專利名稱：一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物傳感、納米功能材料及食品安全分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl和黃曲霉毒素G2 (簡稱4種黃曲霉毒素)，普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，可通過多種途徑污染食品和飼料，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全。黃曲霉毒素是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，長期攝入黃曲霉毒素會(huì)誘發(fā)肝癌，它誘發(fā)肝癌的能力比二甲基亞硝胺大75倍，是目前公認(rèn)的致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。在發(fā)展中國家食用被黃曲霉毒素污染的食物與癌癥的發(fā)病率呈正相關(guān)性，亞洲和非洲的疾病研究機(jī)構(gòu)的研究工作表明，食物中黃曲霉毒素與肝細(xì)胞癌變呈正相關(guān)性，長時(shí)間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物是導(dǎo)致肝癌、胃癌和腸癌等疾病的主要原因。國家衛(wèi)生部門禁止企業(yè)使用被黃曲霉毒素嚴(yán)重污染的糧食進(jìn)行食品加工生產(chǎn)，并制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)督企業(yè)執(zhí)行，但對于含黃曲霉毒素濃度較低的糧食和食品無法進(jìn)行控制。因此開發(fā)出一種能同時(shí)快速靈敏檢測食品中多 種微量黃曲霉毒素的多通道印刷電極具有十分重要的意義。石墨烯，是已知材料中最薄的一種，且非常牢固堅(jiān)硬；作為單質(zhì)，它在室溫下傳遞電子的速度比已知導(dǎo)體都快，它具有超薄、強(qiáng)韌、穩(wěn)定、導(dǎo)電性好等諸多現(xiàn)有材料無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。氮原子摻雜石墨烯，可改變材料性能。拉曼光譜表明，氮摻雜改變了石墨烯薄片的電子特性，但不會(huì)干擾它的基本結(jié)構(gòu)。氮原子放在平面石墨烯片內(nèi)，每個(gè)氮原子鍵合三個(gè)相鄰的碳，即每個(gè)氮原子取代薄片上的一個(gè)碳，可以制得高品質(zhì)石墨烯，將其用于傳感器的制備，使傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性得到顯著提高，改善了傳感器的性能。殼聚糖在傳感器的自組裝過程中起到了非常好的作用，羥丙基殼聚糖是由殼聚糖改性而成的一種水溶性良好的殼聚糖衍生物，它既能溶于水又能溶于乙醇等有機(jī)溶劑，具有良好的乳化性、抗菌性、吸濕保濕性和表面活性，其吸濕保濕能力與透明質(zhì)酸相當(dāng)，乳化性和泡沫性與非離子表面活性劑TweeneO相當(dāng)，其在傳感器中的效果優(yōu)于殼聚糖。目前測定黃曲霉毒素的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法、放射免疫測定法。存在以下不足:
(1)檢測過程煩瑣、耗時(shí)長，勞動(dòng)強(qiáng)度大；
(2)儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)快速分析；
(3 )靈敏度較差，且不能實(shí)現(xiàn)多種黃曲霉毒素的同時(shí)檢測。針對上述不足，本發(fā)明提供一種操作方便、便攜、成本低、快速靈敏檢測食品中多種黃曲霉毒素的印刷電極電化學(xué)免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。1.一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)在一個(gè)涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片表面上，依次以銀漿印刷I個(gè)參比電極，以導(dǎo)電碳漿印刷5個(gè)工作電極、I個(gè)對電極、7個(gè)電極引出線及引出線端部，并在所有電極及引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形電解池凹槽⑦，制得五通道絲網(wǎng)印刷電極；
(2)在(I)所述的五通道絲網(wǎng)印刷電極的5個(gè)工作電極上，滴涂5 IOPL銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖的導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液；所述導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液，是將銀納米粒子與氮摻雜石墨烯按照一定的質(zhì)量比進(jìn)行混合超聲分散30min，然后加上質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的羥丙基殼聚糖溶液超聲混合30min，制成質(zhì)量比為(I 5): (8 12): (Γ10)的銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液；所述羥丙基殼聚糖溶液，將I g羥丙基殼聚糖加入到99 mL水中攪拌2 h，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的羥丙基殼聚糖溶液。

(3)在步驟(2)制得的5個(gè)工作電極上分別滴加5 ΙΟμ 的黃曲霉毒素BI抗體、黃曲霉毒素Β2抗體、黃曲霉毒素Gl抗體、黃曲霉毒素G2抗體及總黃曲霉毒素抗體，再以ΙΟμ ，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，制得一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器，置于4 °C下保存?zhèn)溆?，所述抗體濃度均5 10 Pg/mL。2.一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟:
(1)將黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl和黃曲霉毒素G2(簡稱4種黃曲霉毒素)及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到上述方法制備的一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器對應(yīng)的工作電極表面上，孵化2 3 h，然后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極；
