專利名稱：一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡。
背景技術(shù)：
中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase associatedlipocalin，NGAL),又稱人脂質(zhì)運載蛋白2 (Iipocalin 2，LCN2)或噬鐵蛋白(siderocalin),是人脂質(zhì)運載蛋白家族中的ー個新成員。NGAL是Kjeldsen等在1993年研究中性粒細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)的ー種特殊顆粒組份，與明膠酶B即基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrixmetalloproteinase-9,MMP_9)密切相關(guān)。NGAL是一種小分子蛋白，其可表達(dá)于中性粒細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞，如腎小管上皮細(xì)胞中。在多種原因引起的腎損傷中，NGAL可顯著升高，釋放于尿液和血液中。NGAL在損傷2小時內(nèi)即可迅速升高，因而，NGAL可作為ー種高靈敏度的急性腎損傷早期診斷標(biāo)志物。在正常生理情況下，NGAL含量較低，能刺激腎祖細(xì)胞向腎小管上皮細(xì)胞分化，以保障腎臟正常的生長發(fā)育。當(dāng)腎缺血或毒素急性腎小管損傷時，在開始的兩個小時內(nèi)，受損的腎小管上皮細(xì)胞能高表達(dá)NGAL，從而誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)中浸潤的中性粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，以保護(hù)腎組織免受攻擊；另一方面高水平的NGAL能促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生修復(fù)，使腎臟功能得以恢復(fù)。據(jù)丹麥Bioporto公司研究，健康志愿者EDTA血漿中NGAL濃度分布在37 - 106ng/mL,平均值為63ng/mL,尿液中濃度分布在0. 7-9. 8ng/mL,平均值為5. 3ng/mL。而I⑶病房中急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)患者NGAL濃度在血清中為66_922ng/mL,尿液中為 110-40，000ng/mL。2005年，丹麥BioPorto公司首先推出ELISA商品檢測試劑盒，可用于血清(漿)、尿液中NGAL檢測。此外，美國R& D Systems公司也研發(fā)出ELSIA檢測試劑盒，美國博適公司Triage分析儀也可對EDTA抗凝血漿或全血(雙抗體夾心免疫熒光層析法)中的NGAL進(jìn)行檢測。目前已有適用于全自動免疫分析儀的分析系統(tǒng)面世，如美國雅培公司的Architecti2000SR/i 1000SR全自動免疫分析儀可測定尿液NGAL (化學(xué)發(fā)光免疫法)。但其中的ELISA存在著操作繁瑣，檢測耗時長等缺點；全自動分析儀價格昂貴，不適合檢測少量標(biāo)本使用。相比之下，床旁檢測(point care of testing,P0CT)可方便快速地提供可靠檢驗結(jié)果，有助于臨床醫(yī)師更早制訂治療策略，并節(jié)省治療費用。POCT中的側(cè)向流免疫層析檢測法具有檢測迅速、操作簡便、準(zhǔn)確和成本低等特點，適合用于檢測NGAL。臨床上，急性腎損傷患者在尿常規(guī)檢查中，尿液外觀多呈渾濁，尿色深，根據(jù)病情不同，尿蛋白定性可為陰性 ++++ ;在尿沉渣檢查中，可發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞管型、顆粒管型、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和晶體存在。因此，在對急性腎損傷疑似患者進(jìn)行尿液檢測時，往往需要將尿液離心后再進(jìn)行分析物檢測。如不對尿液處理直接進(jìn)行檢測，則尿液中的大分子物質(zhì)一方面可能會造成檢測卡上膜或墊的堵塞，另ー方面可能部分會連同NGAL 一起展層至檢測區(qū)，使得檢測區(qū)背景顔色較深而干擾結(jié)果判斷。尿液離心這一步驟視情況不同常需要3-5分鐘或更長時間，且較繁瑣，不利于實現(xiàn)NGAL尿液檢測卡對NGAL的快速檢測。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于側(cè)向流免疫層析法，操作簡單，尿液無需離心即可直接檢測的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其具有快速、抗干擾能力強(qiáng)、準(zhǔn)確等特點。