一種單核細胞增生性李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種用于檢測單核細胞增生性李斯特菌的酶聯(lián)免疫試劑盒，它包括盒體，所述盒體內(nèi)設有自封袋和襯墊，所述自封袋內(nèi)設有包被了抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的酶標反應板，所述襯墊上設有數(shù)個容器孔，所述容器孔內(nèi)分別設有陽性對照溶液、陰性對照溶液、10×濃縮洗滌液、顯色液、終止液、酶標抗體溶液和酶標抗體稀釋液，所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的抗單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體。本實用新型的試劑盒可特異、高效地檢測單核細胞增生性李斯特菌。
【專利說明】一種單核細胞增生性李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于生物技術和免疫學領域，具體涉及一種檢測單核細胞增生性李斯特菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002]單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌，是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，也是唯一對人致病的、典型的胞內(nèi)寄生菌，可以導致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)和單核細胞增多等癥狀。1988年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organizat1n, WHO)發(fā)表“食源性李斯特菌病勸告書”，指導全世界各國如何預防李斯特菌污染和中毒。自此，LM成為新的重要的食源性疾病病原菌，WHO將其與E.coli 0157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四大食源性致病菌。該菌主要污染牛奶及乳制品、乳酪制品、肉制品香腸、加工禽類、生肉、魚、蝦、煙熏魚、生蔬菜。
[0003]目前單核細胞增生李斯特菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應大量的樣品篩查。免疫學檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定的快速檢測手段，但是檢測產(chǎn)品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產(chǎn)權，且可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以單核細胞增生李斯特菌為檢測靶標，所要求保護的技術涉及單核細胞增生性李斯特菌快速檢測產(chǎn)品。
實用新型內(nèi)容
[0004]本實用新型的目的是提供一種檢測單核細胞增生性李斯特菌的檢測試劑盒。
[0005]具體而言，本實用新型提供了一種單核細胞增生性李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，所述盒體內(nèi)設有自封袋和襯墊，所述自封袋內(nèi)設有包被了作為捕捉抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的酶標反應板，所述襯墊上設有數(shù)個容器孔，所述容器孔內(nèi)分別設有陽性對照溶液、陰性對照溶液、10X濃縮洗滌液、顯色液、終止液、酶標抗體溶液和酶標抗體稀釋液，所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的作為檢測抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體。
[0006]在一優(yōu)選例中，所述酶標反應板由支撐架和設于支撐架上的可拆卸式微孔條構成，所述微孔條上設有微孔，所述微孔中包被有作為捕捉抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體。
[0007]在另一優(yōu)選例中，所述的作為捕捉抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765產(chǎn)生，所述作為檢測抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系6D4H7C8B6，CGMCC N0.8002產(chǎn)生。
[0008]此外，在本實用新型的試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0009]本實用新型的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測原理及有益效果如下:
[0010]本實用新型的試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法。當在酶標反應板微孔條上預包被抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體(捕捉抗體)時，加入樣品溶液或標準品后，再加入辣根過氧化物酶標記的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體(檢測抗體)，樣品或標準品中存在的單核細胞增生性李斯特菌與酶標反應板上包被的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體相結合，加入檢測抗體后，會形成“抗體一抗原一酶標抗體”復合物，經(jīng)過TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色后會形成黃色物質(zhì)，從而判斷樣品中單核細胞增生性李斯特菌的存在與否以及存在的量。