(2)將參比電極、工作電極和對電極連接在多通道電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入5mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過循環(huán)伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)；
(3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；
(4)用待測樣品代替4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果對照所繪制的4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線，計(jì)算出樣品中4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。所述一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素的方法實(shí)現(xiàn)了 4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素共5種組分的同時(shí)測定。所述一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器，所用原料均可以在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢如下:
(I)采用的印刷電極制備簡單、成本低、便于攜帶、易于微型化和集成化；(2)采用印刷電極制成傳感器，檢測方法簡單，靈敏度高、重現(xiàn)性好，應(yīng)用范圍廣；
(3)采用印刷電極制成傳感器，與多通道電化學(xué)工作站的檢測電路相連，能夠?qū)崿F(xiàn)五種組分的同時(shí)檢測，更加方便快捷，且同步性好，能減小測量誤差；
(4)采用印刷電極制成傳感器，采用免疫分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了不同種類黃曲霉毒素的特異性識(shí)別。


圖1是本發(fā)明的印刷電極結(jié)構(gòu)示意圖。圖1中，①基片，②參比電極，③工作電極，
④對電極，⑤電極引出線，⑥引出線端部，⑦圓形凹槽。圖2是圓形凹槽內(nèi)電極工作區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合附圖和實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明所述的一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，結(jié)合圖1，步驟如下。在一個(gè)涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片①表面上，依次以銀漿印刷I個(gè)參比電極②，以導(dǎo)電碳漿印刷5個(gè)工作電極③、I個(gè)對電極④、7個(gè)電極引出線⑤及引出線端部⑥，并在所有電極及引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形電解池凹槽⑦，制得一種五通道絲網(wǎng)印刷電極。實(shí)施例2本發(fā)明所述的一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，結(jié)合圖1，步驟如下。(I)在實(shí)施例1制備的多通道印刷電極的5個(gè)工作電極上，滴涂5μ 銀納米粒子-氮摻雜石墨烯-羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料；所述導(dǎo)電復(fù)合納米材料中銀納米粒子和氮摻雜石墨烯的質(zhì)量比為1: 8，超聲混合30min，加上羥丙基殼聚糖溶液超聲分散30min，制成質(zhì)量比為1: 8:1的銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一輕丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液；
(2)在步驟(I)制得的5個(gè)工作電極上分別滴加5μ 濃度為10 Pg/mL的4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的抗體，再以IOPL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，制得一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器，置于4 °C下保存?zhèn)溆谩?shí)施例3改變滴涂銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液的量為ΙΟμ ，質(zhì)量比為2: 10: 5，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例4改變滴涂銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液的量為6PL，質(zhì)量比為5: 12: 4，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例5改變滴涂銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液的量為8PL，質(zhì)量比為5: 9: 10，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例6改變滴涂銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液的量為7PL，質(zhì)量比為3: 10: 6，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例7改變 滴加4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的抗體的量為ΙΟμ ，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例8改變滴加4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的抗體的濃度為5Pg/mL，其他與實(shí)施例2相同。實(shí)施例9牛奶樣品中4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量的檢測
本傳感器使用時(shí)，將引出線端部與多通道電化學(xué)工作站檢測電路相連接，采用循環(huán)伏安分析法進(jìn)行檢測。(I)配制4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別滴涂到實(shí)施例2^8所制備的制得一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器所對應(yīng)抗體的5個(gè)工作電極表面，于室溫下孵化2 3 h，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈。(2)將滴涂標(biāo)準(zhǔn)溶液后晾干的傳感器與多通道電化學(xué)工作站相連接，向本傳感器的圓形凹槽內(nèi)滴加鐵氰化鉀溶液，采用循環(huán)伏安分析法，檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)；
