一種應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活性物質(zhì)急性毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活性物質(zhì)急性毒性的方法。本發(fā)明在多年研究的基礎(chǔ)上，通過對馴養(yǎng)條件、試驗條件、試驗設(shè)施和質(zhì)量控制要求等的不斷摸索和完善，建立了應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦開展殺生物活性物質(zhì)急性毒性測試的半靜態(tài)標(biāo)準(zhǔn)試驗方法，規(guī)范了相關(guān)試驗條件，完成了本發(fā)明。本發(fā)明克服傳統(tǒng)成蝦急性毒性測試方法中受試生物個體大，數(shù)量少，個體差異大，重現(xiàn)性差等不足，為殺生物活性物質(zhì)海水生物急性毒性測試提供技術(shù)保障。
【專利說明】一種應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活性物質(zhì)急性毒性的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生態(tài)毒理測試領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活 性物質(zhì)急性毒性的方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 防污漆為控制海洋生物污損做出了巨大貢獻(xiàn)，但其含有的殺生物活性物質(zhì)的大量 使用對周圍海洋環(huán)境和水體產(chǎn)生了較大不利影響，殺生物活性物質(zhì)對海洋生態(tài)環(huán)境和人類 健康造成的潛在風(fēng)險日益受到廣泛關(guān)注。為了有效控制防污漆活性物質(zhì)給海洋環(huán)境帶來 的不利影響，為研發(fā)和篩選環(huán)境友好型活性物質(zhì)提供技術(shù)支持，亟需加強對海洋生物生態(tài) 毒理測試方法的研究和開發(fā)。相對淡水生態(tài)系統(tǒng)而言，海水生態(tài)系統(tǒng)中的生物種類更為豐 富，很多門類的生物只存在于海水生態(tài)系統(tǒng)中，這意味著海水生物的生物敏感性分布范圍 更廣。但目前我國水生生物毒性測試方法采用的受試生物大多是淡水魚、潘和藻類，針對海 水生物的標(biāo)準(zhǔn)毒性測試方法較少。
[0003] 凡納濱對奸（Litopenaeus vannamei)是世界上三大經(jīng)濟(jì)奸類之一，對奸養(yǎng)殖已成 為我國海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。
[0004] 目前，國內(nèi)尚沒有殺生物活性物質(zhì)對凡納濱對蝦急性毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法以及相關(guān)的 研究報道。不過針對某些化合物對凡納濱對蝦的毒性影響已有一些研究，但大部分研究均 使用成蝦作為毒性試驗的受試生物，并未應(yīng)用敏感性更強的仔蝦。只有少數(shù)研究應(yīng)用凡納 濱對蝦仔蝦進(jìn)行試驗，如么宗利等探討了碳酸鹽堿度和pH值對凡納濱對蝦仔蝦存活率的 影響，郭永軍研究了高錳酸鉀、甲醛和聚維酮碘等3種藥物對凡納濱對蝦仔蝦的急性毒性， 但上2篇研究報道中凡納濱對蝦仔蝦的馴養(yǎng)條件、試驗條件、試驗設(shè)施、方法設(shè)計和質(zhì)量 控制要求等關(guān)鍵性技術(shù)內(nèi)容或缺失或不完整，無法作為標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法用于開展殺生物活 性物質(zhì)的毒性測試，獲得的毒性數(shù)據(jù)的質(zhì)量也無法保證。
[0005] 國外關(guān)于對蝦仔蝦毒性試驗的方法基本采用流水式試驗方式，例如美國環(huán)保局 (USEPA)發(fā)布的針對殺蟲劑等有害化學(xué)品的對蝦急性毒性試驗方法。但由于流水式試驗體 系需要的樣品量、溶液量和產(chǎn)生的廢液量均較大，所需的流水式試驗裝置也較為復(fù)雜，對試 驗過程的控制性和精密性要求也較高，試驗費用十分昂貴，因此流水式試驗體系尚不具備 作為急性毒性試驗開展的普遍性。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、較為標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試 殺生物活性物質(zhì)急性毒性的方法，從而克服傳統(tǒng)成蝦急性毒性測試方法中受試生物個體 大，數(shù)量少，個體差異大，重現(xiàn)性差等不足，為殺生物活性物質(zhì)海水生物急性毒性測試提供 技術(shù)保障。
