用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的制作方法

文檔序號：6214235閱讀：442來源：國知局

用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供：用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM、AIM的部分肽、或含有編碼所述AIM或所述部分肽的核苷酸序列的核酸；用于篩選用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其使用通過用高脂肪膳食飼喂AIM表達不足的非人哺乳動物而產(chǎn)生的動物；等等。
【專利說明】用于肝臟疾病的預防劑或治療劑

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于肝臟疾病等的預防劑或治療劑。

【背景技術】
[0002] 代謝綜合征是近年來隨著生活環(huán)境的變化快速出現(xiàn)的現(xiàn)代疾病，并且像多米諾骨牌的倒下一樣發(fā)展出各種難于控制的疾病組，諸如2型糖尿病、動脈硬化性疾病等。在該系列疾病中，從早期階段起連同肥胖變得顯著的是脂肪肝。最近已經(jīng)闡明，百分之幾十的患有脂肪肝的患者進展至被稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的疾病。在NASH中，大范圍的肝實質(zhì)以不依賴于酒精的方式變得纖維化，并且肝硬化和肝癌經(jīng)常進一步發(fā)生。盡管胰島素敏化劑、抗氧化劑、護肝劑（liver supporting agent)、抗高脂血癥劑、降壓藥等用于治療 NASH，但不存在確立的治療方法，并且已經(jīng)期望開發(fā)有效的治療藥物。
[0003] NASH的準確發(fā)病機理仍不清楚。盡管已經(jīng)提出炎癥和胰島素耐抵抗與脂肪肝組合從而發(fā)生NASH的兩次打擊理論，但是沒有任何結論性的實驗證據(jù)。作為NASH的動物模型，可以提到用MCD(甲硫氨酸-膽堿缺乏膳食）或四氯化碳飼喂（load)的小鼠；然而，由于肝衰竭導致的肝壞死后的纖維化是具有降低的體重的主要部分，并且無法準確反映患有代謝綜合征的人患者中的肝纖維化，其是由于營養(yǎng)過剩而由肥胖和脂肪肝引起的。一旦可以生成能夠再現(xiàn)人病理學的NASH的動物模型，則可以篩選或評估用于NASH的治療藥物。
[0004] 盡管代謝綜合征基于獲取與肥胖相關的胰島素耐抵抗，但在最近幾年已經(jīng)闡明，脂肪組織的慢性炎癥是重要的。由于肥胖導致的脂肪組織的持續(xù)炎癥在整個機體中擴散以誘導全身性胰島素耐抵抗。
[0005] 本發(fā)明人在最近幾年已經(jīng)闡明，病理學的關鍵是如下所述（非專利文獻1-4)的 AM(巨噬細胞的凋亡抑制劑）。AM由巨噬細胞特異性產(chǎn)生且存在于血液中。由于肥胖， AIM的血液濃度增加，AIM經(jīng)由⑶36通過胞吞作用被引入脂肪細胞，誘導累積的中性脂肪的降解（脂解作用），并從脂肪細胞釋放游離脂肪酸（非專利文獻5)。釋放的脂肪酸經(jīng)由 toll樣受體的刺激誘導并維持脂肪組織中的慢性炎癥（非專利文獻6)。事實上，在AIM敲除（KO)小鼠中，肥胖不會導致整個機體（包括脂肪組織和肝臟）中的慢性炎癥，并且不產(chǎn) 生胰島素耐抵抗，這進而顯著抑制糖尿病和動脈硬化的發(fā)生（非專利文獻4、6)。然而，AIM 參與肝臟疾?。ㄌ貏e是NASH)的發(fā)病和進展迄今仍然未知。
[0006] [文獻列表]
[非專利文獻] 非專利文獻 I: J Exp Med 189: 413-422，1999 非專利文獻 2: J Biol Chem 276: 22910-22914，2001 非專利文獻 3: Am J Pathol 162: 837-847，2003 非專利文獻 4: Cell Metab 1: 201-213，2005 非專利文獻 5: Cell Metab 11: 479-492，2010 非專利文獻 6: PNAS 108: 12072-12077，2011。
[0007] 發(fā)明概述本發(fā)明待解決的問題本發(fā)明的目的是提供用于肝臟疾病的預防藥物或治療藥物。此外，本發(fā)明的目的是提供用于評估或篩選用于肝臟疾病等的預防藥物或治療藥物的新方法。此外，本發(fā)明的另一個目標提供肝臟疾病的診斷方法。
[0008] 解決問題的方法本發(fā)明人研宄了通過飼喂高脂肪膳食而產(chǎn)生肥胖的AIM敲除小鼠的病理學，并且獲得了非常有趣的發(fā)現(xiàn)，即在其中包括肝臟的全身慢性炎癥和胰島素抵抗兩者受到抑制的狀態(tài) 中發(fā)生與（1)肥胖、（2)先前脂肪肝、（3)肝實質(zhì)的纖維化、和（4)高度頻繁癌發(fā)生的人NASH 的病理學類似的病理學。由此認為，補充AIM變?yōu)橐幌盗懈闻K疾病諸如脂肪肝、NASH和肝癌的預防或治療方案。
[0009] 本發(fā)明人已經(jīng)基于這些發(fā)現(xiàn)進行進一步研宄，并且完成了本發(fā)明。
[0010] 因此，本發(fā)明提供
[1] 用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的堿基序列的核酸；
[2] 用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含誘導AIM的表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物；
[3] [1]或[2]的藥劑，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[4] 篩選用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼喂 AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物；
[5] [4]的方法，其包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質(zhì)的步驟， (2) 觀察用測試物質(zhì)施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎癥應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質(zhì)比較來選擇改善上述特性的測試物質(zhì)的步驟；
[6] [4]或[5]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[7] 評估用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼喂AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物；
[8] [7]的方法，其包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎癥應答， (3)通過將上述特性與未施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評估用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟；
[9] [7]或[8]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[10] 診斷肝臟疾病的方法，其包括以下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AM濃度的步驟， (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AM濃度與健康人的樣品的AM濃度比較的步驟， (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低于所述健康人的樣品的AIM濃度時，判斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發(fā)生肝臟疾病的高可能性的步驟；
[11] [10]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[12] 用于預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的堿基序列的核酸；
[13] 用于預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物；
[14] [12]或[13]的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[15] AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的堿基序列的核酸，其用于預防或治療肝臟疾病；
[16] [15]的AIM或其部分肽、或含有編碼所述AIM或其部分肽的堿基序列的核酸，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌；
[17] 誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物，其用于預防或治療肝臟疾?。缓?br> [18] [17]的藥物，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
[0011] 發(fā)明效果本發(fā)明可以提供用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM等作為活性成分。此外，根據(jù)使用本發(fā)明的肝臟疾病模型小鼠的篩選方法，可以搜索對于肝臟疾病的預防或治療有效的物質(zhì)。此外，使用本發(fā)明的肝臟疾病模型小鼠，可以評估已知的用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果。此外，本發(fā)明可以提供通過測量試驗主體的樣品中的AIM濃度用于診斷肝臟疾病的方法。
[0012] 附圖簡述圖1顯示表示以下的圖：A :用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝重量、肝重量與體重的比率和肝中中性脂肪的重量。平均值土SEM，P〈0. 001。B :用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的蘇木精-伊紅（HE)染色的圖像。
[0013] 圖2 A:用高脂肪膳食飼喂之后第20周AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的天狼星紅染色的圖像。B:顯示用高脂肪膳食飼喂0、6、12、20、45、55周的AM KO小鼠和WT 小鼠的肝組織切片中纖維化比率的圖。C:顯示用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝臟中TGFI3 1和a SM的相對mRNA表達水平的圖。
[0014] 圖3顯示A :從用高脂肪膳食飼喂52周的AM KO小鼠（表示為AM-/-)和WT小鼠（表示為AIM+/+)分離的肝臟的拍攝圖像。B:用高脂肪膳食飼喂52周的AIM KO小鼠的肝組織切片的蘇木精-伊紅染色的圖像。C:顯示用高脂肪膳食飼喂0、6、12、20、45、52 周的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片中良好分化的肝細胞癌（HCC)的開始頻率的圖。
[0015] 圖4顯示用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝組織切片的抗AFP抗體染色的圖像，和顯示用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝臟中AFP的相對表達水平的圖。
[0016] 圖5提供顯示用高脂肪膳食飼喂的AM KO小鼠和WT小鼠的肝臟中F4/80 (巨噬細胞）、TNFα、IL-6、IL-lβ的相對表達水平的圖。平均值±SEM，*;P〈0·05，** ;P〈0·01， ***; P〈0. OOl0
[0017] 圖6顯示A :AM KO小鼠、WT小鼠和RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白質(zhì)印跡圖像，和體外結合至單克隆或多克隆IgM的AIM的蛋白質(zhì)印跡圖像，和B :用IgM靜脈內(nèi) 注射的RAG KO小鼠的血清中存在的AM的蛋白質(zhì)印跡圖像。
[0018] 圖7顯示在小鼠和人的血清中AM和IgM水平之間的相關性的圖。
[0019] 圖8顯示抗AM抗體染色的圖像和與AIM孵育的小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的蛋白質(zhì)印跡圖像。
[0020] 圖9顯示在與油酸預培養(yǎng)之后與或不與AIM孵育的小鼠原代培養(yǎng)肝細胞的油紅0 染色的圖像，和顯示細胞中FSP27的相對表達水平的圖。
[0021] 圖10是3T3-L1前脂肪細胞中AIM或各SRCR結構域蛋白的脂肪細胞分化抑制效果的圖。
[0022] 圖11是顯示NASH患者和非NASH患者中血清的AM濃度的圖。
[0023] 圖12提供A :用高脂肪膳食與rAM或PBS喂食的AM KO小鼠中體重的變化的圖，和B :肝的目視圖像，肝組織切片（癌癥部位，非癌癥部位）的蘇木精-伊紅染色的圖像，顯示癌癥發(fā)病率的圖，和顯示用高脂肪膳食與rAIM或PBS喂食的AM KO小鼠中肝中性脂肪的量的圖。
[0024] 實施方案的描述本發(fā)明中的AIM是包含與SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白。
[0025] AM可以是，例如，從巨噬細胞分離和純化的蛋白，所述巨噬細胞是溫血動物（例如，人、小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴、黑猩猩、雞等）的免疫細胞。它也可以是化學合成的或在無細胞翻譯系統(tǒng)中生物化學合成的蛋白?；蛘?，該蛋白可以是從摻入核酸的轉化體產(chǎn)生的重組蛋白，所述核酸包含編碼上述氨基酸序列的堿基序列。
[0026] 與SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列實質(zhì)上相同的氨基酸序列是指與SEQ ID NO: 2中顯示的氨基酸序列等具有約60 %或更高，優(yōu)選約70 %或更高，進一步優(yōu)選約80 %或更高，特別優(yōu)選約90%或更高，最優(yōu)選約95%或更高的同源性的氨基酸序列。在這里，"同源性"是指在使用本【技術領域】中已知的數(shù)學算法比對兩條氨基酸序列時在最佳比對中相同的氨基酸殘基和類似的氨基酸殘基與所有重疊的氨基酸殘基的比率（％)(優(yōu)選地，該算法考慮在序列的一側或兩側引入缺口，用于最佳比對）。"類似氨基酸"意指具有類似物理化學特性的氨基酸；其實例包括在相同組下分類的氨基酸，諸如芳香族氨基酸（Phe、Trp、Tyr)，脂肪族氨基酸仏]^、1^11、116、'\^11)，極性氨基酸（6111、4811)，堿性氨基酸（1^8、4找、把8)，酸性氨基酸（Glu、Asp)，具有羥基的氨基酸（Ser、Thr)，和具有小側鏈的氨基酸（Gly、Ala、 Ser、Thr、Met)。預期通過此類相似氨基酸的取代不會改變蛋白的表型（即，保守氨基酸取代）。保守氨基酸取代的具體實例是【技術領域】中已知的，并且描述于各種文獻（參見，例如， Bowie 等人，Science, 247:1306-1310 (1990))〇
