控制在線的最佳焙烤溫度T_st和時間t_st，使二氧化鈦凝膠薄膜產(chǎn)生隨機點陣散粒式的銳鈦礦型結(jié)品化的轉(zhuǎn)變；此后，再次放入毛細管鍍膜系統(tǒng)，用硝酸銀溶液，配置紫外燈光(11)照射，通過精確控制在線的最佳光催化時間τ_st光催化還原方法制作納米“銀箔/銀粒子”膜，在鍍納米金屬膜整個過程中，毛細管內(nèi)需要更換多次新舊鍍膜液，通過鍍膜提拉機吸入/排出鍍膜溶劑參數(shù)的設(shè)置、自動完成。

毛細管型拉曼芯片鍍SERS-膜的另一個方法和設(shè)備的特征是，利用毛細管吸附力和精密調(diào)整氮氣壓力控制鍍膜溶劑的吸入/排出毛細管的方法，將多根毛細管(1)一字型排列垂直插入真空橡皮塞(10)內(nèi)一小段，氮氣瓶(16)的精密調(diào)壓閥(15)的管路連接到另一真空橡皮塞(10)，兩個真空橡皮塞與有放氣閥(12)的玻璃管組成一個密閉小室(14)，將毛細管的另一端浸入鍍膜液池(13)二氧化鈦溶膠液面下一小段，與鍍膜液面傾斜大約15度，利用毛細管的表面吸附力將鍍膜液吸入毛細管；通過調(diào)整氮氣瓶的精密調(diào)壓閥(15)，即可將二氧化鈦溶膠以設(shè)置的最佳速度排出毛細管，最后一次排出二氧化鈦溶膠速度將決定二氧化鈦溶膠-凝膠粘附在毛細管內(nèi)壁的厚度；在完成最佳厚度二氧化鈦薄膜工序后，將毛細管 放在450度左右的烤爐中，精確調(diào)整在線的最佳焙烤溫度T_st和時間τ_st，使二氧化鈦凝膠薄膜產(chǎn)生隨機點陣散粒式銳鈦礦型結(jié)晶化的轉(zhuǎn)變；此后，再次放入毛細管鍍膜系統(tǒng)，用硝酸銀配置紫外燈光(11)照射，通過光催化還原方法制作納米“銀箔/銀粒子”膜；在毛細管型拉曼芯片二層SERS-膜的基礎(chǔ)上修飾受體分子膜的方法與上述鍍二氧化鈦薄膜方法類同，一般修飾1種受體分子膜，當修飾大于2的多種受體分子膜時，例如多至3～5種，事先需要將它們混合在一起，再完成修飾，成為毛細管型多受體修飾的拉曼芯片；清洗毛細管拉曼芯片SERS-膜的過程，需將洗滌劑和純凈水通過的放氣閥(12)灌入密閉小室(14)，然后，通過調(diào)整氮氣精密調(diào)壓閥完成清洗和吹干毛細管內(nèi)壁。

小盒型多受體修飾的拉曼芯片的特征是，在小盒型拉曼芯片中，SERS-膜的基板與腔體采用分體設(shè)計，在鍍二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜的工藝中，采用可控提拉鍍膜機，在透明度很好的平片玻璃上制作二層SERS-膜，其上再修飾光柵式的多受體分子膜，一種受體分子膜修飾成光柵中的一條線，受體分子種類數(shù)可以多達數(shù)十，其修飾工藝，采用可控多噴墨針頭，在小盒型的二層SERS-膜上，將多種受體分子溶膠寫成光柵形多受體分子膜，在小盒型腔體上設(shè)計進、出樣的孔道一對，再將光柵式多受體分子修飾的三層SERS-膜基板與小盒型腔體嚴密封裝成光柵式修飾多受體小盒型拉曼芯片。