[0007] 本發(fā)明利用仔蝦對污染物刺激的敏感性，以海水生物凡納濱對蝦仔蝦為模式生 物，在一定的試驗條件下，將仔蝦暴露于含有殺生物活性物質(zhì)的一系列濃度的試驗用水中， 以靜態(tài)或半靜態(tài)方式進(jìn)行試驗，并采用了合適的受試生物要求、試驗條件、受試物溶液配 制、濃度設(shè)計、試驗周期、毒性終點、測定指標(biāo)和質(zhì)控要求，確定活性物質(zhì)對凡納濱對蝦仔蝦 毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的，為海洋環(huán)境風(fēng)險評估提供高質(zhì)量的數(shù) 據(jù)。
[0008] 本發(fā)明的應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活性物質(zhì)急性毒性的方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0009] 受試生物：健康的、活力好的、出生小于10天的凡納濱對蝦仔蝦經(jīng)馴養(yǎng)后作為受 試生物用于受試；
[0010] 試驗用水：采用取自清潔無污染海區(qū)水質(zhì)穩(wěn)定的海水或人工配制海水作為試驗用 水；
[0011] 將受試物用試驗用水稀釋成不同的梯度濃度，然后再加入受試的凡納濱對蝦仔 蝦，試驗期間不更換試驗溶液或者試驗期間定時更換新的試驗溶液，試驗環(huán)境條件為：光照 周期為12h光照/12h黑暗，15?30min的過渡轉(zhuǎn)換期；溫度范圍為23?30°C，溫度變換范 圍不超過2°C，鹽度為20?35%。；鹽度變化范圍不超過2%。；pH為7. 6?8. 6,變化范圍不 宜超過0. 4 ;溶解氧含量不低于空氣飽和濃度的60%，試驗期間仔蝦正常喂食；
[0012] 試驗開始后，定時測量受試仔蝦的死亡率，計算累積死亡率，以評估受試物的急性 毒性。
[0013] 優(yōu)選：所述的仔蝦來源于同一批大小一致的自繁飼養(yǎng)或購買的仔蝦，當(dāng)為自繁飼 養(yǎng)的仔蝦時，需馴養(yǎng)24h后才可用于試驗，當(dāng)為購買的仔蝦時，需馴養(yǎng)48h后才可用于受試， 馴養(yǎng)階段仔蝦的死亡率應(yīng)小于10%才可用于受試；所述的將受試物用試驗用水稀釋成不 同的梯度濃度是以96h使仔蝦全部死亡的最低濃度和對蝦全部存活的最高濃度之間進(jìn)行 設(shè)置至少5個梯度濃度，濃度間隔系數(shù)< 2 ;所述的試驗期間定時更換新的試驗溶液，是每 隔24h或48h更換一次新的試驗溶液，試驗周期為96h ;所述的試驗期間仔蝦正常喂食是每 天飼喂對奸片或齒蟲無節(jié)幼體；觀察和記錄各試驗組在試驗開始后3h、24h、48h、72h和96h 試驗對蝦的任何可見的異常行為和死亡的數(shù)量，并及時取出死蝦，并計算試驗開始后24h、 48h、72h和96h試驗對蝦仔蝦的累積死亡率；采用概率法或修正的斯皮爾曼-卡伯分析方 法評估受試物對凡納濱對蝦仔蝦的24h、48h、72h和96h LC5(I值以及其95%的置信限，評估 受試物的急性毒性。
[0014] 所述的取自清潔無污染海區(qū)水質(zhì)穩(wěn)定的海水或人工配制海水，其鹽度：20%。? 35%〇，pH :7· 6 ?8. 6。
[0015] 由于處于仔蝦生命階段的對蝦對海洋污染物的敏感性較強，因此采用凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)仔奸作為毒性檢測的受試生物具有重要的應(yīng)用價值和研究意義， 是開展海洋生態(tài)毒理學(xué)研究的理想試驗物種。本發(fā)明在多年研究的基礎(chǔ)上，通過對馴養(yǎng)條 件、試驗條件、試驗設(shè)施和質(zhì)量控制要求等的不斷摸索和完善，建立了應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦 開展殺生物活性物質(zhì)急性毒性測試的半靜態(tài)標(biāo)準(zhǔn)試驗方法，規(guī)范了相關(guān)試驗條件，完成了 本發(fā)明。
