一種oap-mip多結(jié)合位點(diǎn)親和膜金霉素傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素殘留的電化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及分子印跡技術(shù)，尤其是一種金霉素分子印跡傳感器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金霉素(Chlortetracyline，CTC)屬四環(huán)素類(lèi)光譜抗生素的一種，可由鏈霉菌培養(yǎng)液中提取出或以半合成方法生產(chǎn)，能夠有效抑制革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、立克次氏體等，抗菌范圍較廣。可廣泛地應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、禽畜疾病的預(yù)防與治療，添加于飼料中能夠增加禽畜日增重及飼料轉(zhuǎn)化率。但由于藥物濫用，殘留于動(dòng)物性食品中的金霉素對(duì)人體健康構(gòu)成了潛在的危害。大部分國(guó)家已對(duì)動(dòng)物性食品中金霉素的殘留做出了嚴(yán)格的限定，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定鹽酸金霉素在動(dòng)物性食品中最高殘留量分別為肌肉為100mg/kg，肝為300mg/kg，腎為600mg/kg ;在?；蜓蝾?lèi)中，奶為100mg/kg ;在禽類(lèi)中，蛋中為200mg/kg ;在魚(yú)或4下類(lèi)中，肉為100mg/kg。
[0003]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的檢測(cè)金霉素的常用方法包括高效液相色譜法(HPLC)、免疫分析法、毛細(xì)血管電泳法、薄層色譜法(TLC)、微生物培養(yǎng)法，其中，HPLC法雖然應(yīng)用最廣，檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)可靠，但對(duì)樣品純度要求較高，無(wú)法滿(mǎn)足大批量樣本快速篩選的需要。免疫分析法對(duì)樣品純度要求不高，但檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性差。毛細(xì)血管電泳法及TLC法分析速度快，但靈敏度低。微生物培養(yǎng)法適合大量樣品篩選，但受抗菌活性雜質(zhì)的影響不能做定量分析。
[0004]分子印跡聚合物(MIPs)是一種具有較強(qiáng)特異性分子識(shí)別能力的新型高分子仿生材料，具有制備簡(jiǎn)單，使用范圍廣、耐高溫、高壓、酸堿腐蝕且可多次回收重復(fù)加以利用的優(yōu)勢(shì)。MIPs傳統(tǒng)的制備方法主要有分子自組裝法、原位引發(fā)聚合法、表面涂覆法，近年來(lái)，迅速發(fā)展的電聚合方法已成功地應(yīng)用于制備MIPs，具有可通過(guò)控制電荷量達(dá)到納米級(jí)厚度的超薄膜、良好的剛性及重現(xiàn)性且可在水環(huán)境下進(jìn)行操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種響應(yīng)快、選擇性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]金霉素分子印跡傳感器的制備
[0008](I)玻碳電極的預(yù)處理:將玻碳電極依次用1.0,0.30,0.05 μπι粒度的a -Al2O3拋光粉研磨拋光，而后依次用1:1HNO3、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗2?3min，再將電極置于0.5mol/L H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍為-0.1?1.0V，反復(fù)掃描直至得到陰、陽(yáng)極峰對(duì)稱(chēng)且穩(wěn)定的循環(huán)伏安(CV)圖為止。達(dá)到穩(wěn)定后，峰電位差在SOmV以下，則取出電極待用。
