一種改良的酶聯(lián)免疫測定試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明所述的試劑盒包括：抗體預包被的微孔板、標準品、樣品抗體稀釋液、生物素標記的檢測抗體、20倍濃縮洗液、增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素、底物，以及終止液；其中，所述的樣品抗體稀釋液是含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸鹽緩沖液。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫測定方法相比，本發(fā)明采用了獨創(chuàng)的樣品抗體稀釋液以及增強的抗生物素蛋白鏈菌素。本發(fā)明能降低普通酶聯(lián)免疫檢測方法的結果背景，提高靈敏度，尤其在檢測較低濃度細胞因子樣品時，對試劑盒的性能有較大提升，而且本試劑盒品質穩(wěn)定、成本低廉，利于推廣應用。
【專利說明】一種改良的酶聯(lián)免疫測定試劑盒及其檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及一種改良的酶聯(lián)免疫 檢測試劑盒及其檢測方法。

【背景技術】
[0002] 酶聯(lián)免疫吸附檢測（Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)是利用抗 原抗體之間的特異性結合特性，對受檢樣本進行檢測。由于結合于固相載體（一般為塑料 96孔酶孔板）上的抗原或抗體仍具有免疫活性，因此通過它們之間的特異性結合，再配合 酶對于底物的催化，可產(chǎn)生可見光或者非可見光的信號，因而可顯示特定抗原或抗體是否 存在，并可利用顯色的深淺進行定量分析。根據(jù)待測樣品以及結合方式的不同，可設計出各 種不同類型的ELISA檢測方法，主要有三明治法（sandwich)、間接法（indirect)以及競爭 法（Competitive)這三種方法。
[0003] 細胞因子（cytokine )是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質的統(tǒng)稱。在 免疫應答過程中，細胞因子在免疫調節(jié)、炎癥應答、腫瘤轉移等生理和病理過程中起重要作 用。細胞因子的檢測不僅是基礎免疫研究的有較手段，同時在臨床疾病診斷、病程觀察、療 效判斷及細胞因子治療監(jiān)測方面具有重要價值。由于細胞因子在人體中含量很低，因此如 何提高檢測靈敏度顯得十分重要。
[0004] 影響ELISA檢測靈敏度的主要因素是標準曲線斜率以及信噪比。為了提高靈敏 度，可以通過增強抗原與抗體結合能力，對信號進行放大，對背景(噪音）進行降低等方法。 但由于抗體與抗原結合的能力在抗體生產(chǎn)出來后就不受控制，好的抗體往往可遇不可求， 所以提高靈敏度的主要手段是放大信號以及降低背景。
[0005] 由于對抗體進行生物素標記方法簡單，試劑價格低廉，且對抗體活性影響較小，同 時生物素可以和抗生物素蛋白鏈菌素特異性的高效結合，故目前在夾心法ELISA中，大多 采用生物素標記的抗體作為檢測抗體，再通過與抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)的酶催化底物產(chǎn) 生結果來進行信號放大。同時，在對檢測樣品進行稀釋的時候，目前一般通過在樣品稀釋液 里添加動物血清或者牛血清白蛋白（BSA)，以提高信號檢測特異性，降低背景。
[0006] 因為血清是一種潛在的傳染源，目前采用牛血清蛋白或者動物血清的方法都會存 在潛在的生物學風險。同時，動物血清獲取不易，基本上為一次性獲取，故應用成本較高。而 且，直接使用動物血清還會存在批次間差異。
[0007] 目前采用酶標記的鏈親和素一般都只連接有一個辣根過氧化物酶，雖然通過催化 底物的方式實現(xiàn)了信號放大，但在抗原濃度低、抗體-抗原-抗體-酶夾心物形成量少的情 況下，信號放大效果仍不理想。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題以及不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種改良 的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒能降低普通酶聯(lián)免疫檢測方法的結果背景，具有靈敏度高、品 質穩(wěn)定、成本低廉等優(yōu)點。
[0009] 本發(fā)明所述的一種改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括：抗體預包被的微孔板、標準 品、樣品抗體稀釋液、生物素標記的檢測抗體、20倍濃縮洗液、增強酶標記的抗生物素蛋白 鏈菌素、底物，以及終止液；其中，所述的樣品抗體稀釋液是含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷酸 鹽緩沖液。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的進一步特征，所述的增強酶標記的抗生 物素蛋白鏈菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。
[0011] 本發(fā)明的另一個方面提供了采用所述的改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測方法。
