專利名稱：活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法及裝置的制作方法
活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法及裝置
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測活體樣品中的活化嗜中性粒細(xì)胞的方法及裝置。
背景技術(shù)：
正常的白細(xì)胞,通常被分類為:包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞的顆粒細(xì)胞、以及淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞。在它們之中，嗜中性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的50 60%，在對細(xì)菌、真菌等的病原微生物的活體防御中發(fā)揮重要的作用。例如，由細(xì)菌感染等而在活體中侵入異物之時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞由于由活體的炎癥反應(yīng)等所致的刺激而被活化，遷移到感染部位而吞食異物。被嗜中性粒細(xì)胞吞食的異物被作為在嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的各種的分解酶及強(qiáng)力的毒性物質(zhì)的活性氧種(ROS)而被殺菌。在另一方面，由刺激而活化的嗜中性粒細(xì)胞(以下，也稱之為“活化嗜中性粒細(xì)胞”)有在活體內(nèi)傷害正常組織的情況。例如，由活化嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過量的ROS已知在缺血再灌流障礙、自身免疫疾病等的炎癥反應(yīng)中，傷害活體的自身組織。由活化嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的ROS已知與急性呼吸穹迫綜合征、潰瘍性大腸炎、急性胃粘液膜病變等的病變形成相關(guān)。輸血關(guān)聯(lián)急性肺障礙也已知與活化嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)。如此，由于活化嗜中性粒細(xì)胞與各種的疾病及障礙相關(guān)，在血液檢查中，不僅是白細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)，也通過檢測活化嗜中性粒細(xì)胞，可得對于疾病的診斷、病態(tài)的掌握、治療監(jiān)測等極其有用的信息。近年，在臨床檢查的領(lǐng)域中，待測樣品中的白細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的原理的自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置進(jìn)行。另外，用于通過那樣的裝置的測定的血細(xì)胞分類用試劑也在市售。使用此試劑將待測樣品用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置測定，則檢測的各血細(xì)胞的信號在各散點(diǎn)圖上的指定的區(qū)域出現(xiàn)。使用如上述一樣的試劑對白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法在所述技術(shù)中有所耳聞。例如，在日本專利第4248017號公報(bào)中公開了使用包含將RNA特異性地染色的染色液，和含陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑的溶血?jiǎng)┑慕M合的試劑盒對異常白細(xì)胞和正常白細(xì)胞二者進(jìn)行分類計(jì)數(shù)的方法。另外，在美國專利申請第2009/0023129號及美國專利申請第2011/0027788號中公開了使用含有含指定的熒光染料的染色液和含陽離子性表面活性劑及/或非離子性表面活性劑的溶血?jiǎng)┑脑噭┒鴮准?xì)胞分類為4種或5種的計(jì)數(shù)方法。但是,這些的專利文獻(xiàn)之任何中均未公開對活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測。作為測定可含活化嗜中性粒細(xì)胞的待測樣品的例，可舉出J.Linssen等的文獻(xiàn)(J.Linssen等，Cytometry Part B(ClinicalCytometry), 74B, 295-309(2008))。J.Linssen等報(bào)告，以由刺激物質(zhì)活化處理的全血作為待測樣品而在自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置XE-2100(Sysmex株式會(huì)社制)進(jìn)行測定,貝U在白細(xì)胞分類一計(jì)數(shù)通道(DIFF_channel)中，作為嗜中性粒細(xì)胞分類的集團(tuán)的平均側(cè)方散射光強(qiáng)度 (NEUT-X)及平均熒光強(qiáng)度(NEUT-Y)比未處理的待測樣品降低。發(fā)明概述
本發(fā)明的范圍僅由隨附的權(quán)利要求定義，且不以任何方式受此發(fā)明概述部分的影響。本發(fā)明的目的是提供可分類計(jì)數(shù)正常白細(xì)胞，并且可檢測活化嗜中性粒細(xì)胞的活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法及裝置。本發(fā)明人，對被活化刺激，并且產(chǎn)生活性氧種的嗜中性粒細(xì)胞，在使用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置的測定中，檢查了其信號如何變化。結(jié)果，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與上述的J. Linssen等的報(bào)告不同，產(chǎn)生活性氧種的嗜中性粒細(xì)胞在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在，再者，其熒光強(qiáng)度在通常的嗜中性粒細(xì)胞以下、并且散射光強(qiáng)度相比通常的嗜中性粒細(xì)胞更高，即散射光強(qiáng)度在通常的嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞之間，從而完成本發(fā)明。