[0011]用酶標儀于450nm下測定吸光度值。陰性對照彡0.1、陽性對照彡0.3，實驗結果有效，否則結果判定為無效；檢測孔OD值> 0.2時，判定為陽性；檢測孔OD值介于0.1-0.2之間時，判定為弱陽性；檢測孔OD值< 0.1判定為陰性。
[0012]試驗表明，本實用新型的單核細胞增生性李斯特菌酶聯(lián)免疫試劑盒，有較高的靈敏度和準確度。板間誤差小于5%，板內(nèi)CV小于3%。與出血性大腸桿菌0157:H7、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等均無交叉反應。
[0013]總之，本實用新型的試劑盒對樣品的前處理要求低，操作簡便，檢測極限為105cfu/ml，特異性和穩(wěn)定性好，并與大多數(shù)食源性致病菌都沒有交叉反應。
[0014]本實用新型各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求的描述，本實用新型的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是本實用新型的檢測試劑盒的結構示意圖；
[0016]圖2是本實用新型的檢測試劑盒的酶標反應板的示意圖。
[0017]附圖標記釋義:1.盒體；2.襯墊；3.容器孔；4.微孔板；5.支撐架；6.微孔條；
7.微孔。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人,分子克隆:實驗室指南(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0019]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本實用新型中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0020]實施例1.本實用新型的檢測試劑盒的組成、制備及其應用
[0021]一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成(如圖1、圖2):
[0022](I)預包被抗體的酶標反應板(4):酶標反應板由支撐架(5)和設置在支撐架上的可拆卸式微孔條(6)構成，所述微孔條(6)上設有微孔(7)。用0.02M醋酸緩沖液(pH2.0)溶液稀釋、抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765包被96孔酶標反應板⑷上的微孔(7)，每孔ΙΟΟμ I。4°C孵育過夜，按照常規(guī)ELISA方法封閉洗滌。酶標反應板裝于鋁箔自封袋內(nèi)。
[0023](2)單核細胞增生性李斯特菌陽性對照標準品(滅活的單核細胞增生性李斯特菌菌液)一管和陰性對照標準品(李氏增菌肉湯)一管。
[0024](3)辣根過氧化物酶標記的抗單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體6D4H7C8B6, CGMCC N0.8002 溶液一管。
[0025](4)酶標抗體稀釋液一管:0.0lM PBS，ρΗ7.6。
[0026](5) 1X濃縮洗滌液一管:含有0.5%吐溫-20和0.2%疊氮鈉的0.1M磷酸鹽緩沖液，ρΗ7.4，使用時將濃縮洗液10倍稀釋即可。
[0027](6)顯色液A液一管,顯色液B液一管。使用前將A液與B液等體積混合。
[0028](7)終止液一管:2Μ硫酸溶液。
[0029](8)設有數(shù)個容器孔(3)的襯墊(2)。
[0030]二、酶聯(lián)免疫試劑盒中各組分的制備
[0031](一 )將單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體1B4E7A6C9，CGMCC N0.8765作為捕捉抗體包被酶標反應板
[0032]用包被緩沖液將單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體1B4E7A6C9稀釋成5 μ g/ml，每孔加入100 μ I，4°C過夜，次日傾去包被液，用稀釋好的洗液洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入220 μ I封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁箔袋密封保存。
[0033]包被緩沖液:0.02M醋酸緩沖液，用5M HCl調(diào)節(jié)pH至2.0。
[0034]封閉液:含有0.3%牛血清白蛋白和10%蔗糖的0.0lM PBS0
[0035]( 二 )辣根過氧化物酶標記的單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6，CGMCCN0.8002 的制備
[0036]將單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體6D4H7C8B6與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯(lián)，采用的方法是改良的過碘酸鈉法，方法如下:
[0037]a、5mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解于0.5ml0.2M醋酸緩沖液(pH5.6)中。
[0038]b、加入現(xiàn)配制的 0.06M Na104 溶液 0.5ml，4°C氧化 20min。
[0039]C、加入含22% NaCl的0.4M乙二醇溶液0.5ml，室溫靜置30min。
[0040]d、用6ml預冷的無水乙醇沉淀酶，1500rpm離心lOmin。
[0041]e、去上清，將沉淀溶于2.5ml的0.0lM PBS (pH7.4)中。
[0042]f、加入1mg單克隆抗體GS2-D3，并立即用0.5M碳酸緩沖液(ρΗ9.6)調(diào)節(jié)pH至9.0。4°C靜置過夜。
[0043]g、加入 10mg/ml 硼氫化鈉 50 μ 1，4°C，靜置 2h。
[0044]h、用 0.0lM PBS (ρΗ7.4) 4°C透析過夜。