(3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線，線性范圍均為0.01(T5(^g/kg，對黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl、黃曲霉毒素G2及總黃曲霉毒素的檢測限低于0.0032Pg/kg ；
(4)取新鮮牛奶樣品，離心后取上清液，分別滴涂到實(shí)施例21所制備的傳感器的工作電極表面，于室溫下孵化2 h，用pH7.4磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈。(5)按照步驟(2)所述的檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)各工作電極的響應(yīng)信號(hào)與上述得到的工作曲線，即可得出牛奶樣品中4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。測定結(jié)果表明，牛奶中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以及總黃曲霉毒素均未檢出，屬于合格產(chǎn)品；對牛奶樣品做標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，5次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.0%，加標(biāo)回收 率在93.6% 106%之間，該方法準(zhǔn)確可靠。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在一個(gè)涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片(①)表面上，依次以銀漿印刷I個(gè)參比電極(②)，以導(dǎo)電碳漿印刷5個(gè)工作電極(③)、1個(gè)對電極(④)、7個(gè)電極引出線(⑤)及引出線端部(⑥)，并在所有電極及電極引出線端部以外的基片上，以絕緣漿印刷一層絕緣層，并在電極區(qū)域形成一個(gè)圓形電解池凹槽(⑦)，制得五通道絲網(wǎng)印刷電極； (2)在(I)所述的五通道絲網(wǎng)印刷電極的5個(gè)工作電極上，滴涂5 IOPL銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一輕丙基殼聚糖構(gòu)成的導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液；所述導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液，其特征是，將銀納米粒子和氮摻雜石墨烯一定的質(zhì)量比進(jìn)行混合超聲分散30min，然后加上質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的羥丙基殼聚糖溶液超聲混合30min，制成質(zhì)量比為(I 5): (8 12): (Γ 10)的銀納米粒子一氮摻雜石墨烯一輕丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料溶液； (3)在步驟(2)制得的5個(gè)工作電極上分別滴加5 IOPL的黃曲霉毒素BI抗體、黃曲霉毒素Β2抗體、黃曲霉毒素Gl抗體、黃曲霉毒素G2抗體及總黃曲霉毒素抗體，再以ΙΟμ 、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性活性位點(diǎn)，制得一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器，置于4 °C下保存?zhèn)溆茫隹贵w濃度均5 10 Pg/mL。
2.一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素的方法，該方法包括以下步驟: (1)將黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到權(quán)利要求1所述的方法制備的一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素傳感器對應(yīng)的工作電極表面上，孵化2 3 h，然后用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，得到修飾好的工作電極； (2)將參比電極、步驟(I)所述修飾好的工作電極和對電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液，通過循環(huán)伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)； (3)根據(jù)所得電流響應(yīng)與黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素Gl和黃曲霉毒素G2 (簡稱4種黃曲霉毒素)及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)用待測樣品代替4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲 線的繪制方法進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果對照所繪制的4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素工作曲線，計(jì)算出樣品中4種黃曲霉毒素及總黃曲霉毒素的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素印刷電極電化學(xué)免疫傳感器的制備方法和應(yīng)用，屬于生物傳感、納米功能材料及食品安全分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是在涂覆一層聚酯薄膜的矩形基片表面上印刷7個(gè)電極，其中包括5個(gè)碳工作電極，1個(gè)銀參比電極和1個(gè)對電極，7個(gè)電極引出線及引出線端部。其特征在于，用銀納米粒子—氮摻雜石墨烯—羥丙基殼聚糖導(dǎo)電復(fù)合納米材料將黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2以及總黃曲霉毒素的抗體固定到各工作電極表面，滴涂檢測液后與多通道電化學(xué)工作站檢測電路相連，從而實(shí)現(xiàn)了五種黃曲霉毒素的同時(shí)檢測。本發(fā)明制備簡單、加工方便、成本低、便于攜帶。該檢測方法簡單、快速、靈敏度高、特異性好。
文檔編號(hào)G01N27/48GK103196984SQ201310079759
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者杜斌, 魏琴, 黎榮霞, 于海琴, 張勇, 吳丹, 李賀, 馬洪敏 申請人:濟(jì)南大學(xué)