一種檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒包括喹烯酮特異性抗體、喹烯酮代謝物與載體蛋白的偶聯(lián)物、和酶標(biāo)二抗。本發(fā)明的檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測(cè)飼料及畜產(chǎn)品中殘留的喹烯酮。
【專利說明】一種檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。具體涉及一種用于檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]喹烯酮(Quinocetone)分子式C18H14N203，屬喹噁啉類藥物，是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制的畜禽抗菌、止瀉、促生長(zhǎng)新藥，是我國(guó)在國(guó)際上首創(chuàng)的一類新獸藥。該類藥物對(duì)多種腸道致病菌(特別是革蘭氏陰性菌)有抑制作用，可明顯降低畜禽腹瀉發(fā)生率，促進(jìn)生長(zhǎng)并提高飼料轉(zhuǎn)化率。目前包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地區(qū)都廣泛用作動(dòng)物飼料添加劑。喹烯酮在畜牧業(yè)上廣泛使用的同時(shí)，由于畜牧業(yè)生產(chǎn)者不熟悉藥物的理化性質(zhì)和藥理毒理特點(diǎn)，存在一定的濫用情況，導(dǎo)致畜產(chǎn)品中喹烯酮及其主要代謝產(chǎn)物脫二氧喹烯酮?dú)埩舫瑯?biāo)，對(duì)人們的身體健康造成嚴(yán)重的潛在危脅。同時(shí)由于動(dòng)物性產(chǎn)品具有不易儲(chǔ)存、易變質(zhì)等特點(diǎn)，為了保障消費(fèi)者的身體健康，迫切需要建立一種快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉、靈敏、特異的喹烯酮及其主要代謝產(chǎn)物脫二氧喹烯酮的篩選方法。
[0003]現(xiàn)有的喹烯酮檢測(cè)方法多為色譜法，但是這些方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響較大；再者這些方法需要復(fù)雜的儀器，且過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的篩查?；诳乖贵w免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)為小分子殘留物的分析檢測(cè)提供了一個(gè)新的途徑。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原分子的設(shè)計(jì)、合成和人工全抗原及抗體的制備。因?yàn)猷┩切》肿踊衔?，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到具有免疫原性的人工抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，喹惡啉類藥物中殘留標(biāo)示物為3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)，喹烯酮擁有與喹乙醇相同的結(jié)構(gòu)母核和相似的體內(nèi)代謝途徑，并且MQCA也是在飼喂過喹烯酮的動(dòng)物組織中可以檢出的、殘留時(shí)間最長(zhǎng)的代謝物。因此，本發(fā)明使用MQCA作為免疫半抗原來制備免疫原，進(jìn)而用于檢測(cè)反應(yīng)組織內(nèi)喹烯酮的含量。
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0006]本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括:喹烯酮特異性抗體、3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。其中喹烯酮特異性抗體為兔抗喹烯酮的多克隆抗體，可用喹烯酮代謝物3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動(dòng)物(例如兔)制得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的MQCA-載體蛋白偶聯(lián)物采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到。所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述酶標(biāo)二抗可以用商品化的辣根過氧化物酶酶標(biāo)二抗，也可以通過過碘酸鈉法或戊二醛法將辣根過氧化物酶與二抗偶聯(lián)制得。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶標(biāo)二抗為羊抗兔IgG抗體。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。
[0007]為方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括MQCA-載體蛋白偶聯(lián)物抗原或羊抗兔抗抗體(二抗包被)的酶標(biāo)板、喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
[0008]所述的洗滌液為0.05% -0.5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1 %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
[0009]另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中喹烯酮含量的方法，包括步驟:
(1)樣品前處理；
(2)向包被有喹烯酮抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗喹烯酮多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；
(3)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0010]本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為:
將喹烯酮抗原吸附于固相載體上，加入樣本或喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入喹烯酮抗體工作液，待測(cè)樣品中喹烯酮和固相載體上包被的喹烯酮抗原競(jìng)爭(zhēng)喹烯酮抗體，再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性的放大作用，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中喹烯酮的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出喹烯酮濃度范圍。
[0011]有益效果:
本發(fā)明檢測(cè)喹烯酮的試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定法定性或定量樣品中喹烯酮含量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。