從而，本發(fā)明提供以下的活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法及檢測裝置。(I)活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法，其包括(a)制備活體樣品中的紅細(xì)胞被溶血，白細(xì)胞的核酸被核酸染色性的熒光染料染色的測定樣品，(b)向制備的測定樣品照射光，測定從該樣品中的粒子發(fā)生的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，(C)基于取得的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，將活體樣品中的白細(xì)胞分類為至少含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)，(d)將在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。(2) (I)所述的方法，其中在(d)中，將熒光強(qiáng)度在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)以下、并且散射光強(qiáng)度在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間的粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。(3) (I)或(2)所述的方法，其中 含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)再含嗜堿性粒細(xì)胞。(4) (I)或(2)所述的方法，其中活化嗜中性粒細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生空胞變性。(5) (I)或(2)所述的方法，其中在(d)中，對在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。(6) (5)所述的方法，其中在(d)中，當(dāng)計(jì)數(shù)的值比指定的值更大時(shí)，將粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。(7) (I)或(2)所述的方法，其中測定樣品中的紅細(xì)胞被表面活性劑溶血。(8) (7)所述的方法，其中表面活性劑是選自下列的至少一種非離子性表面活性劑及陽離子性表面活性劑。(9) (I)或(2)所述的方法，其中散射光強(qiáng)度是側(cè)方散射光強(qiáng)度。
( 10)活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測裝置，其包括:將活體樣品，用于對核酸進(jìn)行染色的熒光染料，以及含有用于對紅細(xì)胞進(jìn)行溶血，給白細(xì)胞的細(xì)胞膜可透過熒光染料的程度的損傷的表面活性劑的溶血?jiǎng)┗旌隙苽錅y定樣品的樣品制備部; 向制備的測定樣品照射光，測定從該樣品中的粒子發(fā)生的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度的測定部 '及用于實(shí)施操作的控制部，其包含:(a)基于取得的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，將活體樣品中的白細(xì)胞分類為至少含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)；及(b)將在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。由上述的(I)及(10)，使對活體樣品中的正常白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，并且檢測活化嗜中性粒細(xì)胞變得可能。另外，由上述的(2)，可更確實(shí)地檢測活化嗜中性粒細(xì)胞。再者，由上述的(5)及(6)，可防活化嗜中性粒細(xì)胞的誤檢測。再者，由上述的(7)及(8)，由于紅細(xì)胞被確實(shí)地溶血，可以更好的精度進(jìn)行正常白細(xì)胞的分類系數(shù)及活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測。

圖1是將正常的白細(xì)胞由流式細(xì)胞儀測定之時(shí)的散點(diǎn)圖。圖2是示本發(fā)明的測定裝置之外觀的圖。圖3是測定部的功能框圖。圖4是檢測部的構(gòu)成圖。圖5是示將測定樣品用檢測部測定的流的圖。圖6是數(shù)據(jù)處理部的功能框圖。圖7是數(shù)據(jù)處理部的處理的流程圖。圖8是示由數(shù)據(jù)處理部表示的結(jié)果表示畫面之一例的圖。圖9是示由數(shù)據(jù)處理部表示的結(jié)果表示畫面的變形例的圖。圖10是由實(shí)施例1的測定得到的散點(diǎn)圖。圖11是示參考例I的結(jié)果的顯微鏡照片。圖12是示參考例2的結(jié)果的電子顯微鏡照片。圖13是由實(shí)施例2的測定得到的散點(diǎn)圖。發(fā)明詳述以下參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，活體樣品只要是含白細(xì)胞的體液樣品，就不特別限定，可舉出例如，從哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人采集的血液、骨髓液、尿、成分輸血等采集的樣品等。活體樣品為有含活化嗜中性粒細(xì)胞的可能性的樣品也可。在本說明書中，“活化嗜中性粒細(xì)胞”所指的用語是指由刺激活化的嗜中性粒細(xì)胞，作為示與正常的白細(xì)胞中含的通常的(未刺激的)嗜中性粒細(xì)胞可區(qū)別的血細(xì)胞的詞語被使用。
在本發(fā)明的實(shí)施方式中，作為活化嗜中性粒細(xì)胞，可舉出例如，產(chǎn)生活性氧種(ROS)的嗜中性粒細(xì)胞。在所述技術(shù)中，作為由活化嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的R0S，已知超氧化