在微流控通道型拉曼芯片中修飾多受體的種類數(shù)，可以比小盒型多受體修飾的拉曼芯片設(shè)計更多的受體種類數(shù)，微流控通道型拉曼芯片修飾多受體種類膜成矩陣式的結(jié)構(gòu)，其特征是，在微流控多通道型拉曼芯片中，將多通道結(jié)構(gòu)設(shè)計成光柵形排列，在同一塊二層SERS-膜的基礎(chǔ)上，將多種受體修飾成矩陣式點線光柵形分布的三層SERS-膜，每條受體點線光柵上修飾多種不同種類受體，一種受體修飾成一個點斑，各條受體光柵之間的受體種類都不相同，總計最多修飾的受體種類數(shù)可以多至上百；修飾多受體的工藝，采用可控多噴墨針頭，將多種受體分子溶膠寫成矩陣式排列的多受體分子膜；微流控多通道的腔體也設(shè)計成間距相同的光柵形排列，進、出樣口可設(shè)計成每條通道一對，也可以分組設(shè)計多對進、出樣口，最后將矩陣式排列的多受體分子膜基板與微流控多通道腔體嚴密組裝成矩陣式修飾多受體的微流控多通道拉曼芯片。

附圖說明

圖1納米“銀箔/銀粒子”二層SERS-膜及其最佳制作控制方法和創(chuàng)建最佳控制標準參量

圖2(A)二氧化鈦膜厚～透射峰位關(guān)系曲線，利用透射光譜的透射峰位檢測二氧化鈦薄膜厚度，(B)前期實驗結(jié)果，用于演示和方便說明在線創(chuàng)建W～d關(guān)系曲線

圖3(A)創(chuàng)建在線熒光可見吸收光譜的SPR峰高最佳控制標準參量H₅₄₅、和光催化時間最佳控制標準參量τ_st，(B)前期實驗結(jié)果，用于演示和方便說明在線創(chuàng)建H₅₄₅

圖4利用可控鍍膜提拉機和鍍膜液的虹吸系統(tǒng)制作毛細管型拉曼芯片

圖5利用毛細管吸附力和精確調(diào)整氮氣壓力控制制作毛細管型拉曼芯片

圖6毛細管型SERS-膜拉曼芯片示意圖

圖7小盒型拉曼芯片制作工藝流程圖

圖8多種受體分子修飾微流控通道型拉曼芯片結(jié)構(gòu)示意圖

圖9用相同濃度R6g10^-7Mol/L的(A)二層SERS-膜毛細管型芯片初步實驗結(jié)果，與(B)毛細管摻配銀納米粒子樣品池最佳的結(jié)果比較

圖10初步研制的二層SERS-膜與毛細管摻配銀粒子樣品池的靈敏度的比較結(jié)果，(A)為用同一濃度R6g10^-6Mol/L檢測的SERSp結(jié)果比較，(B)為用同一健康人的血清檢測的SERSp結(jié)果比較

具體實施方式

1、毛細管型有、無受體二氧化鈦納米金屬膜拉曼芯片的具體實施方法

毛細管型拉曼芯片的結(jié)構(gòu)參見圖6，毛細管(1)中鍍TiO₂膜(2)，TiO₂膜上生長納米“銀箔/銀粒子”膜(3)，該膜上修飾受體分子膜(4)，毛細管進、出樣口密封段(5)的兩端近處各有很細的刻痕，使用芯片前在此刻痕處可方便扮斷、開口，備用；毛細管型拉曼芯片具體實施方法如下：

第一步：洗凈硬質(zhì)中性玻璃或石英玻璃毛細管，內(nèi)徑約0.5mm，外徑1.0mm，長100mm；

第二步：制備TiO₂溶膠：將50mL的鈦酸丁酯和3mL的乙酰丙酮混合并攪拌10min(稱為A溶液)；同時，將110mL的無水乙醇、1.4mL的去離子水和0.2mL的硝酸混合并攪拌10min(稱為B溶液)。然后， 在A溶液攪拌過程中，將B溶液逐滴加入到A溶液，并繼續(xù)攪拌30min，最后形成TiO₂溶膠；