[0009](2)分子自組裝方式制備印跡膜電極:將0.1g鄰氨基酚(OAP)溶于0.1M高氯酸中，并加入0.4M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)為弱酸性(pH 5.5)，定容至250mL濃度為3.67mM，從中移取9mL已配好3.67mM OAP的NaClO4溶液，再向其中加入ImL ImM的金霉素(CTC)混合溶解。因聚合反應(yīng)初期，氧氣進(jìn)攻自由基陽(yáng)離子，則需通隊(duì)除O 2約15min，將處理好的三電極系統(tǒng)浸入含 3.67mM 0ΑΡ、0.ImM CTC 與 0.1M NaClO4溶液(pH 5.5)中，在-0.2 ?1.2V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)伏安掃描30圈，掃描速度為50mV/s，所制備的聚合膜經(jīng)化學(xué)修飾作用沉積固定于玻碳電極表面。由于金霉素(CTC)分子中含有酚羥基、烯醇基和二甲氨基。而選用鄰氨基酚(OAP)作為功能單體，其結(jié)構(gòu)中存在的羥基也可作為潛在的配位位點(diǎn)，不僅OAP的氨基與CTC的酚羥基、烯醇基可發(fā)生分子間氫鍵相互作用，而且OAP的羥基與CTC的二甲氨基之間亦可發(fā)生作用，因此OAP與CTC之間有較多的結(jié)合位點(diǎn)，使得所制備的分子印跡聚合物對(duì)金霉素具有極高的選擇性和結(jié)合能力。而隨著掃描圈數(shù)的增加，電極表面逐漸覆蓋一層致密的非導(dǎo)電聚合膜，阻止了 OAP的進(jìn)一步氧化，使得伏安電流響應(yīng)受到抑制，由此便制得非導(dǎo)電性的印跡膜電極(CTC-MIP-0AP/GCE)。
[0010](3)模板分子的洗脫:采用上述步驟⑵制備的CTC-MIP-0AP/GCE，將其置入體積比為1: 4的甲醇/硫酸溶液中洗脫24h后，可得到具有能夠與金霉素相匹配的識(shí)別位點(diǎn)的印跡膜電極(MIP-P0AP/GCE)，即金霉素分子印跡敏感膜傳感器。目前，金霉素分子印跡敏感膜傳感器的研究尚未報(bào)道，本發(fā)明是首次采用以O(shè)AP為功能單體，CTC為模板分子，利用電聚合方式構(gòu)建了一種可間接地通過(guò)電化學(xué)技術(shù)來(lái)測(cè)定金霉素的分子印跡敏感膜傳感器。
[0011]根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金霉素分子印跡傳感器及其制備，其特征是:
[0012]印跡膜電極的電化學(xué)響應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0013]利用差分脈沖伏安法在含5mM K3[Fe (CN)6]的10mM KCl PBS中來(lái)表征印跡膜傳感器的電流響應(yīng)。將所制備的印跡敏感膜電極浸入含有一定濃度金霉素溶液中靜止吸附后進(jìn)行差分脈沖伏安檢測(cè)，每個(gè)濃度的吸附時(shí)間為20min時(shí)即達(dá)到平衡。每次試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)印跡膜電極吸附金霉素后所發(fā)生的電流響應(yīng)變化，繪制金霉素濃度與響應(yīng)電流差值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:
[0015]1、本發(fā)明基于電聚合方法，利用循環(huán)伏安法以鹽酸金霉素為模板分子、鄰氨基酚為功能單體制備了分子印跡電化學(xué)傳感器，應(yīng)用差分脈沖伏安法研究了該傳感器的響應(yīng)性能。該傳感器響應(yīng)快，成本低，選擇性良好，滿(mǎn)足鹽酸金霉素痕量分析的要求，有望在食品檢測(cè)中得到更好的應(yīng)用。
[0016]2、本發(fā)明采用的是鄰氨基酚作為功能單體，可在不同電極表面電聚合形成致密的剛性絕緣聚合膜，膜厚可控制在lO-lOOnm，且羥基作為潛在的配位位點(diǎn)，可進(jìn)一步提高傳感器的性能。故本發(fā)明中選取[Fe(CN)6]3。鐵氰化鉀具有良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可保證分析結(jié)果的可靠性。由圖2-1可知，K3[Fe (CN)6]在洗脫處理后的非印跡膜表面幾乎無(wú)響應(yīng)(曲線d)，而洗脫處理后的印跡膜峰電流(曲線b)較大，但與裸電極表面峰電流(曲線a)相比較小。