[0027] 本說明書中的氨基酸序列同源性可以在以下條件（期望值=10 ;允許缺口；矩陣=BL0SUM62;過濾=OFF)下使用同源性計算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。作為用于石角定氨基酸序列同源性的其它算法的實例，可以提到Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)中描述的算法[該算法被并入NBLAST和XBLAST程序（版本 2.0) (Altschul 等人，Nucleic Acids Res·，25:3389-3402 (1997))]，Needleman 等人， J. Mol. Biol.，48:444-453 (1970)中描述的算法[該算法被并入GCG軟件包中的GAP 程序]，Myers和Miller, CABI0S，4:11-17 (1988)中描述的算法[該算法被并入ALIGN 程序（版本2. 0)，這是CGC序列比對軟件包的部分]，Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 (1988)中描述的算法[該算法被并入GCG軟件包中的FASTA程序]等，它們同樣可以優(yōu)選使用。
[0028] 更優(yōu)選地，與SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列實質(zhì)上相同的氨基酸序列是與SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列具有約60%或更高，優(yōu)選約70%或更高，進一步優(yōu)選約80% 或更高，特別優(yōu)選約90%或更高，且最優(yōu)選約95%或更高的同一性的氨基酸序列。
[0029] 作為包含與SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列實質(zhì)上相同的氨基酸序列的蛋白，例如，包含與上述SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列實質(zhì)上相同的氨基酸序列且具有與包含SEQ ID N0:2等中顯示的氨基酸序列的蛋白的活性實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性的蛋白是優(yōu)選的。在這里，"活性"是指，例如，抑制動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的凋亡的活性，維持或促進動脈硬化的活性，脂肪細胞分化抑制活性，熔化脂肪細胞的脂滴的活性，脂肪細胞降低活性，CD36結合活性，胞吞至脂肪細胞的活性，F(xiàn)AS結合活性，F(xiàn)AS功能抑制活性，抗肥胖活性等。"實質(zhì)上相同的質(zhì)量"意指其活性是定性地（例如，生理學上或藥理學上）相同的。因此，優(yōu)選的是，上述活性是相互等效的，但這些活性的定量系數(shù)，諸如活性的程度（例如，約 0. 1至約10倍，優(yōu)選約0. 5至約2倍）和蛋白的分子量，可以是不同的。
[0030] 上述活性可以通過本身已知的方法進行測量。
[0031] 本發(fā)明中AM的實例還包括包含以下的蛋白：（1)從SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列缺失1或2個或更多個（優(yōu)選約1至100,優(yōu)選約1至50,進一步優(yōu)選約1至10,特別優(yōu)選1至幾個（2、3、4或5))氨基酸的氨基酸序列，（2)向SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列添加1或2個或更多個（優(yōu)選約1至100,優(yōu)選約1至50,進一步優(yōu)選約1至10,特別優(yōu)選1至幾個（2、3、4或5))氨基酸的氨基酸序列，（3)在SEQ ID NO: 2中顯示的氨基酸序列中插入1或2個或更多個（優(yōu)選約1至50,優(yōu)選約1至10,進一步優(yōu)選1至幾個（2、3、4 或5))氨基酸的氨基酸序列，（4)在SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列中被其它氨基酸取代1或2個或更多個（優(yōu)選約1至50,優(yōu)選約1至10,進一步優(yōu)選1至幾個（2、3、4或5)) 氨基酸的氨基酸序列，或（5)包含其組合的氨基酸序列。
[0032] 當已經(jīng)如上所述插入、缺失或取代氨基酸序列時，插入、缺失或取代的位置沒有特別限制，只要維持該蛋白的活性。
[0033] 本發(fā)明的AIM優(yōu)選為具有SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列的人AM蛋白 (GenBank登錄號：AAD01446)，或其在其它哺乳動物中的同源物[例如，在GenBank中作為登錄號：AAD01445注冊的小鼠同源物等]。
[0034] 在本說明書中，根據(jù)肽命名的慣例描述蛋白和肽，其中左端表示N末端（氨基末端），右端表不C末端（幾基末端）。在包括包含SEQ ID NO: 2中顯不的氣基酸序列的蛋白的本發(fā)明的AIM中，C末端可以是羧基（-C00H)、羧酸鹽（_C00_)、酰胺（-CONH 2)和酯（-C00R) 中的任一種。
[0035] 在這里，作為酯中的R，可以使用Cp6烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基和正丁基，c 3_8環(huán)烷基，例如，環(huán)戊基和環(huán)己基，C 6_12芳基，例如苯基和α-萘基，苯基-Cp2烷基，例如芐基和苯乙基，C 7_14芳烷基，例如，α-萘基-Cp2烷基，例如，α-萘基甲基、新戊酰氧基甲基;等。
[0036] 當本發(fā)明的AIM在除了 C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）時，其中羧基被酰胺化或酯化的蛋白也包括在本發(fā)明的蛋白中。在此情況下，作為酯，使用例如上述在C末端的醋等。
[0037] 此外，本發(fā)明的AM還包括：其中N末端氨基酸殘基的氨基被保護基團（例如，CV6 ?；?，諸如CV6烷?；╝lkanoyl)諸如甲?；鸵阴；龋┍Ｗo的蛋白；其中可以在體內(nèi) 在N末端裂解后產(chǎn)生的谷氨酰胺殘基已經(jīng)被轉化為焦谷氨酸的蛋白，其中分子中氨基酸的側鏈上的取代基（例如，-〇H、_SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等）被適當?shù)谋Ｗo基團（例如，CV 6?；T如C η烷?；T如甲?；鸵阴；龋┍Ｗo的蛋白，綴合的肽，諸如所謂具有與之鍵合的糖鏈的糖肽等。
[0038] AIM的部分肽（下文有時簡稱為"本發(fā)明的部分肽"）可以是任意的，只要它是具有上述AM的部分氨基酸序列且具有與AIM實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性的肽。在這里，"實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性"如上文所定義。此外，可以以與AIM的情況下相同的方式測量"實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性"。
[0039] 由于AM包含3個包含大量半胱氨酸的SRCR (富含半胱氨酸的清道夫受體）結構域，所以各SRCR結構域都可以被用作本發(fā)明的部分肽。具體而言，例如，在SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列中，可以使用分別包含SRCRl結構域（SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列的氨基酸編號24 - 125)、SRCR2結構域（SEQ ID N0:2中顯示的氨基酸序列的氨基酸編號 138 - 239)和SRCR3結構域（SEQ ID NO: 2中顯示的氨基酸序列的氨基酸編號244 - 346) 的部分氨基酸序列，包含SRCR結構域的任何組合的部分氨基酸序列等。本發(fā)明的部分肽的大小沒有特別限制，只要它包含上述功能結構域。部分肽優(yōu)選包含不小于50的部分氨基酸序列，更優(yōu)選不小于100的部分氨基酸序列，進一步優(yōu)選不小于200的部分氨基酸序列。部分氨基酸序列可以是單一連續(xù)的部分氨基酸序列，或者彼此連接的不連續(xù)的多個部分氨基酸序列。
[0040] 此外，本發(fā)明的部分肽的C末端可以是羧基（-COOH)、羧酸鹽（_COO_)、酰胺 (-CONH 2)和酯（-COOR)中的任一種。在這里，酯中的R的實例包括類似于AM的上述實例的那些。當本發(fā)明的部分肽在除了C末端以外的位置具有羧基（或羧酸酯）時，羧基被酰胺化或酯化，其也包括在本發(fā)明的部分肽中。作為這種情況下的酯，例如，使用與在C末端的酯類似的那些等。
[0041] 此外，在本發(fā)明的部分肽中，以與上述AIM相同的方式，N末端氨基酸殘基的氨基可以用保護基團保護，N末端的谷氨酰胺殘基可以被轉化為焦谷氨酸，分子中氨基酸的側鏈上的取代基可以用合適的保護基團保護，或者部分肽可以是其中糖鏈被鍵合的合成肽（所謂的糖狀等），等。
[0042] 本發(fā)明中待使用的AM或其部分肽可以是鹽的形式。例如，使用與生理學上可接受的酸（例如，無機酸、有機酸）、堿（例如，堿金屬鹽）的鹽等，并且生理學上可接受的酸加成鹽是優(yōu)選的。有用的鹽包括，例如，與無機酸（例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸）的鹽或與有機酸（例如，乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸）的鹽等。
[0043] 可以通過本身已知的蛋白純化方法從上述哺乳動物的巨噬細胞產(chǎn)生AM。具體而言，AIM或其鹽可以通過均質(zhì)化哺乳動物巨噬細胞，通過低速離心去除細胞碎片，以高速離心上清液以沉淀包含細胞膜的級分，并且使上清液進行層析諸如反相層析、離子交換層析、親和層析等等來制備。
[0044] AIM或其部分肽也可以根據(jù)公眾已知的肽合成方法來制備（以下在其化學合成的說明中，全長AIM和其部分肽被綜合簡稱為AIM，除非另有規(guī)定）。
[0045] 肽合成的方法可以是，例如，固相合成方法和液相合成方法中的任一種。期望的蛋白可以通過將能夠構成AIM的部分肽或氨基酸與剩余部分縮合，并且去除所得產(chǎn)物可具有的任何保護基團來產(chǎn)生。
[0046] 在這里，縮合和保護基團去除根據(jù)本身已知的方法，例如，下面（1)和（2)中所示的方法來進行： (1) M. Bodanszky 和 M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (2) Schroeder 和 Luebke: Academic Press, New York (1965)〇
[0047] 因此獲得的AM可以通過已知的純化方法進行純化或分離。在這里，作為純化方法的實例，可以提到溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析、重結晶、其組合等。
[0048] 當因此獲得的AIM是游離形式時，可以將所述游離形式通過已知方法或其類似方法轉化為合適的鹽形式，并且在另一方面，當獲得鹽形式的AM時，它可以通過已知方法或其類似方法轉化為游離形式或者不同的鹽的形式。
[0049] 此外，AM也可以通過培養(yǎng)包含編碼其的核酸的轉化體，以及從獲得的培養(yǎng)物中分離和純化AM而產(chǎn)生。編碼AM或其部分肽的核酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合體，優(yōu)選DNA。此外，核酸可以是雙鏈或單鏈的。在雙鏈核酸的情況下，它可以是雙鏈DNA、雙鏈 RNA、或DNA = RNA雜合體。在單鏈的情況下，它可以是有義鏈（即編碼鏈）或反義鏈（即非編碼鏈）。
[0050] 編碼AM或其部分肽的DNA的實例包括基因組DNA，源自溫血動物（例如人、牛、猴、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓、豚鼠、大鼠、小鼠、兔、倉鼠、雞等）的巨噬細胞的cDNA，合成的DNA等。編碼AM或其部分肽的基因組DNA可以通過聚合酶鏈式反應（在下文中簡稱為"PCR方法"）直接擴增，其通過使用從以下制備的基因組DNA級分作為模板：人或其它溫血動物（例如，猴、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、雞等）的上述動物的任何細胞[例如，肝細胞、脾細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、胰臟β細胞、骨髓細胞、腎小球系膜細胞、朗格漢斯細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯狀細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例如，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞）、巨核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質(zhì)細胞、或其對應的祖細胞、干細胞或癌細胞等]，或其中存在此類細胞的任何組織[例如，腦或腦的任何部分（例如，嗅球、杏仁核、基底神經(jīng)節(jié)、海馬、丘腦、下丘腦、底丘腦核、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦）、脊髓、腦垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肺、胃腸道（例如大腸、小腸）、血管、心臟、胸腺、脾臟、下頒下腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、關節(jié)、月旨肪組織（例如，棕色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨骼肌等]，且編碼AM或其部分肽的cDNA 也可以通過PCR方法和逆轉錄酶-PCR(在下文簡稱為"RT-PCR方法"）通過分別使用從巨噬細胞制備的總RNA或mRNA級分作為模板直接擴增。或者，編碼AM或其部分肽的基因組 DNA和cDNA也可以通過菌落或噬菌斑雜交方法或PCR方法等從通過將上述基因組DNA和總 RNA或mRNA的片段插入合適的載體中而制備的基因組DNA文庫和cDNA文庫中克隆。用于文庫的載體可以是任何噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等。