第三步：利用可控鍍膜提拉機(50-300mm/min)和虹吸原理組裝的設(shè)備，或利用精密調(diào)壓閥-氮氣可控吹氣鍍膜系統(tǒng)，依據(jù)激勵激光束的波長λ，利用溶膠-凝膠法在毛細管內(nèi)壁制備一層最佳膜厚的設(shè)計要求為λ/2n或λ/4n二氧化鈦薄膜，通過A循環(huán)多次預(yù)試驗，建立最佳膜厚的控制標準參量d_st，用于與最佳膜厚的設(shè)計指標比較，達到二者相等或接近；生產(chǎn)最佳二氧化鈦薄膜的具體方法是通過調(diào)整圖4的可控鍍膜提拉機的最佳提拉速度υ，或調(diào)整圖5的精密調(diào)壓閥的壓力，將二氧化鈦溶膠以速度υ吹出毛細管來完成，將最佳膜厚的控制標準轉(zhuǎn)移到最佳控制速度的控制標準υ_st，膜厚d與液面脫離速度υ的關(guān)系d-υ曲線通過預(yù)備實驗建立；

第四步：將毛細管內(nèi)壁按最佳厚度要求鍍好TiO₂凝膠后，放入煅燒爐、設(shè)置最佳控制溫度標準參量和時間焙烤，使其獲得散粒型的銳鈦礦型結(jié)晶化；通過A循環(huán)多次預(yù)試驗，大約在400-450℃域內(nèi)可以找到銳鈦礦結(jié)晶化的最佳控制標準溫度T_st和時間t_st參量，使用該標準參量控制二氧化鈦薄膜轉(zhuǎn)變銳鈦礦型結(jié)晶化隨機點陣斑點的密度恰到好處，可以使光催化生長納米“銀箔/銀粒子”膜達到多數(shù)銀粒子緊挨時，多數(shù)銀粒子的直徑恰好等于或接近激勵激光束的半波長λ/2或四分之一波長λ/4；

第五步：利用可控鍍膜提拉機見圖4，或利用毛細管力見圖5，將濃度為0.003M的AgNO3溶液吸入毛細管中，并用波長254nm，功率6W紫外燈照射，毛細管與紫外燈之間的距離大約6cm；在紫外燈光照射下通過TiO₂光催化過程，在TiO₂薄膜表面將硝酸銀的銀離子還原、生成銀納米粒子膜；銀納米粒子膜的結(jié)構(gòu)是緊密結(jié)合在很薄的銀箔上的密集的單層銀納米粒子膜，納米粒子的尺度利用光照催化時間來調(diào)整，采用在線的熒光可見吸收光譜檢測方法見圖3，檢測在線的以二氧化鈦545nm發(fā)射峰位為底的最佳控制標準參量SPR峰高H₅₄₅為標準，τ_st用作參考標準，要使多數(shù)銀納米粒子的間隙接近到零，這是保證高拉曼增強因子的關(guān)鍵；毛細管內(nèi)的AgNO₃溶液需要通過注入和吹排出，置換AgNO₃新舊溶液5-10次交換；使用智能的可控系統(tǒng)，自動完成毛細管內(nèi)新舊AgNO3溶液多次置換；

第六步：免疫受體修飾的毛細管型二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片實施方法，只要在二層SERS-膜的基礎(chǔ)上，依據(jù)免疫學(xué)有關(guān)成熱的經(jīng)驗，在圖4或圖5的鍍膜液池中更換成免疫受體鍍膜液，必要時先用有關(guān)的偶聯(lián)鍍膜液，就可以完成免疫受體修飾鍍膜程序，制作完成免疫受體修飾三層SERS-膜毛細管型拉曼芯片；如果一些免疫受體的拉曼活性太低，需要增加鍍活性較高的拉曼標記物分子，只要置換相關(guān)的鍍膜液就可以完成；

第七步：氫鍵受體修飾的毛細管型二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片實施方法，同樣只要在二層SERS-膜的基礎(chǔ)上，依據(jù)氫鍵結(jié)合有關(guān)成熱的經(jīng)驗，在圖4或圖5的鍍膜液池中更換成有關(guān)氫鍵受體鍍膜液，完成氫鍵受體修飾鍍膜程序；