[0045]1、純化保存。
[0046]三、試劑盒的應用
[0047](一 )檢測方法
[0048]1、樣品前處理
[0049]取待檢樣品25g(ml)加入225ml李氏增菌肉湯于均質(zhì)機下均質(zhì)混勻，36°C ±1°C培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)好的樣品在100°C水浴中加熱lOmin。取出冷卻至室溫待用。
[0050]2、用試劑盒檢測
[0051]取出所需數(shù)量的微孔和所有試劑常溫下放置30min。取200 μ I待檢樣品加到微孔中，37°C，孵育30min。倒去孔內(nèi)液體，加入200 μ I洗液到每個微孔內(nèi)，輕輕晃動數(shù)秒，快速翻轉將微孔內(nèi)液體倒盡，向一疊干凈的吸水紙拍幾下，如此重復操作共洗板3次。加入100 μ I酶標單克隆抗體6D4H7C8B6工作液，37°C，孵育60min。倒去孔內(nèi)液體并洗板4次。將顯色A液和顯色B液等量混合配成底物顯色液。每個微孔加入100 μ I的底物顯色液，室溫避光顯色15-20min。加入終止液100 μ I，用酶標儀于450nm下測定吸光度值。
[0052]結果判定:陰性對照< 0.1、陽性對照彡0.3，實驗結果有效，否則結果判定為無效；檢測孔OD值彡0.2時，判定為陽性；檢測孔OD值介于0.1-0.2之間時，判定為弱陽性；檢測孔OD值< 0.1判定為陰性。
[0053]若無酶標儀，可用肉眼判定:陽性對照孔有肉眼可見的黃色，陰性對照孔無顏色，實驗結果有效，否則判定為實驗結果無效；當檢測孔有明顯肉眼可見的黃色時為陽性結果；有微弱黃色時，判定為弱陽性結果；無肉眼可見黃色時為陰性結果。
[0054]( 二)酶聯(lián)免疫試劑盒效果的檢測
[0055]1、試劑盒重復性和穩(wěn)定性測試
[0056]板內(nèi)精密度測試:取同一塊酶標反應板上的6個微孔，用被單核細胞增生性李斯特菌污染過的牛奶進行測試，實驗重復4次。
[0057]板間精密度測試:取同一批次的4塊酶標反應板，用被單核細胞增生性李斯特菌污染過的牛奶進行測試，實驗重復3次。
[0058]變異系數(shù)的計算方法:變異系數(shù)(CV)=測定結果的標準差與其平均值的百分比。
[0059]表1.板內(nèi)重復性測試結果
[0060]
IlI ?L2 ?L3 ?L4 fl5 ?L6 板內(nèi) CV%^~? 0.573 0.567 058] 0.577 0581 0.5592.712
20.569 0.571 0.577 0.568 0,572 0.5712.214
30.564 0.563 0,571 0.581 0.582 0.5692.567
40.536 0.538 0.541 0.527 0.612 0.6022.349
[0061]表2.板間重復性測試結果
板I 板2板3板4板間CV (%)
? 0.52904710.4420.482234
[0062]
20.4610.4400.5330.4312.89
30.5670.4620.4220.5462.35
[0063]2、試劑盒交叉反應測試
[0064]用試劑盒去檢測其他的食源性致病菌，驗證試劑盒檢測單核細胞增生性李斯特菌的特異性，觀察是否與其他的致病菌有交叉反應和假陽性出現(xiàn)。
[0065]表3.試劑盒特異性測試菌種名稱菌株編弓-吸光度值交叉反應
01出血性大腸桿菌 O丨57:H7ATCC 438950.0490.0510.0f1—
02出血性大腸桿|?-? OI57:H7ATCC43889().()570.0611).()72—
03陰溝腸桿菌CMCC (B) 45301().()7丨0.0710.074—
04糞腸球菌ATCC 292120.0770.0790.077—
05大腸埃希氏菌ATCC 87390.0750.0850.074—
06大腸埃希氏菌ATCC 259220.0770.0790.077—
07大腸埃希氏菌CMCC(B) 441020.0770.0750.0S5—
08大腸埃希氏菌80990.0770,0790.077—
09單增李斯特菌ATCC 432510.8710.8750.885+
單增李斯特菌ATCC 19115(λ77?^(?7?^0.874+
單增李斯特菌CMCC (B) 541)1)20.7770.7790.777+
單增李斯特菌ATCC 139320.7770.7790.777+
13單增李斯特菌ATCC 1?)!120.7770.7890.787+
14單增李斯特菌ATCC 191140.6950.7890.7Η7+
15單增李斯特菌ATCC 191160.6940.6950.695+
[0066] 16 單增李斯特菌AICC 191170.7870.7850.695+
17單增李斯特菌ATCC 19 丨丨50.6970.6970.699+
18單增李斯特菌ATCC 191110.6970.69*)0.697+
IV 伊氏李斯特氏菌ATCC 19 丨 190.0810.0850.085+
20格氏李斯特氏菌ATCC 2541)10.1)870.0890.087+
21威氏李斯特氏菌Α._’(Χ 358970.081?.0850.0S5+
22無害單增李斯特菌CICC 102970.0850.0850.087+
23腸炎沙門氏菌ATCC 130760.0810.0810.084—
24豬霍亂沙門氏菌CICC 214930.0870.0870.087—
~25 鼠傷寒沙門氏菌CMCC (B) 50115~0,0870,0890.087=
26鼠傷寒沙門氏菌CTCC 229560.0860.0850.087—
27鼠傷寒沙門氏菌ATCC 140280.0810.0850.085—
屮型副傷寒沙門氏菌CMCC (B) 50093~0.081 ~0.0810.084-
29 乙型副傷寒沙門氏菌CMCC (B) 500940.0870.0890.087—
傷寒沙門氏菌CMCC (B) 50071~0.0870.0890.087二
31 圣保羅沙門氏菌IQCC 105290.0860.0850.087—
^2 海徳堡沙門氏菌TQCC105310,0710,0750.075=