[0051] 編碼AM的DNA的實例包括包含與SEQ ID NO: 1的堿基編號64至1107顯示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的喊基序列的DNA等。
[0052] 作為包含與SEQ ID NO: 1的堿基編號64至1107顯示的堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的DNA，使用包含與SEQ ID N0:1的堿基編號64至1107顯示的堿基序列具有不小于約60%、優(yōu)選不小于約70%、更優(yōu)選不小于約80%、特別優(yōu)選不小于約90 %的同源性的堿基序列，且編碼具有與上述AM等的實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性的蛋白的DNA。
[0053] 本說明書中的堿基序列同源性可以在以下條件（期望值=10 ;允許缺口；過濾= ON;匹配得分=1;錯配得分=-3)下使用同源性計算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。作為用于確定堿基序列同源性的其它算法的優(yōu)選實例，還可以提到上述氨基酸序列同源性計算算法。
[0054] 編碼AM的DNA優(yōu)選是包含SEQ ID NO: 1的堿基編號64至1107顯示的堿基序列顯示的編碼人AM蛋白的堿基序列的DNA (GenBank登錄號：AF011429)，或其在其它哺乳動物中的同源物[例如，在GenBank中作為登錄號：AF011428注冊的小鼠同源物等]。
[0055] 編碼本發(fā)明的部分肽的DNA可以是任意的，只要它包含編碼包含與SEQ ID NO:2 中顯示的氨基酸序列的部分相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列的肽的堿基序列。具體而言，作為編碼本發(fā)明的部分肽的DNA，使用（1)包含由SEQ ID NO: 1的堿基編號64至1107顯示的堿基序列顯示的部分堿基序列的DNA，或（2)包含與包含SEQ ID NO: 1的堿基編號64 至1107顯示的部分堿基序列的DNA具有不小于約60%、優(yōu)選不小于約70%、更優(yōu)選不小于約80%、特別優(yōu)選不小于約90%的同源性的堿基序列，且編碼具有與上述AM等的實質(zhì)上相同質(zhì)量的活性的蛋白的DNA。
[0056] 編碼AM或其部分肽的DNA可以通過PCR方法通過擴增具有編碼AM或其部分肽的堿基序列的部分的合成DNA，或?qū)⒉⑷牒线m的表達載體的DNA與編碼AM的部分或完整區(qū) 域的標記的DNA片段或合成DNA雜交來克隆。雜交可以根據(jù)本身已知的方法或基于其上的方法，例如，描述于Molecular Cloning,第2版（J. Sambrook等人，Cold Spring Harbor Lab. Press，1989)的方法等來進行。當使用商購文庫時，雜交可以根據(jù)所附說明書手冊中描述的方法來進行。雜交可以優(yōu)選在高嚴格條件下進行。
[0057] 作為高嚴格條件的實例，可以提到在45°C在6 XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉）中雜交反應、隨后在65°C在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗滌一次或多次的條件等。本領域技術人員能夠通過適當?shù)馗淖冸s交溶液的鹽濃度、雜交反應溫度、探針濃度、探針長度、錯配數(shù)、雜交反應時間、洗滌溶液的鹽濃度、洗滌溫度等而容易地獲得期望的嚴格性。當使用商購文庫時，雜交可以根據(jù)隨附所述文庫的說明書手冊中描述的方法來進行。
[0058] 包含編碼AM或其部分肽的DNA的表達載體可以通過以下產(chǎn)生，例如，從編碼AM 的DNA切出期望的DNA片段，并且將所述DNA片段接合在適當?shù)谋磉_載體中啟動子下游。
[0059] 作為表達載體，使用源自大腸桿菌的質(zhì)粒（例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13); 動物細胞表達質(zhì)粒（例如，pAl_ll、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);動物病毒載體，諸如逆轉錄病毒、牛痘病毒、腺病毒等等。
[0060] 該啟動子可以是任何啟動子，只要它適用于用于表達所述基因的宿主。
[0061] 例如，當宿主是動物細胞時，使用SRa啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒）啟動子、RSV (勞斯肉瘤病毒）啟動子、MoMuLV (莫洛尼鼠白血病病毒）LTR、 HSV-TK(單純皰瘆病毒胸苷激酶）啟動子等。在這些中，CMV啟動子、SRa啟動子等是優(yōu)選的。
[0062] 當宿主是屬埃希氏菌屬的細菌時，trp啟動子、Iac啟動子、recA 啟動子、λ 動子、Ipp啟動子、T7啟動子等是優(yōu)選的。
[0063] 除了上述以外，有用的表達載體包括，任選攜帶增強子、剪接信號、多聚腺苷酸附加信號、選擇標記、SV40復制原點（以下也簡稱為SV40ori)等的那些。作為選擇標記的實例，可以提到二氫葉酸還原酶（以下也簡稱為dhfr)基因[甲氨蝶呤（MTX)抗性]、氨芐青霉素抗性基因（以下也簡稱為▲￥/)、新霉素抗性基因（以下也簡稱為AfeA G418抗性）等。具體而言，當使用缺乏dhfr基因的中國倉鼠細胞以及作為選擇標記的dhfr基因時，也可使用不含胸苷的培養(yǎng)基來選擇目標基因。
[0064] 必要時，可以將編碼適合用于宿主的信號序列的堿基序列（信號密碼子）添加 (或用天然信號密碼子取代）至編碼AIM或其部分肽的DNA的5'-末端側。例如，當宿主是屬埃希氏菌屬，使用PhoA信號序列、OmpA信號序列等；當宿主是動物細胞時，使用胰島素信號序列、α-干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
[0065] AM或其部分肽可以通過用包含上述編碼AM或其部分肽的DNA的表達載體轉化宿主并培養(yǎng)獲得的轉化體來產(chǎn)生。
[0066] 作為宿主，例如，使用屬埃希氏菌屬、動物細胞等。
[0067] 作為屬埃希氏菌屬，例如，使用大腸桿菌K12_DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 60，160(1968)]，大腸桿菌 JM103 [Nucleic Acids Research, vol. 9， 309 (1981)]，大腸桿菌 JA221 [Journal of Molecular Biology, vol. 120，517(1978)]，大腸桿菌 HBlOl [Journal of Molecular Biology, vol. 41，459 (1969)]，大腸桿菌 C600 [Genetics, vol. 39，440 (1954)]等。
[0068] 作為動物細胞，例如，使用猴COS-7細胞、猴Vero細胞、中國倉鼠卵巢細胞（以下簡稱為CHO細胞）、dhfr基因缺陷的CHO細胞（以下簡稱為CH0(dhfr_)細胞）、小鼠 L細胞、小鼠 AtT-20細胞、小鼠骨髓瘤細胞、大鼠 GH3細胞、人FL細胞等。
[0069] 轉化可基于公眾已知的方法根據(jù)宿主種類進行。
[0070] 屬埃希氏菌屬可以，例如，根據(jù)描述于Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 69， 2110 (1972)，Gene, vol. 17，107 (1982)中的方法等進行轉化。
[0071] 動物細胞可以，例如，根據(jù)描述于 Saibo Kogaku (Cell Engineering)，extra issue 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995) ,Shujunsha 出版，或 Virology, Vol. 52, 456 (1973)的方法進行轉化。
[0072] 轉化體的培養(yǎng)可基于公眾已知的方法根據(jù)宿主種類進行。
[0073] 作為用于培養(yǎng)轉化體（其宿主是屬埃希氏菌屬的細菌）的培養(yǎng)基的實例，補充有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培養(yǎng)基[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]是優(yōu)選的。根據(jù) 需要，為了增強啟動子效率，可以將化學劑諸如3 β -吲哚丙烯酸添加至培養(yǎng)基中。
[0074] 轉化體（其宿主是屬埃希氏菌屬的細菌）的培養(yǎng)通常在約15°C至約43°C進行約 3至約24小時。如果必要，培養(yǎng)物可以進行通氣或攪拌。
[0075] 用于培養(yǎng)轉化體（其宿主是動物細胞）的有用的培養(yǎng)基包括，例如，包含約5 -約 20%胎牛血清的最低基礎培養(yǎng)基（MEM) [Science, vol. 122，501 (1952)]，Dulbecco 改良的 Eagle 培養(yǎng)基（DMEM) [Virology, vol. 8，396 (1959)]，RPMI1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American Medical Association, vol. 199，519 (1967)]，199 培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, vol. 73，1(1950)]等。培養(yǎng)基的 pH 優(yōu) 選為約6至約8。培養(yǎng)通常在約30°C至約40°C進行約15至約60小時。如果必要，培養(yǎng)物可以進行通氣或攪拌。
[0076] 如上所述，AM可以在轉化體的細胞中或細胞外產(chǎn)生。
[0077] AIM或其部分肽可以根據(jù)本身已知的方法從通過培養(yǎng)上述轉化體獲得的培養(yǎng)物中分離和純化。
[0078] 例如，當從培養(yǎng)的細菌或細胞的細胞質(zhì)中提取AIM或其部分肽時，適當?shù)厥褂靡?下方法，其中通過已知方式收集細菌或細胞，將其懸浮在適當?shù)木彌_溶液中，并借助于超聲處理、溶菌酶和/或凍融等破碎，其后，通過離心或過濾獲得可溶性蛋白的粗提取物。緩沖溶液可包含蛋白變性劑諸如尿素或鹽酸胍，和表面活性劑，諸如Triton X-100?。此外，當 AIM或其部分肽被分泌在真菌（細胞）外時，使用通過離心、過濾等從培養(yǎng)物等中分離培養(yǎng) 上清液的方法。
[0079] 因此獲得的可溶性級分和培養(yǎng)上清液中含有的AIM或其部分肽的分離和純化可以根據(jù)本身已知的方法來進行。有用的方法包括基于溶解度的方法，諸如鹽析和溶劑沉淀；主要基于分子量差異的方法，諸如透析、超濾、凝膠過濾和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；基于電荷差異的方法，諸如離子交換層析；基于特異性親和力的方法，諸如親和層析；基于疏水性差異的方法，諸如反相高效液相層析；和基于等電點差異的方法，諸如等電聚焦。這些方法可以適當?shù)亟M合。
[0080] 因此獲得的AM或其部分肽的存在可以通過酶免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡法等使用針對AM的抗體來證實。
[0081] 如上所述獲得的AIM或其部分肽或其鹽或包含編碼AM或其部分肽（有時在這里表示為AIMs)的堿基序列的核酸可以作為用于預防肝臟疾病的發(fā)病或肝臟疾病的治療的藥劑提供。
[0082] 在本發(fā)明中，誘導AM表達的藥物和穩(wěn)定AM的藥物也可用于替代AMs。
[0083] 誘導AM表達的藥物的實例包括具有AM轉錄活性等的化合物，并且該化合物的實例包括能夠結合AM基因的啟動子區(qū)域等的轉錄因子。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，AIM在巨噬細胞中表達。因此，作為誘導AIM表達的藥物，可以提到巨噬細胞分化誘導劑。巨噬細胞分化誘導劑沒有特別限制，只要其可以從祖細胞諸如粒細胞-巨噬細胞集落形成細胞（CFU-GM)、巨噬細胞集落形成細胞（CFU-M)等誘導巨噬細胞的分化，并且可以使用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)等。轉錄因子、GM-CSF、M-CSF可以是通過上述已知方式從哺乳動物組織和細胞中分離和純化的蛋白，或者可以是化學合成的或在無細胞翻譯系統(tǒng)中生物化學合成的蛋白?；蛘?，它們可以是從用包含編碼上述蛋白的堿基序列的核酸導入的轉化體產(chǎn)生的重組蛋白。
[0084] 穩(wěn)定AIM的藥物的實例包括抑制AIM的降解的化合物，抑制排泄到尿中的化合物等。抑制降解的化合物的實例包括蛋白酶抑制劑，蛋白酶體抑制劑等。蛋白酶抑制劑的實例包括絲氨酸蛋白酶抑制劑（4-(2-氨基乙基）苯磺酰氟鹽酸化物（AEBSGF)、抑肽酶、胰蛋白酶抑制劑等），半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E-64,亮肽素等）等。蛋白酶體抑制劑的實例包括乳胞素、MG-115、MG-132、蛋白酶體抑制劑I等。抑制排泄到尿中的化合物的實例包括賦予AM防止通過腎小球基底膜的分子量的化合物。如下述實施例中所示，由于可以證實 IgM與AM的結合，所以IgM可作為抑制AM排泄到尿中的化合物提及。然而，由于擔心施用IgM本身引起免疫系統(tǒng)中的副作用，優(yōu)選使用通過融合IgM的Fc片段（這是與AIM的結合位點）和具有防止腎小管的過濾和排泄到尿中的水平的分子量的蛋白而獲得的融合蛋白。盡管待融合的蛋白沒有特別限制，但具有較少副作用擔心的蛋白是優(yōu)選的，并且，例如，可以使用白蛋白。結合可以是直接結合或經(jīng)由鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)的實例包括串聯(lián)FLAG標簽。此類分子可以通過常規(guī)方法通過連接編碼每個的基因且作為單一重組蛋白來產(chǎn)生。
[0085] 在本發(fā)明的下述實施例中，與野生型（WT)小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳食飼喂條件下顯示肝臟疾病的促進發(fā)病。具體地，肝臟疾病類似于非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)的病理學，且進展為肝硬化和肝細胞癌，這是該疾病的特征，被證實為可重復的。從上述內(nèi)容中，表明AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物、或者可以通過下述篩選方法進行搜索的能夠取代AIM的功能的化合物防止肝臟疾病的發(fā)病和進展并治療肝臟疾病。