[0016] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1)目前我國水生生 物毒性測試標(biāo)準(zhǔn)方法大多是針對淡水魚、潘、藻類，針對海水生物的標(biāo)準(zhǔn)毒性測試方法較 少，因此本發(fā)明選用一種在我國廣泛養(yǎng)殖且具有重要價值的廣鹽性生物凡納濱對蝦展開海 水生物急性毒性測試，將其作為模式生物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)學(xué)意義，可以為評價 殺生物活性物質(zhì)對海洋生態(tài)環(huán)境的影響提供有力支持；（2)通過比較，選用了處于早期生 命階段對毒性物質(zhì)的更敏感的仔蝦作為受試生物開展測試，彌補了傳統(tǒng)方法中采用成蝦進(jìn) 行急性毒性測試的諸多不足（例如個體差異大、重現(xiàn)性差、靈敏度低，成本高、技術(shù)要求高 等）；（3)國外現(xiàn)有的對蝦仔蝦標(biāo)準(zhǔn)毒性試驗多采用流水式方式進(jìn)行，本方法采用靜態(tài)或半 靜態(tài)方法進(jìn)行，克服了流水式試驗方法的不足（樣品量、溶液量和產(chǎn)生的廢液量較大，流水 式試驗裝置較復(fù)雜，試驗費用十分昂貴），操作更簡單，應(yīng)用更具普遍性；(4)彌補了對殺生 物活性物質(zhì)海洋生物毒性研究較少的不足。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0017] 圖1是實施例1的濃度-累積死亡率曲線圖。

【具體實施方式】：
[0018] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0019] 實施例1 :
[0020] 受試生物：將來源于同一批大小一致的、健康的、出生為5天的自繁飼養(yǎng)的凡納濱 對蝦仔蝦，經(jīng)過24h馴養(yǎng)后，馴養(yǎng)階段仔蝦的死亡率應(yīng)小于10%，再選擇健康的、活力好的， 體色透明的仔蝦作為受試生物；
[0021] 試驗用水：采用取自清潔無污染海區(qū)水質(zhì)穩(wěn)定的海水作為試驗用水，pH 7. 9,鹽度 為 20%〇。
[0022] 準(zhǔn)確稱取0. 500g辣椒素作為受試物置于5L三角瓶中，加入適量試驗用水，攪拌 30min，加試驗用水至5L，得到理論濃度為100mg/L受試物混濁液，將該受試物混濁液再經(jīng) 0. 45 μ m濾膜過濾，棄除沉淀，得到的上清液即為理論濃度為100mg/L的受試物飽和溶液 (100% LS，LS 為 Limit Solution 的簡寫）。
[0023] 預(yù)試驗時設(shè)置濃度分別為 5. 00% LS、10. 0% LS、20. 0% LS、40. 0% LS、80. 0% LS 和100% LS的受試物試驗組，同時設(shè)置空白對照組。每組10尾仔對蝦，不設(shè)平行，培養(yǎng)條件 同下面實驗組的培養(yǎng)條件，由此得到96h使對蝦全部死亡的最低濃度（80% LS)和對蝦全部 存活的最高濃度（〇% LS)。
[0024] 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置5個試驗濃度，分別為8.00 % LS、14. 4 % LS、25. 9 % LS、 46. 7% LS和84. 0% LS的受試物試驗溶液（濃度間隔系數(shù)為1. 8)。每個濃度試驗組分裝 3份800mL的受試物試驗溶液至3個1L燒杯中用于試驗。同時，分別量取3份800mL的試 驗用水至3個1L燒杯中作為空白對照組。
[0025] 用手抄網(wǎng)隨機選擇馴養(yǎng)好的受試仔奸，體重和體長的范圍分別為 7. 300mg± 1. 703mg和9. 746mm± 1. 207mm。按照從低濃度到高濃度組的順序在裝有受試物 試驗溶液或空白對照組的每個試驗容器小心放入10只受試仔蝦。
[0026] 試驗期間控制水溫為25°C ±2°C;試驗過程不對試驗溶液進(jìn)行曝氣，其溶解氧含量 始終不低于空氣飽和值的60% ;光源為日光燈，光照周期為12h光照/12h黑暗（15-30min 的過渡轉(zhuǎn)換期），并控制鹽度變化范圍不超過2%。，pH變化范圍不宜超過0. 4,試驗期間每天 定時給仔奸少量飼喂少量。
[0027] 觀察和記錄各試驗組在試驗開始后3h、24h、48h、72h和96h試驗對蝦的任何可見 的異常行為和死亡的數(shù)量，并及時取出死蝦。試驗對蝦異常行為：游動趨于緩慢，身體失去 平衡，翻轉(zhuǎn)打旋，抽搐痙攣，腹肢劇烈擺動，身體出現(xiàn)白色斑塊甚至全身發(fā)白不能游動等。對 蝦死亡的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：喪失游泳能力、俯臥或側(cè)臥于容器底部、腹肢不擺動、用細(xì)棒輕觸對 蟲下體無任何反應(yīng)。
[0028] 每48h準(zhǔn)備新的試驗溶液（受試物的濃度為試驗溶液的初始濃度），按照從低濃度 組到高濃度組的順序小心移入存活的仔蝦。
[0029] 測定各試驗組在試驗開始后Oh、24h、7?、96h和48h更換試驗溶液前后的水溫、pH 和溶解氧含量。