物、羥基自由基、過氧化氫、單態(tài)氧等。另外，已知在吞食異物的活化嗜中性粒細(xì)胞中，異物進(jìn)入吞食空胞，然后，含分解酶及ROS的顆粒融合到此空胞而形成吞噬溶酶體，在形態(tài)學(xué)觀察中，確認(rèn)在活化嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)空胞變性。從而，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生空胞變性的嗜中性粒細(xì)胞也包括在活化嗜中性粒細(xì)胞中。活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法
接下來，說明本發(fā)明的活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法(以下，也簡單稱之為“檢測方法”)。在本發(fā)明的檢測方法中，首先，制備活體樣品中的紅細(xì)胞被溶血，白細(xì)胞的核酸被核酸染色性的熒光染料染色的測定樣品(制備步驟)。具體而言，將活體樣品，用于對核酸進(jìn)行染色的熒光染料，以及含有用于對紅細(xì)胞進(jìn)行溶血，給白細(xì)胞的細(xì)胞膜可透過熒光染料的程度的損傷的表面活性劑的溶血?jiǎng)┗旌隙苽錅y定樣品。在此制備步驟中，由上述的溶血?jiǎng)┑淖饔枚鴮?dǎo)致活體樣品中含的紅細(xì)胞被快速溶血，并且給白細(xì)胞的細(xì)胞膜可透過熒光染料的程度的損傷。然后，通過上述的熒光染料進(jìn)入受損傷的白細(xì)胞的細(xì)胞膜，白細(xì)胞的核酸被染色。活體樣品中存在活化嗜中性粒細(xì)胞時(shí)，活化嗜中性粒細(xì)胞的核酸也被染色。熒光染料本發(fā)明的檢測方法中使用的熒`光染料只要是可染色核酸的熒光染料，就不特別限定，可根據(jù)從光源照射來的光的波長而適宜選擇。作為那樣的熒光染料，可舉出例如，碘化丙錠、溴化乙錠、乙錠-吖啶異源二聚體、二疊氮化乙錠、乙錠同源二聚體-1、乙錠同源二聚體-2、單疊氮化乙錠、三亞甲基雙[[3-[[4-[[(3_甲基苯并噻唑-3-鎗)-2-基]亞甲基]-1，4-二氫喹啉]-1-基]丙基]二甲基銨].四碘化物(Τ0Τ0-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2 (3Η)-亞基)甲基]-1-[3-(三甲基銨基)丙基]氫喹啉鎗.二碘化物(T0-PR0-1),N, N，N’，Ν’ -四甲基-Ν，Ν’ -雙[3-[4-[3-[(3-甲基苯并噻唑_3_鎗)_2_基]-2-亞丙基]-1，4-二氫喹啉-1-基]丙基]-1，3-丙烷二銨一四碘化物(Τ0Τ0-3)、或者2-[3-[[1-[3-(三甲基銨基)丙基]-1，4- 二氫喹啉]-4-亞基]-1-丙烯基]-3-甲基苯并噻唑-3-鎗.二碘化物(T0-PR0-3)及以下的式(I)所表示的熒光染料。在它們之中，也優(yōu)選式(I)所表示的熒光染料。化I
K2 -
f^TfZ\_/=\
(I)
K f上述的式(I)中，R1及R4相同或不同，是氫原子、烷基、有羥基的烷基鏈、有醚基的烷基鏈、有酯基的烷基鏈、或者有取代基也可的芐基；R2及R3相同或不同，是氫原子、羥基、齒素、燒基、稀基、塊基、燒氧基、燒基橫酸基或苯基；z是硫原子、氧原子、或者有甲基的碳原子；11是0、1、2或3 ;X_是陰離子。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，烷基是直鏈狀或支鏈狀之任何也可。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，上述的式(I)中，R1及R4之任何一方是碳原子數(shù)6 18的烷基之時(shí)，另一方面是氫原子或碳原子數(shù)不足6的烷基是優(yōu)選的。在碳原子數(shù)6 18的烷基之中，碳原子數(shù)是6、8或10的烷基是優(yōu)選的。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，上述的式(I)中，作為R1及R4的芐基的取代基，可舉出例如，碳原子數(shù)I 20的烷基、碳原子數(shù)2 20的烯基或碳原子數(shù)2 20的炔基。在它們之中，甲基或乙基是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，上述的式(I)中，作為R2及R3的烯基，可舉出例如碳原子數(shù)2 20的烯基。另外，作為R2及R3的烷氧基，可舉出碳原子數(shù)I 20的烷氧基。在它們之中，特別是甲氧基或乙氧基是優(yōu)選的。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，上述的式(I)中，作為陰離子Γ，可舉出如F' Cl' 及
I一樣的齒素尚子、CF3SO3、BF4等。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，制備步驟中使用的熒光染料是I種也可，2種以上也可。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，用于對核酸進(jìn)行染色的熒光染料為溶液的形態(tài)也可。用于溶解熒光染料的溶劑不特別限定，但可舉出例如，水、有機(jī)溶劑及這些的混合物。作為有機(jī)溶劑，可舉出例如醇、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等。熒光染料有在水溶液中的保存穩(wěn)定性差的情況，因此溶解在有機(jī)溶劑中是優(yōu)選的。在制備步驟中，在使用熒光染料的溶液之時(shí)，熒光染料的濃度可適宜設(shè)定，但通常是0.01 lOOyg/L、優(yōu)選是0.1 lOyg/L。例如，作為熒光染料使用上述的式(I)所表示的熒光染料之時(shí)，在該溶液中熒光染料的濃度優(yōu)選是0.2 0.6 μ g/L，更優(yōu)選是0.3