[0086] 作為本發(fā)明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物的藥物組合物的應用目標的肝臟疾病是，例如，脂肪肝、NASH、肝硬化和肝癌。在另一個方面，作為本發(fā)明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物的藥物組合物的應用目標的肝臟疾病是，例如，與肝星狀細胞的活化相關的肝臟疾病。肝星狀細胞活化的指標是，例如，a SMA(a -平滑肌肌動蛋白）mRNA的表達。因此，肝臟疾病可能是其中與正常肝組織相比a SM mRNA 顯著高表達的肝臟疾病。在又另一個方面，肝臟疾病可能是其中與正常肝組織相比TGF0 1 或膠原4A1顯著高表達的肝臟疾病。
[0087] 本發(fā)明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物的藥物組合物是低毒性的，并且可以作為液體原樣，或作為藥物組合物的合適劑型，口服或胃腸外（例如，血管內(nèi)施用，皮下施用等）施用于人或其它溫血哺乳動物（例如，小鼠、大鼠、兔、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等）。
[0088] 作為用于胃腸外施用的組合物的實例，使用注射劑、栓劑等；所述注射劑可包括劑型，諸如靜脈內(nèi)注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌內(nèi)注射劑和滴注注射劑。此類注射劑可以根據(jù)公眾已知的方法來制備。注射劑可以通過以下制備，例如，將上述本發(fā)明的AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物溶解、懸浮或乳化在通常用于注射劑的無菌水溶液或油性溶液中。作為用于注射的水溶液的實例，可以使用生理鹽水、包含葡萄糖或另一種輔助藥物的等滲溶液等，其可以與適當?shù)脑鋈軇┙M合使用，所述增溶劑，例如，醇（例如乙醇），多元醇（例如，丙二醇，聚乙二醇），非離子表面活性劑[例如，聚山梨酯80，HC0-50 (氫化蓖麻油的聚氧乙烯（50 mol)加合物）]等。作為油性溶液的實例，可以使用芝麻油、大豆油等，其可以與作為增溶劑的苯甲酸芐酯、芐醇等組合使用。將制備的注射溶液優(yōu)選填充在適當安瓿中。用于直腸施用的栓劑可以通過將上述本發(fā)明的AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩(wěn) 定AIM的藥物與普通栓劑基質(zhì)混合來制備。
[0089] 作為用于口服施用的組合物，可以提到固體或液體劑型，特別是片劑（包括糖包衣片劑和薄膜包衣片劑）、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊（包括軟膠囊）、糖漿劑、乳劑、懸浮劑等。此類組合物通過公眾已知的方法產(chǎn)生，并且可以包含在藥物制備領域中常用的載體、稀釋劑或賦形劑。作為用于片劑的載體或賦形劑的實例，可以使用乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
[0090] 用于胃腸外或口服施用的上述藥物組合物被便利地制備在適用于活性成分的劑量的藥物單位劑型中。作為此類藥物單位劑型的實例，可以提到片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑 (安瓿）和栓劑。優(yōu)選的是，可以以例如，每個藥物單位劑型通常5至500 mg，特別是5至 100 mg用于注射劑，或10至250 mg用于其它劑型，來含有上述本發(fā)明的AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物。
[0091] 盡管本發(fā)明的包含AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物的上述預防劑或治療劑的劑量根據(jù)施用的主體、目標疾病、癥狀、施用途徑等而變化；例如，當該藥劑用于治療/預防成人中的肝臟疾病時，基于單一劑量，通過靜脈內(nèi)注射，每天約1至5次，優(yōu)選每天約1至3次，通常以約0. 01至20 mg/kg體重，優(yōu)選約0. 1至10 mg/kg體重，且更優(yōu)選約 0.1至5 mg/kg體重方便地施用本發(fā)明的AIMs。在腸胃外施用和口服施用的其它模式的情況下，可以施用相似的劑量。在癥狀特別嚴重的情況下，可以根據(jù)癥狀增加劑量。
[0092] 每種上述組合物都可以包含當與上述AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物配制時不產(chǎn)生不想要的相互作用的任何其它活性成分。
[0093] 此外，本發(fā)明的AMs、誘導AM表達的藥物或穩(wěn)定AM的藥物可以與可用于治療肝臟疾病的其它藥物組合使用，所述可用于治療肝臟疾病的其它藥物諸如胰島素增敏劑（例如，噻唑烷衍生物類，諸如羅格列酮、吡格列酮等等，雙胍類，諸如二甲雙胍、丁雙胍等）；抗氧化劑類（例如，維生素 E、維生素 C、甜菜堿、EPL(多烯磷脂酰膽堿）等）；護肝劑（例如熊去氧膽酸（UDCA)等）；抗高血脂癥劑（例如，貝特類藥物、普羅布考、他汀類藥物等）；降壓藥（例如，血管緊張素 II受體拮抗劑等）；甘草素制劑；中國草藥（例如，小柴胡湯等）；抗癌劑等。本發(fā)明的AIMs、誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物和上述藥物可以一次或不同次施用于患者。
[0094] 如上所述，證實了與野生型小鼠相比，AM敲除小鼠在高脂肪膳食飼喂條件下高頻率發(fā)生類似于非酒精性脂肪性肝炎（NASH)的病理學的肝臟疾病，并進一步進展為肝硬化和肝細胞癌。這表明，高脂肪膳食飼喂條件下的AIM敲除小鼠可以作為肝臟疾病的新模型小鼠提供。因此，本發(fā)明提供了針對用于預防或治療肝臟疾病的藥劑的篩選方法，其使用通過用高脂肪膳食飼喂AM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
[0095] AM表達缺陷的非人哺乳動物意指其中內(nèi)源AM的表達失活的非人哺乳動物，包括從其中AIM敲除（KO)的ES細胞制備的AM KO動物，以及其中AIM表達被反義或RNAi 技術失活的敲低（KD)動物等。在這里，"敲除（KO) "意指通過破壞或去除內(nèi)源基因而防止完整mRNA的產(chǎn)生，而"敲低（KD) "意指抑制從mRNA翻譯為蛋白以失活內(nèi)源基因的表達。在下文中，本發(fā)明的AM K0/KD動物有時簡稱為"本發(fā)明的K0/KD動物"。本發(fā)明的AM KO動物公開于 Miyazaki T.等人·（J. Exp. Med.，189，413-422，1999) 〇
[0096] 可以是本發(fā)明的主體的"非人哺乳動物"沒有特別限制，只要它是已經(jīng)對其建立轉基因系統(tǒng)的非人哺乳動物；實例包括小鼠、大鼠、牛、猴、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等。兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠等是優(yōu)選的；具體而言，從疾病模型動物制備的觀點來看，具有相對短的個體發(fā)育時期和生命周期且易于繁殖的嚙齒類動物是更優(yōu)選的；具體地，小鼠（例如，作為純系的C57BL/6品系、BALB/c品系、DBA2品系等，作為雜交系的B6C3Fi 品系、BDF1S系、B6D2F i品系、ICR品系）和大鼠（例如，Wistar、SD等）是優(yōu)選的。
[0097] 除了哺乳動物以外，鳥類諸如雞可用于與作為本發(fā)明的主體的"非人哺乳動物"的目的相同的目的。
[0098] 用于敲除AIM的具體方法公開于上述Miyazaki T.等人（J. Exp. Med，189， 413-422，1999)。作為其它已知的一般方法，可以優(yōu)選使用包括以下的方法：通過常規(guī)方法分離源自主體非人哺乳動物的AM(基因組DNA)，并通過例如（1)通過將另一 DNA片段 (例如，藥物抗性基因，報道基因等）插入外顯子部分或啟動子區(qū)域而破壞外顯子或啟動子的功能，或（2)使用Cre-IoxP系統(tǒng)或Flp-frt系統(tǒng)切出AM的整體或部分以缺失基因，或 (3)將終止密碼子插入蛋白編碼區(qū)以防止翻譯為完整蛋白，或（4)將終止基因轉錄的DNA序列（例如，多聚腺苷酸附加信號等）插入轉錄區(qū)以防止合成完整的mRNA(以下簡稱為靶向載體），通過同源重組等在主體非人哺乳動物的AIM基因座處整合具有構建以隨后失活基因的DNA序列的DNA鏈。
[0099] 同源重組可以通過，例如，將上述靶向載體引入胚胎干細胞（ES細胞）來獲得。
[0100] ES細胞是指在胚泡期源自受精卵的內(nèi)細胞團（ICM)的細胞，并且可以培養(yǎng)和維持，同時在體外保持未分化狀態(tài)。ICM細胞注定形成胚體，是所有組織包括生殖細胞都基于其的干細胞。所使用的ES細胞可以是建立的細胞系，或根據(jù)Evans和Kaufman (Nature, vol. 292，p. 154，1981)的方法新建立的細胞系。例如，在小鼠 ES細胞的情況下，目前通常使用源自129小鼠品系的ES細胞，但其免疫學背景不清楚；出于獲得具有免疫學清楚的遺傳背景的純系的ES細胞等來替代它的目的，也可以合適地使用從C57BL/6小鼠或從BDF/J、鼠（C57BL/6和08八/2的？1)建立的ES細胞等，其中可從C57BL/6收集的少數(shù)卵子已經(jīng)通過與DBA/2雜交而進行改良。除了可收集的卵子數(shù)目高且卵子強健的優(yōu)點以外，BDF 1小鼠具有C57BL/6小鼠作為其背景；因此，可以有利地使用由其衍生的ES細胞，因為當制備疾病模型小鼠時，遺傳背景可以通過與C57BL/6小鼠回交而用C57BL/6小鼠的遺傳背景來替代。ES 細胞可以在適當條件下通過單層培養(yǎng)（直至達到高密度），或懸浮培養(yǎng)（直至形成細胞聚集物）被分化為許多種類型的細胞，包括體壁?。╬arietal muscle)、內(nèi)臟肌和心肌[M.J. Evans和M.H. Kaufman, Nature vol. 292, p. 154, 1981; G. R. Martin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ), vol. 78, p. 7634, 1981; T. C. Doetschman 等人，Journal of Embryology and Experimental Morphology，vol. 87，p. 27，1985];通過分化整合有靶向載體的ES細胞獲得的AM表達缺陷的非人哺乳動物的細胞可用于AIM的體外細胞生物學研宄中。
[0101] 例如，如果靶向載體被設計成通過將另一 DNA片段插入AM基因的外顯子部分或啟動子區(qū)域以破壞外顯子或啟動子的功能，則該載體可以假定，例如，下面所示的構造。
[0102] 首先，為了確保另一 DNA片段通過同源重組插入AM的外顯子或啟動子部分，靶向載體需要包含與其它DNA片段中5'的上游和3'的下游的各目標位點（5'臂和3'臂）同源的序列。
[0103] 盡管插入的其它DNA片段沒有特別限制，但可通過使用藥物抗性基因或報道基因選擇在其染色體中整合具有藥物抗性或報道基因活性作為指標的靶向載體的ES細胞。在這里，藥物抗性基因的實例和報道基因的實例包括，但不限于，分別新霉素磷酸轉移酶II (nptll)基因、潮霉素磷酸轉移酶（HPT)基因等，和β-半乳糖苷酶（IacZ)基因、氯霉素乙酰轉移酶（cat)基因等。
[0104] 藥物抗性或報道基因優(yōu)選在任意選擇的能夠在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的啟動子的控制下。例如，可以提到病毒啟動子，諸如SV40早期啟動子、巨細胞病毒（CMV)長末端重復（LTR)、勞斯肉瘤病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生的早期啟動子、和用于哺乳動物組成型蛋白基因的啟動子，諸如肌動蛋白基因啟動子、 PGK基因啟動子和轉鐵蛋白基因啟動子等。然而，如果將藥物抗性或報道基因插入AIM中，從而使得其被置于AIM的內(nèi)源啟動子的控制之下，則控制該基因的轉錄的啟動子不需要存在于革G向載體中。
[0105] 靶向載體優(yōu)選具有終止從藥物抗性或報道基因下游的基因（多腺苷酸化（polyA) 信號，也稱為終止子）轉錄mRNA的序列；例如，可以使用源自病毒基因或源自各種哺乳動物或鳥類基因的終止子序列。優(yōu)選地，使用SV40終止子等。
[0106] 通常，哺乳動物中的基因重組主要非同源地發(fā)生；引入的DNA被隨機地插入染色體上任意選擇的位置。因此，不可能通過基于檢測藥物抗性或報道基因等的表達的選擇 (陽性選擇）有效地只選擇靶向至由同源重組靶向的內(nèi)源AM的那些克??；有必要對于所有選擇的克隆通過DNA雜交或PCR證實整合位點。因此，如果，例如，賦予丙氧鳥苷敏感性的單純皰瘆病毒衍生的胸苷激酶（HSV-tk)基因接合在與靶向載體的目標序列同源的區(qū)域之外，則具有隨機插入其中的載體的細胞不能在包含丙氧鳥苷的培養(yǎng)基上生長，因為它們具有HSV-tk基因，而通過同源重組靶向至內(nèi)源AM基因座的細胞變得對丙氧鳥苷耐受，并得到選擇，因為它們不具有HSV-tk基因（陰性選擇）?；蛘?，如果將白喉毒素基因，例如，接合以替代HSV-tk基因，則具有隨機插入其中的載體的細胞由于本身產(chǎn)生的毒素而死亡，從而使得也可以在藥物不存在的情況下選擇同源重組體。
[0107] 盡管磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉染法、逆轉錄病毒感染法、凝集法、顯微注射法、基因槍（粒子槍）法、DEAE-葡聚糖法等中的任一種都可用于靶向載體引入ES細胞，但因為易于處理大量細胞等而通常選擇電穿孔法，因為哺乳動物中的基因重組主要非同源地發(fā)生，從而使得如上所述獲得同源重組體的頻率低。對于電穿孔，可以原樣使用用于轉染到動物細胞中的普通條件；例如，電穿孔可以這樣進行：通過在對數(shù)生長期胰蛋白酶消化ES細胞以便將它們分散為單細胞，將細胞懸浮在培養(yǎng)基中以獲得IO 6至10 8個細胞/ ml的密度，將細胞轉移至小杯中，添加10至100 μ g的靶向載體，并施加200至600 V/cm 的電脈沖。
[0108] 其中整合靶向載體的ES細胞可以通過由DNA雜交或PCR篩選從通過在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)單細胞獲得的集落分離和提取的染色體DNA進行確定；如果藥物抗性基因或報道基因被用作其它DNA片段，則可能在細胞階段用其表達作為指標來選擇轉化體。例如，如果使用包含nptll基因作為用于陽性選擇的標記基因的載體，將轉染處理后的ES細胞在包含新霉素系列抗生素諸如G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且選擇所得抗性集落作為轉化體的候選者。如果使用包含HSV-tk基因作為用于陰性選擇的標記基因的載體，將ES細胞在包含丙氧鳥苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且選擇所得抗性集落作為同源重組體的候選者。將獲得的集落轉移至各自培養(yǎng)板，并重復胰蛋白酶消化和培養(yǎng)基交換，其后保留部分用于培養(yǎng)，并且使剩余部分進行PCR或DNA雜交來證實引入的DNA的存在。