第八步：氫鍵受體修飾的毛細管型拉曼芯片可以設(shè)計成氣相或液相樣品拉曼芯片，可以重復(fù)使用；在可重復(fù)使用的氫鍵受體修飾的毛細管型拉曼芯片的毛細管外表面必須鍍一層電加熱膜，適當加溫，并用清洗液和氮氣清洗毛細管芯片的內(nèi)壁，使已經(jīng)用過的有受體修飾的SERS-膜表面的給體-受體復(fù)合分子解結(jié)合，恢復(fù)原始狀態(tài)氫鍵受體修飾的毛細管型二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片的功能；

第九步：在完成毛細管內(nèi)壁TiO₂-銀納米粒子膜的上述功能化工藝流程之后，將內(nèi)壁清洗、氮氣吹干，加密封蓋、或蠟封、或火焰封死毛細管的兩個開口端，最后避光保存，將可保障超過1年的拉曼活性儲存壽命。

前期研究進展：我們曾初步研制毛細管型二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片，用SERSp實驗結(jié)果比較，前者的靈敏度比后者高出一個數(shù)量級：圖9A二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片R6g10^-7一Mol/L濃度的SERSp結(jié)果，和圖9(B)，是常規(guī)的摻配銀納米粒子-毛細管樣品池R6g10^-7Mol/L濃度的檢測SERSp結(jié)果；

2、小盒型拉曼芯片的實施方法

小盒型拉曼芯片舉例，四個制作工藝步驟如下：

第一步：在透明度很好的片基(17)表面，通過可控鍍膜提拉機鍍二氧化鈦納米凝膠薄膜，然后將此膜放在最佳焙烤溫度中晶化，完成隨機點陣銳鈦礦型結(jié)晶化的轉(zhuǎn)變(18)；

第二步：將此二氧化鈦結(jié)晶化薄膜放在硝酸銀溶液中，通過光催化還原生成最佳納米“銀箔(19)/銀粒子”膜(20)；

第三步：在納米“銀箔/銀粒子”膜的表面利用“氫鍵結(jié)合力”或“免疫結(jié)合力”修飾特異“受體”分子膜，如果檢測目標給體分子種類數(shù)≥3，應(yīng)將多種受體分子膜分開修飾成光柵型(21)分布；光柵形多種“受體”分子膜拉曼芯片在拉曼分析實驗時，需要檢測與光柵條數(shù)相同數(shù)目的SERSp；

第四步：將粘結(jié)有進樣口和出樣口毛細管(23)、拉曼芯片小盒罩(22)與鍍好SERS-膜的透明窗口玻璃緊密粘合封裝，組裝成小盒型拉曼芯片。

3、微流控通道型拉曼芯片的實施方法

多受體分子修飾的微流控通道型拉曼芯片，可以設(shè)計成單通道型和多通道型兩類：

一、微流控單通道型多受體分子修飾拉曼芯片，

第一步：在拉曼檢測窗口(17)玻璃片的內(nèi)壁鍍二氧化鈦納米“銀箔/銀粒子”膜(18-20)；

第二步：在該表面修飾多個至十數(shù)個“受體”分子斑點膜(24)，排列在一條直線上，斑點的尺度在0.5～1毫米；受體分子與拉曼檢測目標給體分子的配位結(jié)合力可以有氫鍵結(jié)合力和免疫結(jié)合力兩種方式；

第三步：直線型多“受體”分子斑點的制作工藝方法，可以采用可控多噴墨針頭完成；

第四步：在氫鍵結(jié)合受體的石英玻璃片窗口外壁鍍可控電加熱膜，就可以提供重復(fù)使用的適當加溫，使已經(jīng)使用過的“給體-受體”復(fù)合分子解結(jié)合，恢復(fù)拉曼芯片使用前的狀態(tài)；

第五步：通道腔體(25)上設(shè)計進、出樣通孔-滴樣皿(26)，或連接進、出樣毛細管，以便連接液相、氣相樣品的可控微流動驅(qū)動器，樣品池腔形一般設(shè)計為半圓柱槽形(27)；