[0012]本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的喹烯酮多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在飼料及動(dòng)物源性產(chǎn)品檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1-2，為喹烯酮酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)圖。
[0015]圖中1，試劑盒盒體；2，包被了喹乙醇抗原或抗喹烯酮特異性抗體的酶標(biāo)板；3，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；4，為顯色劑A ; , 5,為顯色劑B ；6,為抗體溶液-J，為酶標(biāo)二抗溶液；8，為酶標(biāo)二抗稀釋液；9，為濃縮洗滌液；10，為濃縮樣品稀釋液；11，為試劑瓶架。
[0016]【具體實(shí)施方式】
[0017]提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。[0018]實(shí)施例1免疫原的合成及免疫血清的制備 喹烯酮的代謝產(chǎn)物免疫原的制備
本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，喹惡啉類藥物中殘留標(biāo)示物為3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)，喹烯酮擁有與喹乙醇相同的結(jié)構(gòu)母核和相似的體內(nèi)代謝途徑，并且MQCA也是在飼喂過喹烯酮的動(dòng)物組織中可以檢出的、殘留時(shí)間最長(zhǎng)的代謝物。因此，本發(fā)明使用MQCA作為免疫半抗原來制備免疫原，進(jìn)而用于檢測(cè)反應(yīng)組織內(nèi)喹烯酮的含量。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法合成MQCA-BSA作為免疫原，相關(guān)的合成方法有重氮偶聯(lián)法、碳二亞胺法等。
[0019]免疫及特異性抗體的制備。
[0020]將喹烯酮-BSA偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選取6只體重2~
2.5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對(duì)抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/Kg體重的量進(jìn)行首次免疫，采取背部皮下多點(diǎn)注射。每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)，當(dāng)抗體效價(jià)不再升高時(shí)，不加佐劑進(jìn)行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動(dòng)脈放血，室溫凝固2h后4°C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50 %飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析后用S印hadexG-25M層析，即得多克隆抗體。
[0021]實(shí)施例2免疫檢測(cè)方法的建立
2.1 ELISA方法確定 最佳包被濃度
將 1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml、I μ g/ml、0.25 μ g/ml 系列濃度的卵清蛋白(OVA)-MQCA偶聯(lián)物按每孔100 μ I包被酶標(biāo)板，4°C包被24h，洗滌5次，拍干，按每孔200μ I封閉液4°C下封閉12h，洗滌3次，拍干。加入1: 500稀釋的抗血清100 μ 1，室溫作用2h，洗滌三次，立即加入100 μ I酶標(biāo)羊抗兔抗體，室溫作用30min，洗滌三次，加100 μ I底物液，室溫避光作用15π?η，50μ I終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)A值(450nm)。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔(不加抗血清，只加其稀釋液)和平行重復(fù)孔，取OD值為1.0左右時(shí)的包被濃度為最佳濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)喹烯酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括:喹烯酮特異性抗體、3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括包被了3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)-載體蛋白偶聯(lián)物或羊抗兔抗體、喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述喹烯酮特異性抗體為以3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)-載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原制備的多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的載體蛋白為牛血清白 蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)二抗的酶為辣根過氧化物酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的酶標(biāo)二抗為羊抗兔IgG 抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的洗滌液為含有0.05% -0.5% 吐溫-20磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的顯色劑由顯色劑A和顯色 劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1% 吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
10.一種檢測(cè)樣品中喹烯酮含量的方法，包括步驟: (1)樣品前處理； (2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向包被有3-甲基-喹惡啉-2-羧酸(MQCA)-載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗喹烯酮多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終上，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值； (3)分析檢測(cè)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK104034888SQ201410282655
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國(guó)勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍(lán)文苑 申請(qǐng)人:廣西博士海意信息科技有限公司