[0109] 當將證實其中整合有引入的DNA的ES細胞返回至源自相同物種的非人哺乳動物來源的胚胎時，ES細胞整合到宿主胚胎的ICM中，以形成嵌合胚胎。將其移植至受體母體 (雌性胚胎受體）中，并允許繼續(xù)發(fā)育，從而獲得嵌合的KO動物。如果ES細胞有助于在嵌合動物中形成將分化為卵子或精子的原生殖細胞，則將獲得種系嵌合體；通過將其交配，可以制備其中遺傳維持AIM的表達缺陷的KO動物。
[0110] 為了制備嵌合胚胎，存在其中將最多至桑椹胚期的早期胚胎粘附并聚集在一起的方法（聚集嵌合體方法），和其中將細胞顯微注射至胚泡的胚泡腔的方法（注射嵌合體方法）。盡管在使用ES細胞制備嵌合胚胎中已傳統(tǒng)上廣泛實施后者，但作為不需要顯微操作器且可以容易操作的方法，近來已實施其中通過將ES細胞注射至8細胞期胚胎的透明帶中而生成聚集嵌合體的方法，和其中通過將ES細胞團和去除透明帶的8細胞期胚胎共培養(yǎng)并聚集而生成聚集嵌合體的方法。
[0111] 在所有情況下，宿主胚胎可以收集自如下以相同方式提到的可以用作轉染至受精卵中的用于卵收集的雌性的非人哺乳動物；例如，在小鼠的情況下，為了使得可能通過毛色確定ES細胞對形成嵌合體小鼠的百分比貢獻，優(yōu)選的是，宿主胚胎收集自顯示與ES細胞來源的品系的毛色不同的毛色的品系的小鼠。例如，在源自129小鼠品系（毛色：深淺環(huán) 紋（agouti))的ES細胞的情況下，C57BL/6小鼠（毛色：黑色）或ICR小鼠（毛色：白化）用作用于收集卵的雌性；在源自C57BL/6或DBF 1小鼠（毛色：黑色）或源自TT2細胞（源自C57BL/6和CBA的F1 (毛色：深淺環(huán)紋））的ES細胞的情況下，ICR小鼠或BALB/c小鼠 (毛色：白化）可用作用于收集卵的雌性。
[0112] 因為種系嵌合體形成能力主要取決于ES細胞和宿主胚胎的組合，所以更優(yōu)選選擇顯示高種系嵌合體形成能力的組合。例如，在小鼠的情況下，優(yōu)選使用源自C57BL/6品系的宿主胚胎等用于源自129品系的ES細胞，并使用源自BALB/c品系的宿主胚胎等用于源自C57BL/6品系的ES細胞。
[0113] 優(yōu)選的是，用于卵收集的雌性小鼠為約4至約6周齡，并且用于交配的雄性小鼠是約2至約8個月齡的相同品系。盡管交配可以通過自然交配，但其優(yōu)選在施用促性腺激素 (促卵泡激素，然后促黃體激素）以誘導過度排卵后進行。
[0114] 在胚泡注射方法的情況下，胚泡胚胎（例如，在小鼠的情況下，在交配后約3. 5天）收集自用于卵收集的雌性的子宮（或桑椹胚期中或收集自輸卵管之前、之后的早期胚胎，可以在用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基（下述）中培養(yǎng)，直至胚泡期），且將具有引入其中的靶向載體的ES細胞（約10至約15個細胞）用顯微操作器注射入胚泡的胚泡腔，其后將胚胎移植到假孕胚胎受體雌性非人哺乳動物的子宮中。作為胚胎受體雌性非人哺乳動物，可以以相同的方式使用可用作轉染到受精卵中的胚胎受體雌性的非人哺乳動物。
[0115] 在共培養(yǎng)方法的情況下，8-細胞期胚胎和桑椹胚（例如，在小鼠的情況下，在交配后約2. 5天）收集自用于卵收集的雌性的輸卵管和子宮（或8細胞期中或收集自輸卵管之前、之后的早期胚胎，可以在用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基（下述）中培養(yǎng)，直至8-細胞期或桑椹胚期），且將透明帶溶解在酸性臺氏溶液中，其后，將整合有靶向載體的ES細胞團（細胞數(shù)：約10至約15個細胞）置于用礦物油覆蓋的用于胚胎培養(yǎng)的介質(zhì)的微滴中，將上述8-細胞期胚胎或桑椹胚（優(yōu)選2個胚胎）進一步放置，并且將它們共同培養(yǎng)過夜。將獲得的桑椹胚或胚泡移植到如上所述的胚胎受體雌性非人哺乳動物的子宮。
[0116] 如果移植的胚胎成功植入且胚胎受體雌性受孕，則嵌合非人哺乳動物幼崽將通過自然分娩或剖腹產(chǎn)獲得。允許已經(jīng)自然分娩的胚胎受體雌性繼續(xù)哺乳；如果幼崽通過剖腹產(chǎn)分娩，則幼崽可以由分別提供的用于哺乳的雌性（通常交配和分娩的雌性非人哺乳動物）進行哺乳。
[0117] 對于種系嵌合體的選擇，如果已經(jīng)確定ES細胞的性別，則首先選擇與ES細胞性別相同的嵌合體小鼠（通常，選擇雄性嵌合體小鼠，因為使用雄性ES細胞），然后基于表型諸如毛色選擇顯示高ES細胞貢獻率（例如，50%或更高）的嵌合體小鼠被。例如，從D3細胞 (其是源自129小鼠品系的雄性ES細胞）和源自C57BL/6小鼠的宿主胚胎之間的嵌合體胚胎獲得嵌合體小鼠的情況下，優(yōu)選的是，選擇顯示高百分比的深淺環(huán)紋毛色的雄性小鼠。選擇的嵌合體非人哺乳動物是否是種系嵌合體可以基于通過與相同動物物種的適當品系雜交獲得的F 1動物的表型來確定。例如，在上述嵌合體小鼠的情況下，深淺環(huán)紋相對于黑色是顯性的；因此，當雄性小鼠與雌性C57BL/6小鼠雜交時，如果選擇的雄性小鼠是種系嵌合體，則獲得的匕的毛色是深淺環(huán)紋的。
[0118] 通常獲得因此獲得的整合有靶向載體的種系嵌合體非人哺乳動物（創(chuàng)建者）作為 AIM僅在同源染色體中任一者中敲除的雜合子。為了獲得AIM在兩條同源染色體中都敲除的純合子，在如上所述獲得的F1動物中，可以雜交雜合子的同胞動物。雜合子的選擇可以通過，例如，通過DNA雜交或PCR篩選從F 1動物的尾部分離和提取的染色體DNA來確定。獲得的F2動物的1/4將是純合子。
[0119] 在使用病毒作為靶向載體的另一個優(yōu)選實施方案中，可以提到以下方法，所述方法包括用含有包含在5'和3'臂之間插入的用于陽性選擇的標記基因和所述臂外的用于陰性選擇的標記基因的DNA的病毒感染非人哺乳動物的ES細胞（參見，例如，Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 99, No. 4，pp. 2140-2145，2002)。例如，當使用逆轉錄病毒或慢病毒時，將細胞接種到適當?shù)?培養(yǎng)器諸如培養(yǎng)皿中，將病毒載體添加至培養(yǎng)液（如果需要，聚凝胺可以共存在），將細胞培養(yǎng)1至2天，其后，如上所述繼續(xù)培養(yǎng)，并選擇其中整合載體的細胞。
[0120] 關于用于敲低AM的具體方法，可以提到以下方法，所述方法包括使用本身已知的制備轉基因動物的技術引入編碼AM的反義RNA或siRNA (包括shRNA)的DNA，并允許其在主體非人哺乳動物細胞等中。
[0121] 包含與期望多核苷酸的目標區(qū)域互補的堿基序列的DNA，即與期望多核苷酸可雜交的DNA可以被稱為針對期望多核苷酸是"反義"的。
[0122] 具有與編碼AM或其部分的多核苷酸的堿基序列互補或?qū)嵸|(zhì)上互補的堿基序列的反義DNA可以是任何反義DNA，只要它包含與編碼AM或其部分的多核苷酸的堿基序列互補或?qū)嵸|(zhì)上互補且具有抑制多核苷酸表達的作用的堿基序列。
[0123] 與編碼AM的多核苷酸實質(zhì)上互補的堿基序列是，例如，與重疊區(qū)域的多核苷酸的互補鏈的堿基序列具有約70%或更高，優(yōu)選約80%或更高，更優(yōu)選約90%或更高，最優(yōu) 選約95%或更高的同源性的堿基序列。本文中的堿基序列同源性可以，例如，在以下條件 (期望值=10 ;允許缺口；過濾=ON ;匹配得分=1 ;錯配得分=-3)下使用同源性計算算法 NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)來計算。
[0124] 具體地，在編碼AIM的多核苷酸的互補鏈的完整堿基序列中，（a)在意在抑制翻譯的反義DNA的情況下，與編碼AIM的N末端部分的部分的堿基序列（例如，在起始密碼子附近的堿基序列等）的互補鏈具有約70%或更高，優(yōu)選約80%或更高，更優(yōu)選約90%或更高，最優(yōu)選約95%或更高的同源性的反義DNA是合適的，和（b)在意在用RNaseH降解RNA 的反義DNA的情況下，與編碼AM的包括內(nèi)含子的多核苷酸的完整堿基序列的互補鏈具有約70%或更高，優(yōu)選約80%或更高，更優(yōu)選約90%或更高，最優(yōu)選約95%或更高的同源性的反義DNA是合適的。
[0125] 具體地，當主體非人哺乳動物是小鼠時，可以提到包含與以GenBank登錄號： AF011428注冊的堿基序列或其部分互補或?qū)嵸|(zhì)上互補的堿基序列的反義DNA，優(yōu)選地，包含與所述堿基序列或其部分互補的堿基序列的反義DNA等。
[0126] 可以基于編碼克隆的或測定的AIM的DNA的堿基序列信息設計并合成具有與編碼 AIM或其部分的多核苷酸的堿基序列互補或?qū)嵸|(zhì)上互補的堿基序列的反義DNA(下文也稱為"本發(fā)明的反義DNA")。此類反義DNA能夠抑制AM的復制和表達。具體地，本發(fā)明的反義DNA能夠與從AM轉錄的RNA (mRNA或初始轉錄產(chǎn)物）雜交，并且能夠抑制mRNA的合成 (加工）或功能（翻譯成蛋白）。
[0127] 本發(fā)明的反義DNA的目標區(qū)域關于其長度沒有特別限制，只要翻譯成AIM由于反義DNA的雜交而受到抑制；目標區(qū)域可以是編碼蛋白的mRNA的整個序列或部分序列，且長度最短為約10個堿基，并且最長為mRNA或初始轉錄產(chǎn)物的整個序列。具體地，可以選擇 AM的5'末端發(fā)夾環(huán)、5'末端6堿基對重復、5'末端非翻譯區(qū)、翻譯起始密碼子、蛋白編碼區(qū)、ORF翻譯終止密碼子、3'末端非翻譯區(qū)、3'末端回文區(qū)、或3'末端發(fā)夾環(huán)作為反義DNA 的優(yōu)選目標區(qū)域，但也可以選擇AIM基因的任何其它區(qū)域作為目標。例如，該基因的內(nèi)含子部分也可以是目標區(qū)域。
[0128] 此外，本發(fā)明的反義DNA可以是以下反義DNA，所述反義DNA不僅與AM的mRNA或初始轉錄產(chǎn)物雜交以抑制翻譯成蛋白，而且能夠結合至作為雙鏈DNA的AM以形成三重鏈 (三鏈體（triplex))，從而抑制轉錄為RNA?；蛘撸景l(fā)明的反義DNA可以是形成的DNA: RNA 雜合體以誘導被RNaseH降解的反義DNA。
[0129] 編碼能夠特異性切割編碼AIM的mRNA或編碼區(qū)域內(nèi)的初始轉錄產(chǎn)物（在初始轉錄產(chǎn)物的情況下，包括內(nèi)含子部分）的核酶的DNA也可以涵蓋在本發(fā)明的反義DNA中。最通用核酶之一是感染性RNA諸如類病毒和擬病毒中發(fā)現(xiàn)的自我剪接RNA，并且錘頭型、發(fā)夾型等是已知的。錘頭型表現(xiàn)出酶活性，具有長度約40個堿基，并且可能通過使側接錘頭結構部分的兩端的幾個堿基（總共約10個堿基）變?yōu)榕cmRNA的期望切割位點互補的序列而特異性切割目標mRNA。因為這種類型的核酶僅以RNA作為底物，所以它提供了不攻擊基因組DNA的額外優(yōu)點。如果AM mRNA本身假定雙鏈結構，則可以通過使用通過接合可以特異性結合RNA解旋酶的源自病毒核酸的RNA基序而制備的雜合核酶而使得目標序列成為單鏈的[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10):5572-5577 (2001)]。此外，核酶可以是通過進一步接合從促進轉錄產(chǎn)物易位到細胞質(zhì)的tRNA修飾的序列而制備的雜合核酶[Nucleic Acids Res·，29(13):2780-2788 (2001)]。
[0130] 在本文中，由與AIM的mRNA或初始轉錄產(chǎn)物的編碼區(qū)中的部分序列（在初始轉錄產(chǎn)物的情況下，包括內(nèi)含子部分）同源的寡-RNA (oligo-RNA)和與之互補的鏈（即所謂的單鏈干擾RNA(siRNA))組成的雙鏈RNA也可用于制備本發(fā)明的KD動物。已知所謂的RNA干擾（RNAi)(這是當siRNA被引入細胞中，與所述RNA同源的mRNA被降解的現(xiàn)象）發(fā)生在線蟲、昆蟲、植物等中；因為這種現(xiàn)象被證實也發(fā)生在動物細胞中[Nature, 411 (6836) :494-498 (2001)]，所以siRNA已被廣泛地用作核酶的替代技術。siRNA可以使用商購軟件（例如RNAi Designer; Invitrogen)基于作為目標的mRNA的堿基序列信息來適當?shù)卦O計。
[0131] 本發(fā)明的反義寡-DNA和核酶可以通過基于AM的cDNA序列或基因組DNA序列來確定mRNA或初始轉錄產(chǎn)物的目標序列，并使用商購的DNA/RNA合成儀（Applied Biosystems, Beckman等）合成與其互補的序列來制備。通過經(jīng)由根據(jù)需要使用的適當接頭（銜接分子）序列將合成的反義寡-DNA或核酶插入在表達載體中啟動子的下游，可以制備編碼反義寡-RNA或核酶的DNA表達載體。在這里可以優(yōu)選使用的表達載體的實例包括用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母，菌體諸如λ 菌體，逆轉錄病毒諸如莫洛尼白血病病毒，動物或昆蟲病毒諸如慢病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等擴增的質(zhì)粒。尤其而言，質(zhì)粒（優(yōu)選來自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母的質(zhì)粒，特別是來自大腸桿菌的質(zhì)粒）和動物病毒（優(yōu)選逆轉錄病毒、慢病毒）是優(yōu)選的。啟動子的實例包括病毒啟動子，諸如SV40早期啟動子、巨細胞病毒（CMV)長末端重復（LTR)、勞斯肉瘤病毒（RSV)LTR、小鼠白血病病毒（MoMuLV) LTR、和腺病毒（AdV)衍生的早期啟動子、和用于哺乳動物組成型蛋白基因的啟動子，諸如肌動蛋白基因啟動子、PGK基因啟動子和轉鐵蛋白基因啟動子等。
[0132] 編碼較長反義RNA (例如，AM mRNA的全長互補鏈等）的DNA表達載體可以通過經(jīng) 由根據(jù)需要使用的適當接頭（銜接分子）序列以相反方向?qū)⑼ㄟ^常規(guī)方法克隆的AIM cDNA 插入在表達載體中啟動子的下游來制備。
[0133] 同時，編碼siRNA的DNA可以通過分別合成編碼有義鏈的DNA和編碼反義鏈的 DNA，并將它們插入適當?shù)谋磉_載體中來制備。作為siRNA表達載體，可以使用具有Pol III 系統(tǒng)啟動子諸如U6或Hl的siRNA表達載體。在這種情況下，在整合有載體的動物細胞中，將有義鏈和反義鏈轉錄并退火以形成siRNA。shRNA可以通過將包含通過長度堿基（所述長度堿基允許形成適當?shù)沫h(huán)結構（例如，約15至25個堿基））分隔的有義鏈和反義鏈的單元插入適當表達載體中來制備。作為shRNA表達載體，可以使用具有Pol III系統(tǒng)啟動子諸如U6或Hl的shRNA表達載體。在這種情況下，在整合有表達載體的動物細胞中轉錄的 shRNA本身形成環(huán)，然后由內(nèi)源酶Dicer酶等處理，以形成成熟的siRNA?；蛘撸部赡芡ㄟ^ 使用Pol II系統(tǒng)啟動子表達包含作為目標的siRNA序列的微小RNA(miRNA)而實現(xiàn)通過 RNAi的敲低。在這種情況下，通過顯示組織特異性表達的啟動子，組織特異性敲低也是可能的。