33肯塔基沙門氏菌IQCC 105300,0710,0710.074—
34布洛克利沙門氏菌IQCC105320.0770.0790.077—
35阿伯丁沙門氏菌IQCC1051 丨0.0770.0790.077—
^6 乙型副傷寒沙f j 氏菌IQCC 105040.0760.0750.077=
37都柏林沙門氏菌IQCC 105230.0710.0750.075—
38鵜沙門氏菌IQCC105090.0710.0710.074—
39病牛沙門氏菌IQCC 105100.0770.0790.077—
40甲型副傷寒沙門氏菌IQCC 105180.0770.0790.077—
雞沙門氏菌'IQCC 105250.0760.0750.077=
42 火雞沙門氏菌IQCC 105260.0710.0750.075—
丙型副傷寒沙門氏菌IQCC 105270.0710.0710.074=
^4 腸炎沙門氏菌IQCC 105280.0770.0790.077二
^5 甲型副傷寒沙門氏菌IQCC 105800.0870.0890.087二
"^6 甲型副傷寒沙f j 氏菌TQCC 305370.0860.0850.087二
^7 甲型副傷寒沙門氏菌IQCC 305380.0810.0810.084=
48乙型副傷寒沙門氏菌CMCC 500040.0870.0890.087—
49丙型副傷寒沙門氏菌CMCC 501180.0870.0890.087—
[0067] 50 福氏志賀ATCC 120220.0860.0850.087—
宋內(nèi)氏志賀ATCC 259310.0860.0850.087=
52 單核細胞增生性李期特菌ATCC 87000.0860.0850.087—
單核細胞增生性李斯特菌ATCC 92070.0820.0880.089二
~^4~單核細胞增生性李斯特菌CMCC 513460.0870.0890.087=
~^5 痢疾志賀氏菌CMCC (B) 51105~0.0860.0850.087二
~~56 糊疾志賀氏歯野生分離株0.0820.0880.089=
57 福氏志賀氏菌CMCC (B) 515720.0870.0890.087—
^8 福氏志賀氏菌ATCC 120220.0810.0860.081=
59宋內(nèi)氏志賀氏菌CMCC (B) 515920.0810.0860.081—
60宋內(nèi)氏志賀氏菌ATCC 259310.0820.085?.080—
^61 副溶血弧歯ATCC 178020.0810.0850.088=
62單核細胞增生性李斯特菌ATCC 290040,0810.0800.088—
63單核細胞增生性李斯特菌ATCC 295540.0870.0890.086一
^~64~舉核細胞增生性李斯特菌ATCC 128580.0S70.0890.086
65小腸耶爾森氏菌AICX’237150.0890.0820.087—
66小腸耶爾森氏歯CMCC 522070.0870.0890.086—
67小腸耶爾森氏菌CMCC (B) 522040.0890.0820.087—
68乙型溶血性鏈球菌 ATCC 210590.0840.0870.081—
69乙型溶血性鏈球菌 ATCC 210600.0870.0890.086—
70蠟樣芽孢桿菌 ATCC 117780.0870.0850.086—
71蠟樣芽孢桿菌CMCC (B) 633010.0870.0890.086—
72蠟樣芽孢桿菌CMCC (B) 633030.0870.0850.086—
[0〇68] 73金黃色葡萄球菌 ATCC 65380.0870.0850.086—
74金黃色葡萄球菌 ATCC 259230,0890.0850.086—
75金黃色葡萄球菌 ATCC 232130.0870.0890.086—
76金黃色葡萄球菌 ATCC 276600.0850.0850.086一
77表皮葡萄球菌CMCC (B) 260690.0830.0850.086—
78空腸彎曲菌 CICC 229370.0890.0860.087—
[0069]注“ + ”表示檢測結果呈陽性；“一”表示檢測結果為陰性。
[0070]3、試劑盒保存期實驗
[0071]試劑盒保存條件為2—8°C，經(jīng)過12個月后，試劑盒的檢測結果與新批次的試劑盒結果一致?？紤]到運輸和使用過程中會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存的條件下放置8天，進行加速老化試驗，結果表明試劑盒的各項指標完全符合要求。因此試劑盒可以在2 — 8°C至少可以保存12個月以上。
[0072]在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種單核細胞增生性李斯特菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于，所述盒體內(nèi)設有自封袋和襯墊，所述自封袋內(nèi)設有包被了作為捕捉抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的酶標反應板，所述襯墊上設有數(shù)個容器孔，所述容器孔內(nèi)分別設有陽性對照溶液、陰性對照溶液、1X濃縮洗滌液、顯色液、終止液、酶標抗體溶液和酶標抗體稀釋液，所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的作為檢測抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌的單克隆抗體。
2.如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標反應板由支撐架和設于支撐架上的可拆卸式微孔條構成，所述微孔條上設有微孔，所述微孔中包被有作為捕捉抗體的抗單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體。
【文檔編號】G01N33/577GK203941171SQ201420271796
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】劉箐, 郭慧琴, 吳淑燕 申請人:上海理工大學