[0017]3、本發(fā)明采用差分脈沖伏安法對(duì)同一濃度的鹽酸金霉素及干擾物溶液進(jìn)行測(cè)定。選擇與鹽酸金霉素結(jié)構(gòu)相似的四環(huán)素、土霉素及結(jié)構(gòu)差異較大的氯霉素、青霉素作為干擾物進(jìn)行比較驗(yàn)證，能夠充分反映該傳感器的選擇性。如圖4可知，氯霉素和青霉素對(duì)鹽酸金霉素幾乎無(wú)干擾，土霉素和四環(huán)素產(chǎn)生了極微弱的電流響應(yīng)，說(shuō)明該傳感器對(duì)鹽酸金霉素具有特異選擇性。
[0018]4、本發(fā)明制備的傳感器滿(mǎn)足鹽酸金霉素痕量分析的要求且響應(yīng)快，成本低，選擇性良好。如圖5-1可知，不同鹽酸金霉素濃度下的差分脈沖伏安電流響應(yīng)；根據(jù)印跡膜電極吸附金霉素后所發(fā)生的電流響應(yīng)變化，繪制金霉素濃度與響應(yīng)電流差值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5-2可知，其檢測(cè)線性范圍可達(dá)至20-610nM。
[0019]5、本發(fā)明制備的傳感器在洗脫溶液中超聲清洗5min，并用二次蒸餾水淋洗后即可使電極基本能恢復(fù)到響應(yīng)前的狀態(tài)。因此使用同一支印跡膜電極對(duì)0.2 μΜ CTC平行測(cè)定5次，RSD為1.9%，顯現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性。將此印跡膜電極儲(chǔ)存于4°C冰箱中，二周后在同等環(huán)境下對(duì)0.2 μ MCTC的響應(yīng)值降至90.3%。經(jīng)四周后，響應(yīng)值降至82.7%。具有較佳的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1-1和圖1-2為本發(fā)明循環(huán)伏安電聚合曲線:其中，圖1-1為鄰氨基酚單體聚合；圖1-2為鄰氨基酚和鹽酸金霉素聚合；
[0021]圖2-1和圖2-2為本發(fā)明不同電極在K3[Fe (CN)6]及KCl溶液中的差分脈沖伏安曲線及循環(huán)伏安曲線:(a) GCE ； (b)MIP-P0AP/GCE ； (c) CTCad-MIP_POAP/GCE ； (d) POAP/GCE ；
[0022]圖3為本發(fā)明不同聚合圈數(shù)對(duì)洗脫前后峰電流差值的影響；
[0023]圖4為本發(fā)明不同被測(cè)物所產(chǎn)生的相對(duì)峰電流變化率:(a)鹽酸金霉素；(b)四環(huán)素；(C) 土霉素；(d)氯霉素；(e)青霉素；
[0024]圖5-1和圖5-2為本發(fā)明的不同鹽酸金霉素濃度下的差分脈沖伏安曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線；
【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明基于分子印跡敏感膜傳感器的痕量金霉素殘留的檢測(cè)方法，包括金霉素分子印跡敏感膜傳感器的制備及電化學(xué)響應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
[0026]1、金霉素分子印跡敏感膜傳感器的制備
[0027](I)玻碳電極的預(yù)處理:將玻碳電極依次用1.0,0.30,0.05 μπι粒度的d_Al203拋光粉研磨拋光，而后依次用1: 1HN03、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗2?3min，再將電極置于0.5mol/L H2S04溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍為-0.1?1.0V，反復(fù)掃描直至得到陰、陽(yáng)極峰對(duì)稱(chēng)且穩(wěn)定的循環(huán)伏安(CV)圖為止。達(dá)到穩(wěn)定后，峰電位差在SOmV以下，則取出電極待用。
[0028](2)分子自組裝方式制備印跡膜電極:將0.1g鄰氨基酚(OAP)溶于0.1M高氯酸中，并加入0.4M氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)為弱酸性(pH 5.5)，定容至250mL濃度為3.67mM，從中移取9mL已配好3.67mM OAP的NaClO4溶液，再向其中加入ImL ImM的金霉素(CTC)混合溶解。因聚合反應(yīng)初期，氧氣進(jìn)攻自由基陽(yáng)離子，則需通隊(duì)除O 2約15min，將處理好的三電極系統(tǒng)浸入含 3.67mM 0ΑΡ、0.ImM CTC 與 0.1M NaClO4溶液(pH