本實用新型通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)ー種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿 液檢測卡，由上卡殼、試紙條和下卡殼組成，所述上卡殼上設(shè)置有加樣孔和檢測窗，所述試紙條由在支撐物上依次相互搭接的樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)、吸水區(qū)組成，所述下卡殼中間為放置試紙條的卡槽，其特征在干所述加樣孔底部固定有尿液過濾裝置。所述尿液過濾裝置與樣品區(qū)不接觸，由孔徑從上到下逐漸減小的不對稱多孔材料制成。一種優(yōu)選的技術(shù)方案，其特征在于所述尿液過濾裝置由聚酯膜或聚砜膜構(gòu)成，優(yōu)選聚砜膜。所述上下卡殼材料可由不吸水的塑料制成，包括人工合成或自然界有機(jī)材料，如聚苯こ烯、聚こ烯、聚氯こ烯、聚酯或纖維素及其衍生物等。 所述支撐物可由PVC板或PS板構(gòu)成。所述樣品區(qū)可由選自纖維素膜、玻璃纖維膜或無紡布中的ー種或多種材料構(gòu)成。所述結(jié)合區(qū)可由聚酯纖維或玻璃纖維膜構(gòu)成，其上涂覆有標(biāo)記物標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體，所述標(biāo)記物為金屬膠體顆粒、熒光顆粒、磁性顆?；蛴猩槟z顆粒。所述檢測區(qū)可由硝酸纖維膜、PVDF膜或硝化纖維膜構(gòu)成，在所述檢測區(qū)上設(shè)有檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，所述檢測線包被有中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體或多克隆抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體。所述吸水區(qū)可由吸水濾紙或纖維素膜構(gòu)成。根據(jù)上述方案實現(xiàn)的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡有益效果主要體現(xiàn)在本實用新型可在不處理尿液的情況下，直接對尿液NGAL進(jìn)行檢測而不受干擾。尿液過濾裝置由孔徑從上到下逐漸減小的不對稱多孔材料制成，這種結(jié)構(gòu)可使樣本在尿液過濾裝置的垂直方向上易于擴(kuò)散，起到快速初過濾作用，使尿液中的待檢分子先于大分子物質(zhì)通過過濾裝置，在充分?jǐn)U散的情況下，達(dá)到截留大分子物質(zhì)，分離樣本的目的。因此，在尿液樣本到達(dá)檢測試紙條前，就可將NGAL等小分子尿液成份與其他大分子干擾物相分離，從而可快速、準(zhǔn)確檢測尿液中NGAL的濃度。

圖1為本實用新型實施例的側(cè)面剖視圖；圖2為本實用新型實施例的正面示意圖；圖3為本實用新型實施例的顯色結(jié)果示意圖；圖中1:上卡殼；2 :下卡殼；3 :卡槽；4 :加樣孔；5 :檢測窗；6 :尿液過濾裝置；7 樣品區(qū)；8 :檢測區(qū)；9 :支撐物；10 :結(jié)合區(qū)；11 :吸水區(qū)。
具體實施方式下面將結(jié)合本實用新型實施例的附圖，對本實用新型進(jìn)行進(jìn)一步描述。實施例1 一種膠體金免疫層析NGAL尿液檢測卡膠體金免疫層析NGAL尿液檢測卡由上下扣合的上卡殼(I)與下卡殼(2)以及置于下卡殼(2)中間卡槽(3)處的試紙條組成。上卡殼(I)上設(shè)置有加樣孔(4)和檢測窗(5)，加樣孔(4)呈立體漏斗狀，孔徑從上至下逐漸減小，在加樣孔漏斗底部固定有尿液過濾裝置(6)，尿液過濾裝置(6)與樣品區(qū)
(7)不接觸，由孔徑從上到下逐漸減小的不對稱聚砜膜組成。加樣孔(4)對應(yīng)試紙條上的樣品區(qū)(7)，試紙條上的檢測區(qū)(8)正對應(yīng)上卡殼的檢測窗(5)，使檢測區(qū)上的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)顯露。試紙條置于下卡殼(2)的卡槽(3)中，卡槽(3)的尺寸與試紙條大小相契合，試紙條可置于卡槽(3)中并固定。試紙條由在支撐物(9)上依次相互搭接約1. 5mm的樣品區(qū)
(7)、結(jié)合區(qū)(10)、檢測區(qū)(8)、吸水區(qū)(11)組成。樣品區(qū)(7)的一端壓接在結(jié)合區(qū)(10)的一端上，結(jié)合區(qū)(10)的另一端壓接在檢測區(qū)(8)的一端上，吸水區(qū)(11)的一端壓接在檢測區(qū)(8)的另一端上。其中，支撐物(9)由PVC板構(gòu)成，樣品區(qū)(7)由玻璃纖維膜構(gòu)成，結(jié)合區(qū)(10)由聚酷纖維構(gòu)成，檢測區(qū)(8)由硝酸纖維膜構(gòu)成，吸水區(qū)(11)由吸水濾紙構(gòu)成。所述的結(jié)合區(qū)