第五步：將微流控單通道多受體分子修飾SERS-膜與通道腔體(25)組裝成多受體分子修飾的微流控單通道型拉曼芯片。

二、多受體分子修飾的微流控多通道型拉曼芯片的制作，可將多通道結(jié)構(gòu)平行設(shè)計成光柵型式，在同一塊二層SERS-膜上，將多種受體修飾成點線光柵形陣列式分布的三層SERS-膜，每條受體點線光柵上修飾多種不同種類受體，按一種受體一個點斑排列成點線光柵形矩陣式多種受體修飾三層SERS-膜，總計最多修飾的受體種類數(shù)可以上百，其他實施方法與上述類同。

三、前期研究進展：在前期預(yù)先研制的“TiO₂光催化-銀箔/銀粒子”膜，與“毛細管+摻配最佳銀膠”用R6g10^-6Mol/L做了SERSp比較實驗，圖10(A)明顯顯示，前者的靈敏度比后者高一個多數(shù)量級；我們還用同一健康人的血清作樣品，進行了比較，圖10(B)同樣明顯顯示，前者的靈敏度比后者高一個多數(shù)量級；由于前者的靈敏度比后者高，圖10(A-1)R6g10^-6Mol/L的SERSp中有1435和1635cm^-1兩條較小的拉曼峰，在圖10(A-2)R6g10^-6Mol/L的SERSp中檢測不到；同樣情況也發(fā)生在血清樣品的比較檢測中，圖10(B-1)血清的SERSp譜圖中，有790和1530cm^-1兩個較小的拉曼峰，在圖10(B2)血清的R6g10^-6M的SERSp譜圖中沒有檢測到。

4、免疫結(jié)合受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片的具體實施方法

第一步：再度提高拉曼芯片靈敏度的設(shè)計：在無受體修飾的拉曼芯片的靈敏度不能勝任的超低豐度痕量物質(zhì)分子拉曼分析時，有效的方法之一是利用免疫結(jié)合受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片，配置氣相或液相樣品的可控微驅(qū)動器，實施定量樣品循環(huán)流動通過芯片，使定量的檢測目標給體分子樣品不斷流過三層SERS-膜表面時與膜上的受體分子結(jié)合，生成“受體-給體”復(fù)合分子，即“抗體-抗原”牢固結(jié)合的復(fù)合分子，使芯片三層SERS-膜上結(jié)合的“給體”分子富集。再將樣品可控微驅(qū)動器的管路轉(zhuǎn)向清洗劑純凈水或氮氣供給源，清洗芯片中其他非檢測的背景分子，可以非常有效地降低干擾背景，提高“受體-給體”復(fù)合分子的拉曼指紋譜的信噪比；

第二步：高效“銀箔/銀納米粒子包金膜”的制作工藝與“銀箔/銀納米粒子”膜的制作基本相同，只是在鍍銀粒子膜的最后階段的幾分鐘將硝酸銀AgNO₃鍍膜液置換成適當濃度的氯金酸HAuCl₄鍍膜液，就可通過光催化完成納米“銀箔/銀粒子包金”膜；

第三步：用免疫受體修飾的三層SERS-膜的制作實施方法，完全可以借鑒免疫學(xué)積累的全部“抗原-抗體”有關(guān)知識和經(jīng)驗，采用的免疫結(jié)合力即抗原-抗體結(jié)合力，只要確定樣品中需要檢測的目標-給體分子是什么(抗原或抗體)分子，拉曼芯片中需要修飾的特異結(jié)合物的設(shè)計，就可依據(jù)成熱的“免疫學(xué)”找到與其對應(yīng)的受體分子(抗體或抗原)；

第四步：僅用1或2種免疫受體修飾三層SERS-膜拉曼芯片可采用毛細管載體設(shè)計，當免疫受體種類數(shù)≥3修飾的拉曼芯片則需要采用光柵形受體修飾的小盒型拉曼芯片(見圖7)和微流控通道型拉曼芯片 (見圖8)兩類設(shè)計，在光柵形受體修飾的小盒型拉曼芯片中，每種受體分子在光柵中被修飾成一條光柵線；在點線受體修飾的微流控通道型拉曼芯片中，，每種受體分子在點線中被修飾成一個受體斑點；多受體修飾的種類數(shù)應(yīng)根據(jù)市場需要設(shè)計，疾病篩查、診斷，食品安全檢測和農(nóng)藥殘留篩查等，均可采用多免疫受體種類數(shù)≥3修飾的拉曼芯片檢測方案，免疫受體種類數(shù)最多可以達到數(shù)十至一百。