[0012] 本發(fā)明所述的改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：用含 1. 37%酪蛋白的PH7. 4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液將標準品或者樣品進行稀釋；將 稀釋后的標準品或者樣品加入到抗體預包被的酶孔板中，使標準品或樣品中的待檢測抗原 特異地被酶孔板中的抗體所捕獲并固定在固相表面；再加入含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷 酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液稀釋后的生物素標記的檢測抗體，所述抗體特異地結合所測 抗原，形成抗體-抗原-抗體夾心三文治；然后加入增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素，使 其與檢測抗體上的生物素標記結合；加入底物，進行底物顯色反應；再加入終止液終止反 應；測定待檢測的抗原的濃度。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法的進一步特征，所述的增強酶標記的抗生物素蛋白鏈 菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。
[0014] 與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫測定方法相比，本發(fā)明采用了獨創(chuàng)的樣品抗體稀釋液以及增強 的抗生物素蛋白鏈菌素。本發(fā)明能降低普通酶聯(lián)免疫檢測方法的結果背景，提高靈敏度，尤 其在檢測較低濃度細胞因子樣品時，對試劑盒的性能有較大提升，而且本試劑盒品質穩(wěn)定、 成本低廉，利于推廣應用。

【具體實施方式】
[0015] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0016] 實施例1 :改良后的酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制備 一、抗體預包被的微孔板的制備 1.包被 Na2C03 1. 6g NaHC03 2.9g 去離子水 1000ml 調整PH至9. 0,加入適量包被抗體，混勻后按每孔100微升的量加入到微孔板各孔中， 于4° C環(huán)境下放置過夜，然后甩去孔內(nèi)液體，排干。
[0017] 2.洗滌 NaHP04 · 12H20 3. 72g KH2P04 0 . 43g NaCl 6.8g Tween-20 0. 5ml 去離子水 1000ml 調整PH至7. 2,按每孔300微升的量加入微孔板各孔中，震蕩10秒后甩凈，重復5次。
[0018] 3.封閉 牛血清白蛋白 l〇g NaHP04 · 12H20 3. 72g KH2P04 0 . 43g NaCl 6.8g 去離子水 1000ml 按每孔125微升的量加入到微孔板中，于室溫中封閉1. 5小時。
[0019] 4.干燥 封閉好的微孔板甩去孔內(nèi)液體，拍干，在真空干燥柜中干燥5小時，然后放入有干燥劑 的鋁塑袋內(nèi)封口，保存在-20° C環(huán)境中。
[0020] 二、樣品抗體稀釋液制備： 酪蛋白 13. 7g NaHP04 · 12H20 3. 72g KH2P04 0 . 43g NaCl 6.8g 去離子水 1000ml 三、生物素標記的檢測抗體的制備 在標記前，將待標記抗體用1升的磷酸鹽緩沖液（PBS)透析三次，每次兩小時。
[0021] 將生物素標記試劑溶解在100微升磷酸鹽緩沖液（PBS)中，按照每毫克抗體36微 升生物素標記試劑將兩者混合，常溫渦旋孵育30分鐘。
[0022] 將標記好的抗體用1升的磷酸鹽緩沖液（PBS)透析三次，每次兩小時。
[0023] 標記好的抗體保存在4攝氏度。
[0024] 四、20倍濃縮洗液的制備 NaHP04 · 12H20 74. 4g KH2P04 8 . 6g NaCl 136g Tween-20 10ml 去離子水 1000ml 五、 增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素的制備 反應在4攝氏度進行，先在辣根過氧化物酶中加入高碘酸鈉（NaI04)，然后直接加鏈霉 親和素溶液混勻，再用碳酸鹽緩沖液（pH 9. 0)透析后，用KBH4終止反應：加飽和硫酸銨沉 淀，離心后棄上清液，再用PBS復溶沉淀即得增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素結合物 六、 底物的制備 Na2HP04 · 12H20 18g 朽1檬酸· H20 6g 3%雙氧水 0.4ml EDTA 150mg 二甲基亞諷 5ml 3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺 250mg 七、終止液的制備 濃 H2S04 1 00ml 雙蒸水 800ml 上述試劑組合后制備得到本發(fā)明所述的改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0025] 實施例2 :改良后的酶聯(lián)免疫測定試劑盒的檢測實驗 本實施例采用實施例2所制備的改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進行檢測方法，包括以下 步驟： 用含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液將標準品或者樣品進行 稀釋； 將稀釋后的標準品或者樣品加入到抗體預包被的酶孔板中，使標準品或樣品中的待檢 測抗原特異地被酶孔板中的抗體所捕獲并固定在固相表面； 再加入含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液稀釋后的生物素標 記的檢測抗體，所述抗體特異地結合所測抗原，形成抗體-抗原-抗體夾心三文治； 然后加入增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素，使其與檢測抗體上的生物素標記結合； 加入底物，進行底物顯色反應； 再加入終止液終止反應； 測定待檢測的抗原的濃度。