[0134] 為了將包含編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的表達載體引入細胞，根據(jù)目標細胞適當?shù)厥褂帽旧硪阎姆椒?。例如，為了引入早期胚胎諸如受精卵，使用顯微注射法。為了引入ES細胞，可以使用磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉染法、逆轉錄病毒感染法、凝集法、顯微注射法、粒子槍方法、DEAE-葡聚糖法等?；蛘撸斈孓D錄病毒、慢病毒等被用作載體時，有時可能通過將病毒添加至早期胚胎或ES細胞，并培養(yǎng)胚胎或細胞1至2天以便用病毒感染細胞而便利地實現(xiàn)轉染。從ES細胞（建立創(chuàng)建者）再生個體、傳代（制備純合子）等可以如上關于本發(fā)明的KO動物所述來進行。
[0135] 在一個優(yōu)選的實施方案中，通過顯微注射將包含編碼AM的反義RNA、siRNA、 shRNA、或miRNA的DNA的表達載體引入作為主體的非人哺乳動物的早期胚胎（受精卵）。
[0136] DNA顯微注射至受精卵中可以通過常規(guī)方法使用通常已知的裝置諸如顯微操作器來進行。簡而言之，使用固定移液器將置于用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基的微滴中的受精卵抽吸并固定，并且使用注射移液器將DNA溶液直接注射至雄性或雌性原核，優(yōu)選為雄性原核。引入的DNA優(yōu)選在使用CsCl密度梯度超速離心或者陰離子交換樹脂柱等高度純化后使用。還優(yōu)選的是，將引入的DNA通過使用限制性內(nèi)切酶切割載體部分預先進行線性化。
[0137] 引入DNA后，將受精卵通過微滴培養(yǎng)法等在5%氣態(tài)二氧化碳/ 95%大氣中在用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至1細胞期至胚泡期，其后將其移植到使得假孕的用于接受胚胎的雌性非人哺乳動物的輸卵管或子宮。用于接受胚胎的雌性非人哺乳動物可以是任一種與待移植的早期胚胎來源的動物相同的物種；例如，當移植小鼠早期胚胎時，優(yōu)選使用雌性ICR小鼠（優(yōu)選約8至約10周齡）等。使得用于接受胚胎的雌性非人哺乳動物假孕的已知方法是，例如，包括將雌性與切除輸精管（結扎輸精管）的相同物種的雄性非人哺乳動物（例如，在小鼠的情況下，用雄性ICR小鼠（優(yōu)選約2個月或更大齡））交配，并選擇證實具有陰道塞的雌性的方法。
[0138] 使用的用于胚胎培養(yǎng)的雌性可以是已經(jīng)自發(fā)排卵的雌性，或者在與切除輸精管（結扎輸精管）的雄性交配之前接受施用的促黃體激素釋放激素（通常簡稱為LHRH) 或其類似物以誘導生育力的雌性。LHRH類似物的實例包括[3, 5-Di I-Tyr5] -LH-RH、
[01118]-1^-冊、〇)-六136]-1^-冊、[(168-6171。]-1^-冊、〇)-把8(821) 6]-1^-冊和其乙基酰胺類 (Ethylamides)等。施用的LHRH或其類似物的量和施用后與雄性非人哺乳動物的交配的時間根據(jù)非人哺乳動物的種類而變化。例如，當非人哺乳動物是小鼠（優(yōu)選ICR小鼠等）時，通常優(yōu)選的是，在施用LHRH或其類似物之后約4天將雌性小鼠與雄性小鼠交配；施用的 LHRH或其類似物的量通常為約10至60 μ g/個體，優(yōu)選約40 μ g/個體。
[0139] 通常，如果待移植的早期胚胎是在桑椹胚期或之后，則將胚胎移植到用于接受胚胎的雌性的子宮；如果早期胚胎是在桑椹胚期之前的階段（例如，1-細胞期至8細胞期胚胎），則將胚胎移植到輸卵管。根據(jù)待移植的胚胎的發(fā)育階段，在變得假孕之后給定天數(shù)過去之后，適當?shù)厥褂糜糜诮邮芘咛サ拇菩?。例如，在小鼠的情況下，變得假孕之后約0. 5天的雌性小鼠優(yōu)選用于移植2-細胞期胚胎，并且變得假孕之后約2. 5天的雌性小鼠優(yōu)選用于移植胚泡胚胎。將用于接受胚胎的雌性麻醉（優(yōu)選地，使用阿佛丁、耐波他等）后，進行切開，拉出卵巢，并且使用用于胚胎移植的移液器將在用于胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)基中懸浮的早期胚胎（約5至約10個胚胎）注射入輸卵管的腹腔口（abdominal osteum)的附近或子宮角的輸卵管接合部。
[0140] 當移植的胚胎成功植入且胚胎受體雌性受孕時，非人哺乳動物幼崽將通過自然分娩或剖腹產(chǎn)獲得。允許已經(jīng)自然分娩的胚胎受體雌性繼續(xù)哺乳；當幼崽通過剖腹產(chǎn)分娩時，幼崽可以由分別提供的用于哺乳的雌性進行哺乳（例如，在小鼠的情況下，具有通常交配和分娩的雌性小鼠（優(yōu)選為雌性ICR小鼠等））。
[0141] 確保在受精卵細胞階段轉移編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA，從而使得引入的DNA將存在于主體非人哺乳動物的所有種系細胞和體細胞中。引入的DNA 是否被整合在染色體DNA中可以通過，例如，通過DNA雜交或PCR篩選從幼崽的尾部分離和提取的染色體DNA進行確定。如上所述獲得的后代非人哺乳動物（F tl)的種系細胞中表達載體的存在意指該表達載體存在于隨后世代（F1)中所有動物的所有生殖系細胞和體細胞中。
[0142] 通常，F(xiàn)tl動物作為在任一同源染色體中具有引入的DNA的雜合子獲得。不同F(xiàn) tl個體具有在不同的染色體上隨機插入的引入的DNA，除非插入是通過同源重組。為了獲得在兩條同源染色體中都具有表達載體的純合子，將F tl動物與非轉基因動物雜交以制備F i動物，并且可以雜交在任一同源染色體中具有引入的DNA的其雜合的同胞動物。如果引入的DNA 只在一個基因座上整合，則1/4獲得的F2動物將是純合的。
[0143] 在使用病毒作為載體的另一個優(yōu)選的實施方案中，與KO動物的上述情況的一樣，可以提到包括用包含編碼AM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA的病毒感染非人哺乳動物的早期胚胎或ES細胞的方法。當受精卵被用作細胞時，優(yōu)選的是，在感染前去除透明帶。病毒載體感染后培養(yǎng)1至2天后，在早期胚胎的情況下，將受精卵移植到如上所述使得假孕的用于接受胚胎的雌性非人哺乳動物的輸卵管或子宮，或者在ES細胞的情況下，受精卵繼續(xù)在添加如上所述的選擇藥物的情況下進行培養(yǎng)，并且選擇整合有載體的細胞。
[0144] 此外，如 Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 98，pp. 13090-13095，2001 中所述，從雄性非人哺乳動物收集的精原細胞在與STO飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)的過程中用病毒載體感染，其后將精原細胞注入雄性不育的非人哺乳動物的輸精管，并且將雄性不育的非人哺乳動物與雌性非人哺乳動物交配，由此可以有效獲得對于編碼AIM的反義RNA、siRNA、shRNA或miRNA的DNA是雜合-Tg (+/-)的幼崽。
[0145] 描述于 Miyazaki Τ·等人（J. Exp. Med.，189，413-422，1999)或通過上述方法獲得的本發(fā)明的AIM基因表達缺陷的非人哺乳動物在高脂肪膳食飼喂條件下具有以下特征： (1) 肝重量增加， (2) 脂肪肝得到促進， (3) 脂肪肝得到發(fā)生，和/或 (4) 肝臟中炎癥應答受到抑制。
[0146] 此外，像野生型動物一樣，本發(fā)明的AM表達缺陷的非人哺乳動物在高脂肪膳食飼喂條件下特征性地顯示了促進的肝纖維化。這些表型至少在常規(guī)公眾已知的AM KO小鼠中還沒有報道。具體地，從脂肪肝變?yōu)楦卫w維化再變?yōu)楦伟╊愃朴贜ASH的病理學，這是新發(fā)現(xiàn)。
[0147] (1)肝重量增加意指，通過用高脂肪膳食飼喂，與野生型動物相比，本發(fā)明的AM 表達缺陷的非人哺乳動物中肝重量和/或肝重量/體重（％)變得顯著不同。在下述實施例中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼喂的第6周起在AIM敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)顯著差異。
[0148] (2)脂肪肝得到促進意指，通過用高脂肪膳食飼喂，與野生型動物相比，本發(fā)明的 AIM表達缺陷的非人哺乳動物的肝臟中在早期階段觀察到脂肪積累。脂肪在肝臟中的積累也可以通過，例如，用油紅0染色肝組織切片來證實?；蛘?，它也可以通過測量肝組織中的中性脂肪的量來證實。在下述實施例中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼喂的第6周起在AM敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)顯著差異。
[0149] (3)肝癌得到發(fā)生意指，通過用高脂肪膳食飼喂，在本發(fā)明的AIM表達缺陷的非人哺乳動物中觀察到肝癌的發(fā)病。肝癌可以，例如，通過用抗AFP(a -甲胎蛋白）染色肝組織切片，測定肝組織中的AFP表達水平，或測量血液AFP濃度進行證實。在下述實施例中，甚至從高脂肪膳食飼喂起一年后也幾乎無法在野生型小鼠中證實肝癌，但從高脂肪膳食飼喂起一年在所有AIM敲除小鼠中都發(fā)現(xiàn)肝癌。
[0150] (4)肝臟中炎癥應答受到抑制意指，與野生型動物相比，本發(fā)明的AM表達缺陷的非人哺乳動物中炎癥應答受到抑制，甚至當它們用高脂肪膳食飼喂時。炎癥應答可以通過例如，F(xiàn)4/80 (巨噬細胞標記物）、TNF a、IL-6或IL-I β的表達來證實。在下述實施例中，與野生型小鼠相比，從高脂肪膳食飼喂的第12周起在AIM敲除小鼠中肝臟中的炎癥受到顯著抑制。
[0151] 肝纖維化得到促進意指，像野生型動物一樣，通過用高脂肪膳食飼喂，在本發(fā)明的 AM表達缺陷的非人哺乳動物中觀察到肝纖維化。肝纖維化可以通過，例如，用天狼星紅染色肝組織切片來證實。盡管已知由于肝星狀細胞的膠原合成參與肝纖維化，但它也可以通過a SMA(其是肝星狀細胞的標記物）的表達來證實。它也可以通過肝臟中TGFM、膠原 4Α1的表達來證實。在下述實施例中，從高脂肪膳食飼喂的第20周起在野生型小鼠和AM 敲除小鼠中觀察到肝纖維化。此外，從高脂肪膳食飼喂的第20周起在野生型小鼠和AIM敲除小鼠中觀察到a SMA的高表達。TGFM趨向于顯示與高脂肪膳食飼喂時期的長度成比例的表達水平的增加。然而，在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之間沒有觀察到纖維化水平和 a SMA和TGF β 1的表達水平的顯著差異。
[0152] 這些發(fā)現(xiàn)表明，置于高脂肪膳食飼喂條件下的AIM表達缺陷的非人哺乳動物可用作肝臟疾病的動物模型，并且可以進一步用于篩選肝臟疾病的預防藥物或治療藥物。具體地，本發(fā)明的篩選方法包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質(zhì)的步驟， (2) 觀察用測試物質(zhì)施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎癥應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質(zhì)比較來選擇改善上述特性的測試物質(zhì)的步驟。
[0153] 用于本發(fā)明的篩選方法中飼喂AIM表達缺陷的非人哺乳動物的高脂肪膳食沒有特別限制，只要脂質(zhì)含量高。它通常具有不小于20 %，優(yōu)選不小于30 %，更優(yōu)選不小于40 % 的脂質(zhì)含量。用高脂肪膳食飼喂AM表達缺陷的非人哺乳動物的時期是至少直到可以證實上述特性。飼喂時期不小于6周，更優(yōu)選不小于12周，進一步優(yōu)選不小于20周。
[0154] 作為待施用于AIM表達缺陷的非人哺乳動物的測試物質(zhì)，可以使用蛋白、肽、抗體、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細胞提取物、植物提取物、動物組織提取物、血漿等。施用測試物質(zhì)的時機可以是高脂肪膳食飼喂的開始前或與其開始同時，或者在AIM表達缺陷的非人哺乳動物的高脂肪膳食飼喂后觀察上述特性之后。施用方法可以是口服或胃腸外的。對于口服施用，其也可以通過與飼料或飲用水混合來施用。作為腸胃外施用，可以提到腹膜內(nèi)施用，通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、滴注等施用，栓劑的直腸施用等。施用可以包括單次施用或多次施用。
[0155] 用測試物質(zhì)施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的特性在施用測試物質(zhì)后，通常約4周或更晚，優(yōu)選6周或更晚進行觀察。至于肝重量，它可以通過測量從上述哺乳動物分離的肝臟的重量和/或肝重量/體重（％)來觀察。至于肝臟脂肪，它可以通過用油紅 O染色上述分離的肝臟的肝組織切片，并且將其染色水平轉化為數(shù)值，或者測量肝組織中中性脂肪的量來觀察。至于肝臟纖維，它可以通過用天狼星紅染色上述分離的肝臟的肝組織切片，并且將其染色水平轉化為數(shù)值來觀察?；蛘?，至于肝臟纖維，它也可以通過將上述分離的肝臟中的a SMA( α -平滑肌肌動蛋白）、TGFf3 1或者膠原4A1的表達水平轉化為數(shù)值來證實。至于肝癌，它可以通過用抗AFP(a-甲胎蛋白）染色上述分離的肝臟的肝組織切片，并且將其染色水平轉化為數(shù)值，或者將上述分離的肝臟中AFP的表達水平轉化為數(shù)值，或者測量血液AFP濃度來觀察。至于肝臟中的炎癥應答，它可以通過將上述分離的肝臟中 F4/80、TNFa、IL-6或IL-Ιβ的表達水平轉化為數(shù)值來證實。
[0156] 將如上所述獲得的上述特性的觀察結果與在測試物質(zhì)的未施用的情況下的結果進行比較?；蛘?，預先繪制肝臟疾病的存在與否和上述特性的相關性圖，并且可以將獲得的上述特性的觀察結果與相關性圖進行比較。優(yōu)選基于顯著差異的存在與否進行比較。
[0157] 當獲得的上述特性的觀察結果相比于測試物質(zhì)的未施用得到改善時，可以選擇測試物質(zhì)作為用于肝臟疾病的預防或治療的藥劑。在這里，得到改善意指（i)肝重量低于測試物質(zhì)的未施用，（ii )肝臟脂肪量（油紅O染色的水平，或中性脂肪的量）低于測試物質(zhì) 的未施用，（iii)肝纖維化的水平（天狼星紅染色的水平，a SMA、TGFf3 1、膠原4A1的表達）低于測試物質(zhì)的未施用，（iv )AFP表達低于測試物質(zhì)的未施用，（V ) F4/80、TNFa、IL-6、 IL-I β的表達高于測試物質(zhì)的未施用。
[0158] 當上述中選擇的測試物質(zhì)被用作用于預防或治療肝臟疾病的藥劑時，它可以以與本發(fā)明的AIMs相同的方式進行配制，并且通過類似的施用途徑并以類似的劑量進行施用。待作為預防劑或治療劑的目標的肝臟疾病可以類似于上述那些。