0.5 μ g/L。在本發(fā)明的實(shí)施方 式中，作為熒光染料，使用市售的白細(xì)胞測定用的染色試劑也可。作為那樣的染色試劑，可舉出例如^卜■^卜9 4吁一 4DS (Sysmex株式會(huì)社)。^卜^卜9 4〒一 4DS是含上述的式(I)所示的熒光染料的染色試劑。溶血?jiǎng)?/b>本發(fā)明的檢測方法中使用的溶血?jiǎng)┖糜趯t細(xì)胞進(jìn)行溶血，給白細(xì)胞的細(xì)胞膜可透過上述的熒光染料的程度的損傷的表面活性劑。作為那樣的表面活性劑，可舉出陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，作為陽離子性表面活性劑，可舉出季銨鹽型表面活性劑及吡啶鎗鹽型表面活性劑。作為季銨鹽型表面活性劑，例如以下的式(II)所表示的，全碳原子數(shù)是9 30的表面活性劑被適宜地使用。化2
權(quán)利要求
1.活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法，其包括:Ca)制備活體樣品中的紅細(xì)胞被溶血，白細(xì)胞的核酸被核酸染色性的熒光染料染色的測定樣品，(b)向制備的測定樣品照射光，測定從該樣品中的粒子發(fā)生的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，(C)基于取得的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，將上述活體樣品中的白細(xì)胞分類為至少含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)，(d)將在上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和上述含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所 述的方法，其中在上述(d)中，將熒光強(qiáng)度在上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)以下、并且散射光強(qiáng)度在上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和上述含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間的粒子檢測為上述活化嗜中性粒細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)再含嗜堿性粒細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中上述活化嗜中性粒細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生空胞變性。
5.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中在上述(d)中，對在上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和上述含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中在上述(d)中，當(dāng)上述計(jì)數(shù)的值比指定的值更大時(shí)，將上述粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中上述測定樣品中的紅細(xì)胞被表面活性劑溶血。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中上述表面活性劑是選自下列的至少一種:非離子性表面活性劑及陽離子性表面活性劑。
9.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中上述散射光強(qiáng)度是側(cè)方散射光強(qiáng)度。
10.活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測裝置，其包括:將下列物質(zhì)混合而制備測定樣品的樣品制備部:活體樣品，用于對核酸進(jìn)行染色的熒光染料，以及含有用于對紅細(xì)胞進(jìn)行溶血，給白細(xì)胞的細(xì)胞膜可透過上述熒光染料的程度的損傷的表面活性劑的溶血?jiǎng)?；向制備的測定樣品照射光，測定從該樣品中的粒子發(fā)生的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度的測定部；及用于實(shí)施操作的控制部，其包含:(a)基于取得的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，將上述活體樣品中的白細(xì)胞分類為至少含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)；及(b)將在上述含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和上述含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子檢測為活化嗜中性粒 細(xì)胞。
全文摘要
活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法及裝置為了提供使正常白細(xì)胞的分類及活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測成為可能的活化嗜中性粒細(xì)胞的檢測方法，制備活體樣品中的紅細(xì)胞被溶血，白細(xì)胞的核酸被核酸染色性的熒光染料染色的測定樣品，向此樣品照射光，基于測定從該樣品中的粒子發(fā)生的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度而得到的散射光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度，將上述活體樣品中的白細(xì)胞分類為至少含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)，將在含嗜中性粒細(xì)胞的集團(tuán)和含嗜酸性粒細(xì)胞的集團(tuán)之間存在的粒子檢測為活化嗜中性粒細(xì)胞。
文檔編號G01N21/47GK103076311SQ201210411029
公開日2013年5月1日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者河野麻理, 高木由里 申請人:希森美康株式會(huì)社