5、用氫鍵結(jié)合修飾受體的三層SERS-膜拉曼芯片的具體實施方法

用氫鍵結(jié)合修飾受體的拉曼芯片中的三層SERS-膜的制作工藝方法與免疫受體拉曼芯片基本相同，其主要不同如下：

第一：用氫鍵結(jié)合的受體修飾三層SERS-膜的制作，完全可以借鑒氫鍵學(xué)積累的全部“給體-受體”有關(guān)知識和經(jīng)驗，將其應(yīng)用于氫鍵受體修飾三層SERS-膜拉曼芯片；見圖8，是多種受體分子修飾微流控通道型拉曼芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

第二：由于氫鍵結(jié)合力比較小，可以在三層SERS-膜的玻璃片基外表面設(shè)置電加熱膜加溫，使已與受體結(jié)合的給體分子解結(jié)合，再經(jīng)過可控微驅(qū)動器驅(qū)動清洗劑、純凈水或氮氣，清洗芯片，可以提供再次使用；

第三：在無受體修飾的拉曼芯片的靈敏度不能勝任的超低豐度痕量物質(zhì)分子拉曼分析時，利用氫鍵結(jié)合受體修飾的三層SERS-膜拉曼芯片及其檢測目的分子的富集是最有效的方法，使用該芯片需要配置氣相或液相樣品的可控微驅(qū)動器，控制定量樣品流過芯片，使檢測目標給體分子產(chǎn)生氫鍵配位的“受體-給體”結(jié)合的累積，實現(xiàn)檢測目的“給體”分子在檢測點富集，有效提高超低豐度痕量物質(zhì)分子的拉曼指紋譜分析的靈敏度；之后，再用清洗劑、純凈水或氮氣通過芯片，清洗芯片內(nèi)不能與受體結(jié)合的背景干擾分子，可以有效地提高超低豐度痕量物質(zhì)分子拉曼分析的信噪比。

本發(fā)明的效果和益處：

1、毛細管型二層SERS納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片比當前的常規(guī)毛細管摻配銀納米粒子樣品池靈敏度高1個多數(shù)量級，產(chǎn)品兩端密封，納米“銀箔/銀粒子”膜隔絕空氣保存，拉曼活性存儲期很長；使用很方便，可以用于環(huán)境污染治理檢測、食品有害添加劑篩查，農(nóng)藥殘留檢測，特別適用于開展大規(guī)模早期癌癥拉曼普及篩查中應(yīng)用。

2、將來廣泛的早期癌癥拉曼篩查工作，可以很方便地使用毛細管拉曼樣品池芯片專利商品；我們已經(jīng)采用毛細管摻配銀納米粒子樣品池，研究篩查肺癌和早期乳腺病方法，并已取得了比其他現(xiàn)在已經(jīng)在廣泛使用的血清篩查方法都好得多的進展，篩查早期肺癌尚需進一步提高系統(tǒng)的靈敏度和特異性。本發(fā)明中的毛細管型二層SERS納米“銀箔/銀粒子”膜拉曼芯片，微流控通道型拉曼芯片和小盒型拉曼芯片，將為今后早期肺癌和其他早期癌癥的篩查方法研究的突破提供重要支撐。

提高早期肺癌和其他早期癌癥的篩查方法研究關(guān)鍵在于提高檢測的靈敏度和特異性，肺癌細胞的新陳代謝標志物僅收集血清樣品篩查是不夠的、不全面的，再收集肺癌患者呼出氣中的多種易揮發(fā)性有機化合物VOCs標志物和隨著呼出氣體的氣流帶出肺部腫瘤病變EBC免疫標志物進行免疫拉曼篩查，將呼出氣拉曼篩查聯(lián)合血清拉曼篩查將非常有利于提高早期癌癥拉曼篩查的靈敏度和特異性。