[0030] 測定5個受試物試驗組（濃度分別為8. 00% LS、14. 4% LS、25. 9% LS、46. 7% LS 和84. 0% LS的受試物試驗溶液）在試驗開始后0h、24h、72h、96h和48h更換試驗溶液前后 的受試物實際濃度。
[0031] 計算各組在試驗開始后24h、48h、72h和96h試驗對蝦的累積死亡率；采用概率法 或修正的斯皮爾曼-卡伯分析方法評估受試物對凡納濱對蝦仔蝦的24h、48h、72h和96h LC 5Q值以及其95%的置信限（L95);繪制濃度-效應(yīng)曲線。
[0032] 試驗結(jié)果1，5個受試物試驗組（實際濃度分別為0. 823mg/L、1. 29mg/L、3. 08mg/L、 5. 70mg/L和14. 5mg/L，見表2)的對蝦累積死亡率分別為43. 3%、56· 7%、56· 7%、60· 0% 和66. 7% (見表1和圖1)。因此，受試物對凡納濱對奸（Litopenaeus vannamei)仔奸的 9611-1^(：5(|為9.091^/1，其95%的置信限為2.431^/1?34.05 1^/1(基于實測濃度）。
[0033] 上述試驗結(jié)果表明新型殺生物活性物質(zhì)辣椒素對凡納濱對蝦仔蝦的急性毒性具 有較好的濃度效應(yīng)關(guān)系，仔蝦死亡率隨著試驗濃度的升高而上升，得到了確定的96h_LC 5(l 值，如根據(jù)GB 30000. 28-2013《化學(xué)品分類和標(biāo)簽規(guī)范第28部分：對水生環(huán)境的危害》中 的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，辣椒素對海水環(huán)境的危害性屬于急性水生危害類別2,表明了本發(fā)明 中設(shè)定的試驗條件和方式是科學(xué)合理的。
[0034] 表1 :試驗對蝦的累積死亡率
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種應(yīng)用凡納濱對蝦仔蝦測試殺生物活性物質(zhì)急性毒性的方法，其特征在于，包括 以下步驟： 受試生物：健康的、活力好的、出生小于10天的凡納濱對蝦仔蝦經(jīng)馴養(yǎng)后作為受試生 物用于受試； 試驗用水：采用取自清潔無污染海區(qū)水質(zhì)穩(wěn)定的海水或人工配制海水作為試驗用水； 將受試物用試驗用水稀釋成不同的梯度濃度，然后再加入受試的凡納濱對蝦仔蝦，試 驗期間不更換試驗溶液或者試驗期間定時更換新的試驗溶液，試驗環(huán)境條件為：光照周期 為12h光照/12h黑暗，15?30min的過渡轉(zhuǎn)換期；溫度范圍為23?30°C，溫度變換范圍 不超過2°C，鹽度為8?28%。;鹽度變化范圍不超過2%。;pH為7. 6?8. 6,變化范圍不超過 〇. 4 ;溶解氧含量不低于空氣飽和濃度的60%，試驗期間仔蝦正常喂食； 試驗開始后，定時測量受試仔蝦的死亡率，計算累積死亡率，以評估受試物的急性毒 性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的仔蝦來源于同一批大小一致的自 繁飼養(yǎng)或購買的仔蝦，當(dāng)為自繁飼養(yǎng)的仔蝦時，需馴養(yǎng)24h后才可用于受試，當(dāng)為購買的仔 蝦時，需馴養(yǎng)48h才可用于受試，馴養(yǎng)階段仔蝦的死亡率應(yīng)小于10%才可用于受試；所述的 將受試物用試驗用水稀釋成不同的梯度濃度是以96h使仔蝦全部死亡的最低濃度和對蝦 全部存活的最高濃度之間進(jìn)行設(shè)置至少5個梯度濃度，濃度間隔系數(shù)< 2 ;所述的試驗期間 定時更換新的試驗溶液，是每隔24h或48h更換一次新的試驗溶液，試驗周期為96h ;所述 的試驗期間仔蝦正常喂食是每天飼喂對蝦片或鹵蟲無節(jié)幼體；觀察和記錄各試驗組在試驗 開始后3h、24h、48h、72h和96h試驗對蝦的任何可見的異常行為和死亡的數(shù)量，并及時取出 死蝦，并計算試驗開始后24h、48h、72h和96h試驗對蝦仔蝦的累積死亡率；采用概率法或修 正的斯皮爾曼-卡伯分析方法評估受試物對凡納濱對蝦仔蝦的24h、48h、72h和96h LC5Q值 以及其95%的置信限，評估受試物的急性毒性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用取自清潔無污染海區(qū)水質(zhì)穩(wěn)定的海 水或人工配制海水，其鹽度：20%。?35%。，pH :7. 6?8. 6。
【文檔編號】G01N33/00GK104280519SQ201410395961
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】梅承芳, 梁燕珍, 鄧桂榮, 柳燕貞, 梁笑婷, 林健輝, 曾國驅(qū), 許玫英, 孫國萍 申請人:廣東省微生物研究所