(10)涂覆有膠體金標(biāo)記的NGAL單克隆抗體，檢測區(qū)(8)上設(shè)有彼此分離的T線和C線，其中T線靠近結(jié)合區(qū)，C線靠近吸水區(qū)，所述T線由NGAL多克隆抗體包被，C線由羊抗鼠IgG多克隆抗體包被。將待檢尿液120 Ul直接加入檢測卡加樣孔處，尿液通過加樣孔處的尿液過濾裝置時，大分子物質(zhì)被截留，小分子成份通過過濾裝置至樣品區(qū)，并經(jīng)虹吸作用沿樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)向吸水區(qū)方向移動，15分鐘內(nèi)讀取檢測結(jié)果。定性檢測陽性T線和C線處各出現(xiàn)一條紫紅色條帶；陰性僅在C線處出現(xiàn)一條紫紅色條帶；無效無論樣本中含或不含NGAL，膠體金墊處的膠體金標(biāo)記的NGAL單克隆抗體都會上行至檢測區(qū)與C線處的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合，在C線處出現(xiàn)一條紫紅色條帯，如不出現(xiàn)，則結(jié)果無效，需重新檢測。定量檢測將檢測卡置于膠體金定量檢測儀中，儀器通過對檢測區(qū)進(jìn)行掃描，收集T線、C線信號強(qiáng)度，最終轉(zhuǎn)換、計算出樣本中NGAL的濃度，實現(xiàn)定量檢測。實施例2 —種熒光免疫層析NGAL尿液檢測卡熒光免疫層析NGAL尿液檢測卡的結(jié)構(gòu)可參考實施例1中的膠體金免疫層析NGAL尿液檢測卡，兩種尿液檢測卡的主要不同之處在于膠體金檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)涂覆有膠體金標(biāo)記的NGAL單克隆抗體，而熒光檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)所采用的標(biāo)記物為熒光顆粒。將待檢尿液120 U I直接加入檢測卡加樣孔處，尿液通過加樣孔處的尿液過濾裝置時，大分子物質(zhì)被截留，小分子成份通過過濾裝置至樣品區(qū)，并經(jīng)虹吸作用沿樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)向吸水區(qū)方向移動，將檢測卡置于熒光分析儀中，儀器通過對檢測區(qū)進(jìn)行掃描，收集T線、C線熒光信號強(qiáng)度，最終轉(zhuǎn)換、計算出樣本中NGAL的濃度，實現(xiàn)定量檢測。實施例3 —種磁珠免疫層析NGAL尿液檢測卡磁珠免疫層析NGAL尿液檢測卡的結(jié)構(gòu)可參考實施例1中的膠體金免疫層析NGAL尿液檢測卡，兩種尿液檢測卡的主要不同之處在于膠體金檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)涂覆有膠體金標(biāo)記的NGAL單克隆抗體，而磁珠免疫層析檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)所采用的標(biāo)記物為磁性納米顆粒。將待檢尿液120 U I直接加入檢測卡加樣孔處，尿液通過加樣孔處的尿液過濾裝置時，大分子物質(zhì)被截留，小分子成份通過過濾裝置至樣品區(qū)，并經(jīng)虹吸作用沿樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)向吸水區(qū)方向移動，15分鐘內(nèi)讀取檢測結(jié)果。定性檢測陽性T線和C線處各出現(xiàn)一條顯色條帶；陰性僅在C線處出現(xiàn)一條顯色條帶；無效無論樣本中含或不含NGAL，結(jié)合區(qū)處的磁珠標(biāo)記的NGAL單克隆抗體都會上行至檢測區(qū)與C線處的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合，在C線處出現(xiàn)一條顯色條帯，如不出現(xiàn)，則結(jié)果無效，需重新檢測。定量檢測將檢測卡置于磁性分析儀中，儀器通過對檢測區(qū)進(jìn)行掃描，收集T線、C線磁信號強(qiáng)度，最終轉(zhuǎn)換、計算出樣本中NGAL的濃度，實現(xiàn)定量檢測。實施例4 一種乳膠免疫層析NGAL尿液檢測卡乳膠免疫層析NGAL尿液檢測卡的結(jié)構(gòu)可參考實施例1中的膠體金免疫層析NGAL尿液檢測卡，兩種尿液檢測卡的主要不同之處在于膠體金檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)涂覆有膠體金標(biāo)記的NGAL單克隆抗體，而乳膠免疫層析檢測卡的結(jié)合區(qū)(10)所采用的標(biāo)記物為有色乳膠顆粒。