[0026] 本試劑盒的一個示例性具體操作步驟如下： 1.用樣品抗體稀釋液對標準品進行梯度稀釋，使其濃度分別為60納克/毫升、20納 克/暈升、6. 667納克/暈升、2. 222納克/暈升、0. 741納克/暈升、0. 247納克/暈升，并 以樣品抗體稀釋液作為空白對照。
[0027] 2.在預包被好的微孔板中，每孔加入100微升稀釋好的標準品或者樣品，每個標 準品或樣品做一個重復。置于室溫中反應2小時。
[0028] 3.將微孔板放入自動洗板儀內(nèi)，米用1倍洗漆液（20倍濃縮洗液1暈升+19暈升 去離子水即為工作洗滌液）進行洗滌。
[0029] 4.每孔加入用樣品抗體稀釋液稀釋好的生物素標記檢測抗體100微升，置于室 溫中反應1小時。
[0030] 5.重復步驟3。每孔加入100微升用樣品抗體稀釋液稀釋好的增強酶標記的抗生 物素蛋白鏈菌素，置于室溫中反應45分鐘。
[0031] 6.重復步驟3。每孔加入100微升底物，置于室溫黑暗處反應30分鐘。
[0032] 7.每孔加入50微升終止液，并用酶標儀在450納米波長讀數(shù)。
[0033] 實施例3 :改良的樣品抗體稀釋液與普通的牛血清蛋白稀釋液比較，普通酶標記 抗生物素蛋白鏈菌素與增強酶標記抗生物素蛋白鏈菌素比較 1.分別用改良的樣品抗體稀釋液及普通的牛血清蛋白稀釋液對標準品進行梯度稀釋， 使其濃度分別為60納克/暈升、20納克/暈升、6. 667納克/暈升、2. 222納克/暈升、0. 741 納克/毫升、〇. 247納克/毫升，對樣品1及樣品2按一定倍數(shù)稀釋，并以樣品抗體稀釋液/ 牛血清蛋白緩沖液用作空白對照。
[0034] 2.在預包被好的微孔板中，其中兩塊板中加入100微升用改良的樣品抗體稀釋液 稀釋好的標準品或者樣品，每個標準品或樣品兩個重復孔；另兩塊微孔板加入用牛血清蛋 白緩沖液稀釋好的標準品或樣品每個標準品或樣品兩個重復孔。置于室溫中反應2小時。
[0035] 3.將微孔板放入自動洗板儀內(nèi)，米用1倍洗漆液（20倍濃縮洗液1暈升+19暈升 去離子水即為工作洗滌液）進行洗滌。
[0036] 4.對應不同的酶孔板，每孔加入用樣品抗體稀釋液/牛血清蛋白緩沖液稀釋好的 生物素標記檢測抗體1〇〇微升，置于室溫中反應1小時。
[0037] 6.重復步驟3。
[0038] 7.對應不同的酶孔板，每孔加入100微升用樣品抗體稀釋液/牛血清蛋白緩沖液 稀釋好的普通酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素/增強酶標記抗生物素蛋白鏈菌素，置于室溫 中反應45分鐘。
[0039] 8.重復步驟3。
[0040] 9.每孔加入100微升底物，置于室溫黑暗處反應30分鐘。
[0041] 10.每孔加入50微升終止液，并用酶標儀在450納米波長讀數(shù)。
[0042] 對讀數(shù)結果進行分析，得到表1、表2、表3及表4的結果。
[0043] 表1采用改良的樣品抗體稀釋液及增強酶標記抗生物素蛋白鏈菌素的結果

【權利要求】
1. 一種改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：抗體預包被的 微孔板、標準品、樣品抗體稀釋液、生物素標記的檢測抗體、20倍濃縮洗液、增強酶標記的抗 生物素蛋白鏈菌素、底物，以及終止液；其中，所述的樣品抗體稀釋液是含1. 37%酪蛋白的 pH7. 4的磷酸鹽緩沖液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述的增強酶標記的抗 生物素蛋白鏈菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。
3. 采用根據(jù)權利要求1所述的改良的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于， 包括以下步驟： 用含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液將標準品或者樣品進行 稀釋； 將稀釋后的標準品或者樣品加入到抗體預包被的酶孔板中，使標準品或樣品中的待檢 測抗原特異地被酶孔板中的抗體所捕獲并固定在固相表面； 再加入含1. 37%酪蛋白的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液的樣品抗體稀釋液稀釋后的生物素標 記的檢測抗體，所述抗體特異地結合所測抗原，形成抗體-抗原-抗體夾心三文治； 然后加入增強酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素，使其與檢測抗體上的生物素標記結合； 加入底物，進行底物顯色反應； 再加入終止液終止反應； 測定待檢測的抗原的濃度。
4. 根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：所述的增強酶標記的抗生物素蛋白 鏈菌素是聚集多個辣根過氧化酶標記的抗生物素蛋白鏈菌素。
【文檔編號】G01N33/68GK104101711SQ201310117062
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月7日 優(yōu)先權日:2013年4月7日
【發(fā)明者】黃若磐 申請人:廣州瑞博奧生物科技有限公司