[0159] 此外，由于高脂肪膳食飼喂條件下的AIM表達缺陷的非人哺乳動物可用作肝臟疾病的動物模型，所以所述哺乳動物可以用于肝臟疾病的預防藥物或治療藥物的評估方法。因此，本發(fā)明還提供了評估用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼喂AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。具體地，本發(fā)明的評估方法包括以下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的以下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎癥應答， (3) 通過將上述特性與未施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評估用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟。
[0160] 本發(fā)明的評價方法中待施用于AIM表達缺陷的非人哺乳動物的用于肝臟疾病的預防劑或治療劑可以是已知的用于肝臟疾病的預防劑或治療劑。其實例包括，但不限于，胰島素增敏劑（例如，噻唑烷衍生物類，諸如羅格列酮、吡格列酮等等，雙胍類，諸如二甲雙胍、丁雙胍等）；抗氧化劑類（例如，維生素 E、維生素 C、甜菜堿、EPL(多烯磷脂酰膽堿）等）；護肝劑（例如熊去氧膽酸（UDCA)等）；抗高血脂癥劑（例如，貝特類藥物、普羅布考、他汀類藥物等）；降壓劑（例如，血管緊張素 II受體拮抗劑等）；甘草素制劑；中國草藥（例如，小柴胡湯等）；抗癌劑等。用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的施用時期、施用方法、施用頻率等可以與上述篩選方法中的那些相同。
[0161] 待通過本發(fā)明的評價方法觀察的特性的觀察方法可以根據(jù)上述篩選方法的描述來進行。當通過評價方法獲得的上述特性的觀察結果比未施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑改善更大程度時，測試物質(zhì)可以被評價為作為用于預防或治療肝臟疾病的藥劑具有較高的預防或治療效果。如本文中所使用，得到改善意指與上述相同。
[0162] 在本發(fā)明的下述實施例中，NASH患者的血清AM濃度被證實為比非NASH患者更低。具體地，進展至肝癌的NASH患者的血清AM濃度被證實為仍然低于沒有進展至肝癌的 NASH患者的血清AM濃度。從上述可見，表明肝臟疾病可以通過測量試驗主體的血液AM 濃度來診斷。具體地，本發(fā)明的診斷方法包括以下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AIM濃度的步驟； (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度與健康人的樣品的AIM濃度比較的步驟； (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低于所述健康人的樣品的AIM濃度時，判斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發(fā)生肝臟疾病的高可能性的步驟。
[0163] 盡管本發(fā)明的診斷方法可適用的試驗主體沒有特別限制，但例如，可以提到具有發(fā)生肝臟疾病的風險或懷疑已經(jīng)發(fā)生肝臟疾病的試驗主體。盡管此類試驗主體沒有限制，但例如，可以提到具有肥胖、糖尿病、高血壓、動脈硬化、高血脂等的癥狀的試驗主體。作為健康人，可以提到還沒有被臨床診斷為具有肝臟疾病的那些，例如，沒有上述癥狀的人。
[0164] 待用于本發(fā)明診斷方法的樣品沒有特別限制，只要它收集自上述試驗主體，并且包含待作為測量目標的AIM基因產(chǎn)物（例如，RNA、蛋白、其裂解產(chǎn)物等）。其實例包括體液，諸如血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、汗液、唾液、滑液等或其級分，和其中含有的細胞，特別是巨噬細胞等。
[0165] 從試驗主體收集的樣品的AM濃度可以通過從巨噬細胞制備RNA (例如，總RNA， mRNA)級分，并測量級分中含有的AM基因的轉錄產(chǎn)物來測量。盡管RNA級分可以通過使用已知方法，諸如胍-CsCl超速離心法、AGPC法等來制備，但可以通過使用商購的RNA提取試劑盒（例如RNeasy Mini試劑盒；由QIAGEN等制造）從痕量巨噬細胞迅速且方便地制備高純總RNA。用于檢測RNA級分中AM基因的轉錄產(chǎn)物的方法的實例包括使用雜交的方法（RNA印跡、斑點印跡、DNA芯片分析等），使用PCR的方法（RT-PCR、競爭性PCR、實時PCR 等）等。定量PCR方法，諸如競爭性PCR、實時PCR等是優(yōu)選的，因為AIM基因表達的變化可以從痕量的巨噬細胞迅速、方便且高定量地檢測。
[0166] 當采用RNA印跡或斑點印跡雜交時，AM基因的轉錄產(chǎn)物可以通過使用能夠與基因的轉錄產(chǎn)物雜交的核酸（探針）來測量。此類核酸的實例包括能夠在高嚴格條件下與包含AIM基因的轉錄廣物顯不的喊基序列（例如，SEQ ID NO: 1中顯不的喊基序列）的核酸雜交的核酸。高嚴格條件是上述條件等。
[0167] 待用作探針的核酸可以是雙鏈或單鏈的。在雙鏈核酸的情況下，它可以是雙鏈 DNA、雙鏈RNA、或DNA = RNA雜合體。在單鏈的情況下，可以使用反義鏈。盡管核酸的長度沒有特別限制，只要它可以與目標核酸特異性雜交，但例如，它不小于約15個堿基，優(yōu)選不小于約30個堿基。核酸優(yōu)選用能夠檢測且定量目標核酸的標記來標記。作為標記試劑，例如，使用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。作為放射性同位素，例如，使用[ 32p]、[3h]、 [14C]等。作為上述酶，優(yōu)選具有高比活性的穩(wěn)定酶；例如，使用β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。作為熒光物質(zhì)，例如，使用熒光胺、異硫氰酸熒光素等。作為發(fā)光物質(zhì)，例如，使用魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外，還可以使用生物素_(鏈霉）抗生物素蛋白用于結合探針和標記。
[0168] 當采用RNA雜交時，將上述制備的RNA級分通過凝膠電泳分離，轉移至硝酸纖維素、尼龍、聚偏二氟乙烯等的膜，在上述高嚴格條件下在包含如上述制備的標記探針的雜交緩沖液中雜交，且通過合適的方法對于各條帶測量與膜結合的標記的量，由此可以測量AM 基因的表達水平。此外，在斑點印跡的情況下，AM基因的表達水平可以通過使點有RNA級分的膜以相同方式進行雜交反應并測量斑點的標記的量來測量。
[0169] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，定量PCR方法用作用于測量AIM濃度的方法。定量 PCR的實例包括競爭性PCR、實時PCR等。
[0170] 用作PCR中的引物的寡核苷酸組沒有特別限制，只要它們可以各自與AIM基因的轉錄產(chǎn)物的有義鏈（編碼鏈）和反義鏈（非編碼鏈）特異性雜交，并且可以擴增它們夾心的DNA片段。例如，可以提到各自具有約15-約100個堿基、優(yōu)選約15-約50個堿基的長度且設計以擴增約100 bp - I kbp DNA片段的寡DNA組。更具體地，作為用作引物的寡核苷酸組，可以提到能夠在高嚴格條件下與包含與上述堿基序列互補的堿基序列的核酸（反義鏈）雜交的核酸。如本文中所使用，高嚴格條件如上定義。
[0171] 在競爭性RT-PCR中，期望的DNA的量通過以下測定：允許已知量的可以由能夠擴增期望的DNA的引物組擴增的另一種模板核酸作為競爭物在反應液中共存，以引起競爭性擴增反應，并比較擴增產(chǎn)物的量。因此，當使用競爭性RT-PCR時，除了上述引物組以外，使用已知量的可以用引物組擴增且在擴增后可以與目標核酸的擴增產(chǎn)物（即AIM基因的轉錄產(chǎn)物）區(qū)分（例如，不同的擴增大小、限制性酶處理后的片段的不同迀移模式等）的競爭物核酸。因為當目標核酸和競爭物核酸競爭引物時擴增競爭性地發(fā)生，所以擴增產(chǎn)物的定量比例反映初始模板的定量比例。競爭物核酸可以是DNA或RNA。在DNA的情況下，cDNA通過逆轉錄反應從如上所述制備的RNA級分合成，并且PCR可以在上述引物組和競爭物共同存在的情況下進行。在RNA的情況下，將競爭物添加至RNA級分并進行逆轉錄反應，且添加上述引物組并進行PCR。在后者的情況下，可以估計初始mRNA的絕對量，因為還考慮逆轉錄反應效率。
[0172] 在實時PCR中，使用熒光試劑實時監(jiān)測擴增量，并且整體地包含熱循環(huán)儀和熒光分光光度計的裝置是必要的。此類裝置是商購的。根據(jù)待使用的熒光試劑，存在幾種方法，并且，例如，可以提到嵌入劑法、TaqMan?探針法、分子信標法等。在任何情況下，cDNA通過逆轉錄反應從如上所述制備的RNA級分合成，并將上述引物組和熒光試劑（探針）（例如，通過結合雙鏈DNA而發(fā)射熒光的試劑（嵌入劑），諸如SYBR Green I、溴化乙錠等)、可用作上述探針的核酸（所述核酸在擴增區(qū)域內(nèi)與目標核酸的雜交）（其中兩個末端分別用熒光物質(zhì)（例如，F(xiàn)AM、HEX、TET、FITC等）和猝滅物質(zhì)（例如TAMRA、DABCYL等）等修飾）（ TaqMan1^探針或分子信標探針）各自添加至PCR反應系統(tǒng)。由于嵌入劑結合合成的雙鏈 DNA且在照射激發(fā)光之后發(fā)射熒光，所以可以通過測量熒光的強度監(jiān)測擴增產(chǎn)物的量，基于其可以推定初始模板cDNA的量。TaqMan?探針是能夠雜交至目標核酸的擴增區(qū)域的寡核苷酸，其兩個末端分別被熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)修飾。它在退火過程中雜交至目標核酸，但由猝滅物質(zhì)的存在禁止其發(fā)射熒光，并且當在延伸過程中被DNA聚合酶的外切酶活性分解時 (其釋放熒光物質(zhì)）發(fā)射熒光。因此，通過測量熒光強度，可以監(jiān)測擴增產(chǎn)物的量，基于其可以推定初始模板cDNA的量。分子信標探針是能夠雜交至目標核酸的擴增區(qū)域且具有發(fā)夾型二級結構的寡核苷酸，其兩個末端分別被熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)修飾。當它具有發(fā)夾結構時，它由于猝滅物質(zhì)的存在而不發(fā)射熒光，并且當熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)之間的距離在退火過程中雜交至目標核酸之后增加而發(fā)射熒光。因此，可以通過測量熒光強度監(jiān)測擴增產(chǎn)物的量，基于其可以推定初始模板cDNA的量。由于實時RT-PCR允許實時監(jiān)測PCR的擴增量，所以它不需要電泳且可以更快速地分析AM基因的表達。
[0173] 在另一個實施方案中，從試驗主體收集的樣品的AM濃度可以通過從樣品制備蛋白級分并檢測級分中含有的AIM來測量。AIM的檢測可以使用針對AM的抗體通過免疫測量方法（例如，ELISA、FIA、RIA、蛋白質(zhì)印跡等）來進行?；蛘撸珹頂?shù)臋z測也可以通過質(zhì)譜法諸如MALDI-TOFMS等來進行。
[0174] 針對AM的抗體可以根據(jù)通常用于產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體的技術且使用包含與SEQ ID NO:2中顯示的氨基酸序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的氨基酸序列或其部分氨基酸序列的蛋白作為免疫抗原來獲得。
[0175] 在將這些個別免疫測量方法應用于本發(fā)明的診斷方法時，不必設置具體條件、程序等。使本領域技術人員普通技術考慮各方法中的常規(guī)條件和程序，可以構建AIM的測量系統(tǒng)。對于這些一般技術手段的詳情，可以參考匯編、書本等。例如，Hiroshi Irie，編，"Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd.，1974 年出版）、Hiroshi Irie，編，"Sequel to the Radioimmunoassay"（Kodansha Ltd·, 1979 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，編， "Enzyme Immunoassay"（Igakushoin, 1978 年出版）、Eiji Ishikawa 等人，編，"Enzyme Immunoassay"（第 2版）（Igakushoin, I982年出版）、Eiji Ishikawa等人，編，"Enzyme Immunoassay"（第 3 版）（Igakushoin, 1987 年出版）、Methods in ENZYM0L0GY，第 70 卷(Immunochemical Techniques (部分 A))、同上，第 73 卷(Immunochemical Techniques (部分 B))、同上，第 74 卷（Immunochemical Techniques (部分 C))、同上，Vol. 84 (Immunochemical Techniques ( D: Selected Immunoassays))、同上，第 92 卷（Immunochemical Techniques (部分 E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同上，第 121 卷（Immunochemical Techniques ( I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(均由 Academic Press Publishing 出版）等。
[0176] 如上面所提到，本發(fā)明的AM的血液濃度在患有肝臟疾病的患者中降低。因此，當如上所述測量AM濃度且結果顯示與健康人相比降低的濃度時，可以判斷試驗主體已經(jīng)發(fā) 生肝臟疾病或具有發(fā)生肝臟疾病的高可能性?；蛘撸A先繪制肝臟疾病的存在與否和AIM 濃度的相關性圖，并且可以將獲得的觀察結果與相關性圖進行比較。優(yōu)選基于顯著差異的存在與否進行比較。
[0177] 本文序列表中的序列標識號顯示以下序列。
[0178] [SEQ ID N0:1] 顯不人AIM的喊基序列。
[0179] [SEQ ID NO:2] 顯示人AM的氨基酸序列。
[0180] [SEQ ID NO:3] 顯不對于F4/80的有乂引物的喊基序列。
[0181] [SEQ ID NO:4] 顯示對于F4/80的反義引物的堿基序列。
[0182] [SEQ ID NO:5] 顯不對于TNFa的有乂引物的喊基序列。
[0183] [SEQ ID NO:6] 顯示對于TNFa的反義引物的堿基序列。
[0184] [SEQ ID NO:7] 顯示對于IL-6的有義引物的堿基序列。