將待檢尿液120 U I直接加入檢測卡加樣孔處，尿液通過加樣孔處的尿液過濾裝置時，大分子物質(zhì)被截留，小分子成份通過過濾裝置至樣品區(qū)，并經(jīng)虹吸作用沿樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)向吸水區(qū)方向移動，15分鐘內(nèi)讀取檢測結(jié)果。定性檢測陽性T線和C線處各出現(xiàn)一條顯色條帶；陰性僅在C線處出現(xiàn)一條顯色條帶；無效無論樣本中含或不含NGAL，結(jié)合區(qū)處的乳膠標(biāo)記的NGAL單克隆抗體都會上行至檢測區(qū)與C線處的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合，在C線處出現(xiàn)一條顯色條帯，如不出現(xiàn)，則結(jié)果無效，需重新檢測。定量檢測將檢測卡置于定量檢測儀中，儀器通過對檢測區(qū)進(jìn)行掃描，收集T線、C線信號強(qiáng)度，最終轉(zhuǎn)換、計算出樣本中NGAL的濃度，實現(xiàn)定量檢測。最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本實用新型的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本實用新型，盡管參照前述實施例對本實用新型進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本實用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本實用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，由上卡殼、試紙條和下卡殼組成，所述上卡殼上設(shè)置有加樣孔和檢測窗，所述試紙條由在支撐物上依次相互搭接的樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)、吸水區(qū)組成，所述下卡殼中間為放置試紙條的卡槽，其特征在于所述加樣孔底部固定有尿液過濾裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其特征在于，所述尿液過濾裝置與樣品區(qū)不接觸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其特征在于，所述尿液過濾裝置由孔徑從上到下逐漸減小的不對稱多孔材料制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其特征在于，所述結(jié)合區(qū)涂覆有標(biāo)記物標(biāo)記的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其特征在于，所述標(biāo)記物為金屬膠體顆粒、熒光顆粒、磁性顆粒或有色乳膠顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白尿液檢測卡，其特征在于，所述檢測區(qū)上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被有中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG多克隆抗體。
專利摘要本實用新型涉及一種中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)尿液檢測卡，由上卡殼、試紙條和下卡殼組成。所述上卡殼上設(shè)置有加樣孔和檢測窗，所述下卡殼中間為放置試紙條的卡槽。所述加樣孔底部固定有尿液過濾裝置，所述尿液過濾裝置與樣品區(qū)不接觸，由孔徑從上到下逐漸減小的不對稱多孔材料制成。所述試紙條由在支撐物上依次相互搭接的樣品區(qū)、結(jié)合區(qū)、檢測區(qū)、吸水區(qū)組成，所述結(jié)合區(qū)涂覆有標(biāo)記物標(biāo)記的NGAL單抗，所述檢測區(qū)上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被有NGAL抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG。本實用新型NGAL尿液檢測卡尿液分離效果穩(wěn)定，減少了尿液中大分子物質(zhì)對檢測的干擾，可實現(xiàn)對NGAL快速檢測。
文檔編號G01N33/68GK202854153SQ201220594928
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者何仕釗 申請人:南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司