[0185] [SEQ ID NO:8] 顯示對于IL-6的反義引物的堿基序列。
[0186] [SEQ ID NO:9] 顯示對于IL-I β的有義引物的堿基序列。
[0187] [SEQ ID NO: 10] 顯示對于IL-I β的反義引物的堿基序列。
[0188] [SEQ ID NO: 11] 顯不對于aSMA的有乂引物的喊基序列。
[0189] [SEQ ID NO: 12] 顯示對于a SMA的反義引物的堿基序列。
[0190] [SEQ ID NO: 13] 顯示對于TGFβ 1的有義引物的堿基序列。
[0191] [SEQ ID NO: 14] 顯示對于TGFβ 1的反義引物的堿基序列。
[0192] [SEQ ID NO:15] 顯示對于AFP的有義引物的堿基序列。
[0193] [SEQ ID NO: 16] 顯示對于AFP的反義引物的堿基序列。
[0194] [SEQ ID NO: 17] 顯示對于GAPDH的有義引物的堿基序列。
[0195] [SEQ ID NO: 18] 顯示對于GAPDH的反義引物的堿基序列。實施例
[0196] 本發(fā)明下面借助以下實施例和參考例進行更具體地描述，本發(fā)明并不限于以下實施例和參考例。
[0197] 實施例1 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼喂AM敲除小鼠而促進脂肪肝通過用高脂肪膳食（HFD)飼喂AIM敲除小鼠和WT小鼠而研宄肝重量、相對于體重的肝重量、肝臟中中性脂肪的重量、和通過蘇木精-伊紅組織染色的肝脂肪的積累。作為結果，用HFD飼喂WT小鼠直到第20周沒有導致肝重量/體重的明顯差異，但用HFD飼喂AM敲除小鼠導致從第6周起相比于WT的肝重量/體重的顯著增加（圖1A)。此外，肝臟中中性脂肪重量的結果顯示，用HFD飼喂AM敲除小鼠導致從第6周起肝臟中脂肪的積累，并且已經(jīng)闡明，與WT相比，脂肪肝得到促進（圖1B)。
[0198] 實施例2 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼喂AIM敲除小鼠的肝纖維化（肝硬化）的進展用高脂肪膳食（HFD)飼喂野生型小鼠（雄性，10只小鼠，12周齡）和AIM敲除小鼠（雄性，10只小鼠，12周齡），0、6、12、20、45、55周后，用福爾馬林固定肝臟，用天狼星紅染色片，并且通過NIH-J圖像定量染色的纖維化區(qū)域（圖2A)。每只小鼠用三個不連續(xù)的片分析，并且顯示平均值（纖維化與整片的比率）（圖2B)。作為結果，纖維化面積隨著HFD飼喂時期變長而增加，但在野生型小鼠和AIM敲除小鼠之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。此外，在固定前從肝組織的部分提取RNA，并且通過定量RT-PCR分析a SMA和TGF β的mRNA表達水平，所述a SM和TGF β是參與肝纖維化的代表性基因（圖2C)。由于高脂肪膳食（HFD)飼喂后 45、55周時在AIM敲除小鼠中頻繁發(fā)生癌癥，并且正常肝臟區(qū)域的準確表達水平難以分析，所以僅僅在飼喂〇、6、12、20周的小鼠中進行RNA分析。作為結果，盡管aSM和TGF β的 mRNA表達水平隨著HFD飼喂而增加，但在它們之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。
[0199] 實施例3 :通過用高脂肪膳食（HFD)飼喂AM敲除小鼠的肝細胞癌的發(fā)病當用HFD飼喂WT小鼠52周時，觀察到脂肪肝，但大部分沒有發(fā)生肝細胞癌。然而，在所有AIM敲除小鼠中觀察到肝細胞癌，并且?guī)缀跛杏^察到的腫瘤都是高度分化型肝細胞癌（HCC)(圖3A、B、C)。通過Hoechst/AFP染色在AM敲除小鼠的肝臟中證實肝細胞癌（圖 4)，并且還證實了肝臟中AFP的促進表達。
[0200] 實施例4 :通過高脂肪膳食（HFD)飼喂的AM敲除小鼠的炎癥應答用高脂肪膳食（HFD)飼喂AIM敲除小鼠抑制了肝臟中的炎癥應答（圖5)。當用HFD 飼喂WT小鼠時，在第12-20周時觀察到肝臟中促進的炎癥應答，諸如巨噬細胞的積累，以及 TNFa、IL-6、IL_lf3的促進表達。相反，與WT相比，這些炎癥應答在AM敲除小鼠中被抑制（圖5)。
[0201] 實施例5 :通過IgM穩(wěn)定血液AM 通過蛋白質(zhì)印跡分析由于不存在B淋巴細胞而在血液中缺乏IgM的RAG (重組激活基因）KO小鼠的血清AM。與WT相比，RAG KO小鼠顯示出血清中極低水平的AM，并且沒有檢測到AM-IgM復合物（圖6A)。因此，在體外檢查AM和IgM的結合，以證實AM和IgM 的結合（圖6A)。此外，向RAG KO小鼠靜脈內(nèi)施用200 μ g IgM。作為結果，血液AM增加 (圖6B)。此外，通過ELISA方法測定小鼠和人血清的AM濃度與IgM濃度。作為結果，闡明了血液AM濃度和IgM濃度在人中也是相關的，如在小鼠中一樣（圖7)。從上述可見，表明AIM與IgM形成復合物，并且在血液中被穩(wěn)定化。
[0202] 實施例6 :AM在體外的脂肪肝抑制作用研宄AIM在體外對肝細胞的作用。將小鼠原代培養(yǎng)的肝細胞與AIM反應5小時，并且將細胞用抗-AIM抗體染色，并進行蛋白質(zhì)印跡。作為結果，證實了 AIM被細胞所攝?。▓D8)。此外，將800 μΜ油酸（OA)添加至小鼠原代培養(yǎng)的肝細胞，并且將細胞培養(yǎng)24小時以生成脂肪肝，并且在添加或不添加 AM的情況下進一步培養(yǎng)24小時。從油紅0染色和FSP27 (脂肪特異性蛋白27)的mRNA表達水平測量脂肪肝的程度。通過不添加 AIM (0A - DMEM)，油紅0染色的水平和fsp27表達水平相比于不添加 OA增加，并且證實了脂肪肝的程度（圖 9)。另一方面，通過添加 AM (0A - AM)，油紅0染色的水平和fsp27表達水平?jīng)]有增加 (圖9)，并且證實了 AIM的脂肪肝改善作用。
[0203] 實施例7 :通過SRCR結構域抑制前脂肪細胞分化為脂肪細胞通過在HEK293T細胞中表達添加 HA (血凝素）標簽的每種人SRCR結構域并且通過抗 HA抗體柱對其純化而獲得重組人SRCR結構域（SRCR1、SRCR2、SRCR3)蛋白。將3T3-L1前脂肪細胞在lμg/mL胰島素、l μM地塞米松（DEX)、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤（IBMX)存在的情況下培養(yǎng)48小時，以誘導分化為脂肪細胞，并且研宄SRCR結構域和AM的分化抑制作用。添加的AM是人全長AM (hAM)，并且以20 μ g/ml使用上述3種SRCR結構域蛋白?；跊]有添加的油紅O染色的水平作為100%定量向脂肪細胞的分化。在所有SRCR結構域中都發(fā)現(xiàn)與AIM的脂肪細胞分化抑制作用相同的脂肪細胞分化抑制作用（圖10)。
[0204] 實施例8 :測量NASH患者的血清AM濃度在3例NASH患者（2例進展為肝細胞癌）和3例非NASH患者中測量血清AM濃度。使用抗-A頂抗體通過蛋白質(zhì)印跡進行測量，并且定量信號的強度。與非NASH患者相比，NASH 患者顯示降低的血清AIM濃度（圖11)。此外，進展為肝細胞癌的NASH患者顯示更加降低的血清AM濃度（圖11)。
[0205] 參考例：AIM施用對用高脂肪膳食（HFD)飼喂的AIM敲除小鼠的作用繁殖8周齡AIM KO小鼠，同時用高脂肪膳食（HFD)飼喂。從HFD飼喂的第2 - 3周起每天施用AIM或媒介物，然后觀察脂肪在肝臟的積累。當施用后4 - 6周時用油紅0染色肝臟時，在媒介物施用組中觀察到脂肪積累，而在AM施用組沒有發(fā)現(xiàn)這一點。因此，已知AIM可用于脂肪肝的預防。此外，繁殖8周齡AM KO小鼠，同時用高脂肪膳食（HFD)飼喂。從HFD飼喂的第6 - 8周起每天施用AIM或媒介物，然后觀察脂肪在肝臟的積累。當施用后4 - 8周時用油紅0染色肝臟時，在媒介物施用組中脂肪積累相比于施用前增加，而在AM施用組脂肪積累相比于施用前降低。因此，已知AIM可用于脂肪肝的改善或治療。此夕卜，通過使用能夠激動性地（agonistically)控制AIM的功能的藥物（包括具有AIM活性的AIM的部分肽）或誘導AIM的表達藥物來替代AM也獲得了類似結果。類似地，通過在當發(fā)生肝纖維化和肝癌的時間點施用AIM也證實了 AIM對肝硬化和肝癌的預防、改善或治療作用。
[0206] 實施例9 :AIM施用對用高脂肪膳食（HFD)飼喂的AIM敲除小鼠的作用用高脂肪膳食（HFD)飼喂AIM敲除小鼠（雄性，10只小鼠，12周齡）43周，并且從第 30周至第43周每周一次通過腹膜內(nèi)注射施用重組AM (rAM) (20 mg/Kg (體重）；5只小鼠）或PBS (5只小鼠）。在HFD的第43周，將小鼠宰殺，用福爾馬林固定分離的肝臟，并且制備肝組織片。用蘇木精-伊紅染色獲得的肝組織片，并且分析癌癥的狀態(tài)和脂肪肝的狀態(tài)。對于每只小鼠以10個非連續(xù)片制備肝組織片，并且分析癌癥的存在與否、大小和數(shù)目。此外，在固定前部分去除肝（非癌部分），并且測量中性脂肪的含量。作為結果，rAIM施用組的體重顯著降低。另一方面，PBS施用組的體重增加（圖12A)。在rAM施用組中沒有發(fā) 現(xiàn)清楚的癌部分。相反，所有小鼠在PBS施用組中都具有多個癌結節(jié)（cancer nodule)。此夕卜，在組織學上發(fā)現(xiàn)多個肝癌。顯示目視照片和蘇木精-伊紅染色圖像（圖12B)。至于脂肪肝，在rAM施用組中觀察到組織學上明顯的改善。此外，與PBS施用組的中性脂肪含量相比，肝（非癌部分）的中性脂肪含量顯著降低（圖12B)。
[0207] 工業(yè)實用性本發(fā)明可以為肝臟疾病提供預防劑或治療劑，其包含AIM作為活性成分。此外，本發(fā)明的肝臟疾病模型小鼠有助于闡明肝臟疾病的發(fā)病機制，并且根據(jù)使用所述肝臟疾病模型小鼠的篩選方法，可以搜索對于肝臟疾病的預防或治療有效的物質(zhì)。此外，使用本發(fā)明的肝臟疾病模型小鼠，可以評估已知的用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果。此外，本發(fā)明可提供用于診斷肝臟疾病的方法。
[0208] 本申請基于在日本提交的專利申請?zhí)?012-103958(申請日：2012年4月27日），其內(nèi)容完全并入本文。
【權利要求】
1. 用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的堿基序列的核酸。
2. 用于肝臟疾病的預防劑或治療劑，其包含誘導AIM的表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物。
3. 根據(jù)權利要求1或2的藥劑，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
4. 篩選用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼喂 AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
5. 根據(jù)權利要求4的方法，其包括W下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用測試物質(zhì)的步驟， (2) 觀察用所述測試物質(zhì)施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的W下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌，和 (V)肝臟中的炎癥應答，和 (3) 通過與未施用所述測試物質(zhì)比較來選擇改善上述特性的測試物質(zhì)的步驟。
6. 根據(jù)權利要求4或5的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
7. 評估用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的預防或治療效果的方法，其包括使用通過用高脂肪膳食飼喂AIM表達缺陷的非人哺乳動物而獲得的動物。
8. 根據(jù)權利要求7的方法，其包括W下步驟： (1) 在高脂肪膳食飼喂條件下向AIM表達缺陷的非人哺乳動物施用用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的步驟， (2) 觀察用所述用于肝臟疾病的預防劑或治療劑施用的AIM表達缺陷的非人哺乳動物的W下特性的任何一項或多項的步驟： (i) 肝重量， (ii) 肝脂肪量， (iii) 肝纖維， (iv) 肝癌， (V)肝臟中的炎癥應答， (3) 通過將上述特性與未施用所述用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的特性比較而評估所述用于肝臟疾病的預防劑或治療劑的效果的步驟。
9. 根據(jù)權利要求7或8的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
10. 診斷肝臟疾病的方法，其包括W下步驟： (1) 測量試驗主體的樣品的AIM濃度的步驟， (2) 將所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度與健康人的樣品的AIM濃度比較的步驟， (3) 當所述試驗主體的樣品的上述AIM濃度低于所述健康人的樣品的AIM濃度時，判斷所述試驗主體具有肝臟疾病或具有發(fā)生肝臟疾病的高可能性的步驟。
11. 根據(jù)權利要求10的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
12. 用于預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的堿基序列的核酸。
13. 用于預防或治療肝臟疾病的方法，其包括向主體施用有效量的誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物。
14. 根據(jù)權利要求12或13的方法，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。 15. AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的堿基序列的核酸，其用于預防或治療肝臟疾病。
16. 根據(jù)權利要求15的AIM或其部分膚、或含有編碼所述AIM或其部分膚的堿基序列的核酸，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
17. 誘導AIM表達的藥物或穩(wěn)定AIM的藥物，其用于預防或治療肝臟疾病。
18. 根據(jù)權利要求17的藥物，其中所述肝臟疾病是脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化或肝癌。
【文檔編號】G01N33/15GK104470531SQ201380022312
【公開日】2015年3月25日申請日期:2013年4月26日優(yōu)先權日:2012年4月27日
【發(fā)明者】宮崎徹申請人:宮崎徹

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