專利名稱：一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )是普遍存在于自然界(空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中)、對人類可產(chǎn)生致病性的重要食源性病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌〃的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑O. 8 μ m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌細胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸；無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37°C，最適生長PH7. 4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。金黃色葡萄球菌在血平板生長形成的菌落周圍有透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球 菌有高度的耐鹽性，可在10 15%NaCl肉湯中生長，可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。對堿性染料敏感，十萬分之一的龍膽紫液即可抑制其生長。金黃色葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。根據(jù)對食源性疾病的統(tǒng)計分析顯示20 25%系由金黃色葡萄球菌的腸毒素引起的。據(jù)報道新鮮食品中含有大于5 X 104cfu/g就可以引起食品中毒。每年因病原微生物引起的疾病近數(shù)10億例，約有170萬名兒童因食用病原微生物污染的食物引起腹瀉而死亡。近年來，我國每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已上升第4位。因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。鑒于對金黃色葡萄球菌的危害認識，檢測、監(jiān)控食品是否含有金黃色葡萄球菌的是至關(guān)重要的?，F(xiàn)在檢測金黃色葡萄球菌的國標(biāo)方法是GB 4789. 10—2010，該方法的檢測時間長，操作繁瑣，要求專業(yè)技術(shù)人員，不適合大批量樣本的快速檢測。目前金黃色葡萄球菌的檢測方法有微生物學(xué)方法(傳統(tǒng)培養(yǎng)法和紙片法)，生物化學(xué)方法，血清學(xué)方法，免疫學(xué)方法(ELISA、免疫熒光技術(shù))，分子生物學(xué)方法(實時熒光定量PCR技術(shù)、基因測序技術(shù)、生物芯片技術(shù))。這些方法都存在著一些限制①檢測所需的時間長；②特異性不好；③靈敏度較差；④需要配制一定的儀器設(shè)備；⑤需要具備比較專業(yè)的人操作；⑥檢測費用高，這些檢測技術(shù)都難于在基層單位廣泛應(yīng)用。對于國內(nèi)外對食品安全要求不斷提高的現(xiàn)狀，需要開發(fā)一種快速簡單，在基層單位容易推廣的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明采用的解決方案為一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，包括增菌劑、免疫層析試紙及裂解劑；
所述增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨16 24份、牛肉浸出粉8 12份、酵母浸粉6. 5 9. 5份、葡萄糖O. 4 O. 6份、氯化鈉2. 5 3. 5份、氯化鋰I. 5 2. 5份、磷酸氫二鈉O. 65 O. 95份、純化水1000份；
所述裂解劑是由Triton X-100、Tween-80組成的水溶液；
所述免疫層析試紙包括面板及與其緊密扣合的底板，面板包括吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，金標(biāo)墊與吸水墊分別緊密連接于硝酸纖維素膜的兩端，樣品墊緊密連接于金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊上含有金黃色葡萄球菌蛋白A抗體標(biāo)記膠體金探針，所述硝酸纖維素膜上載有相互分離的檢測線和質(zhì)控線。優(yōu)選的,所述裂解劑,按體積百分含量計算，由如下組分組成Triton X-100 30 50%、Tween-80 7· 5 15%，余量為水。優(yōu)選的，所述增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖O. 5份、氯化鈉3份、氯化鋰2份、磷酸氫二鈉O. 8份、純化水1000份。
優(yōu)選的，免疫層析試紙的底板采用PVC板材料。優(yōu)選的，免疫層析試紙的吸水墊采用純植物纖維的純白濾紙材料。優(yōu)選的，免疫層析試紙的硝酸纖維素膜采用進口的135NC膜材料。優(yōu)選的，免疫層析試紙的金標(biāo)墊和樣品墊采用親水的玻璃纖維材料。優(yōu)選的，檢測線由兔IgG抗體噴涂而成，質(zhì)控線由羊抗雞IgG抗體噴涂而成。一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的方法，使用權(quán)利要求I 8任一項所述的試劑盒，包括以下步驟
1)將固體樣品加入到生理鹽水中，制成樣品質(zhì)量濃度為10%的樣品勻液，或?qū)⒁后w樣品加入到生理鹽水中，制成樣品體積濃度為10%的樣品勻液；
2)按I:20的質(zhì)量比將增菌劑溶于水中，得增菌液；
3)將樣品勻液與增菌液按I:4的體積比混勻，37°C震蕩培養(yǎng)6h，得樣品增菌液；
4)按501的體積比向樣品增菌液中加入裂解劑，混勻，靜置5min，得檢測液；
5)將檢測液加到免疫層析試紙的樣品墊上，靜置，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的顏色變化判斷結(jié)果，檢測線和質(zhì)控線同時出現(xiàn)紅色帶說明檢測結(jié)果為陽性，顏色越質(zhì)控線出現(xiàn)紅色帶、檢測線不出現(xiàn)紅色帶說明檢測結(jié)果為陰性，質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色帶說明檢測結(jié)果無效。本發(fā)明金黃色葡萄球菌蛋白A抗體標(biāo)記膠體金探針是金黃色葡萄球菌蛋白A抗體與檸檬酸三鈉還原氯金酸的膠體金顆粒發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)結(jié)合生成的。本發(fā)明金標(biāo)墊是采用XYZ三維劃膜噴金儀HM3030將金黃色葡萄球菌蛋白A抗體標(biāo)記膠體金探針噴到玻璃纖維上，40 0C恒溫干燥制備的。本發(fā)明硝酸纖維素膜上載有的檢測線、質(zhì)控線分別是采用XYZ三維劃膜噴金儀HM3030分別將兔IgG抗體、羊抗雞IgG抗體分別噴到硝酸纖維素膜上，40°C恒溫干燥形成的。本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合增菌技術(shù)和膠體金免疫層析檢測技術(shù)開發(fā)一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒。膠體金免疫層析檢測技術(shù)的基本原理是將高特異性高靈敏的抗體與膠體金顆粒交聯(lián)形成標(biāo)記結(jié)合物，并與固化在硝酸纖維素膜載體上的抗體形成雙抗體夾心法檢測抗原。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，靈敏度高達6X 105cfu/ml、特異性好、成本低、安全環(huán)保、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，操作 簡便，省時省力，易于觀察判讀，無需專業(yè)人員和任何特殊輔助儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場檢測和基層人員使用。本試劑盒無毒無害，不會對環(huán)境造成污染。因此，本發(fā)明的試劑盒在基層的快速檢測速凍食品中有著廣泛的市場潛力。


圖I是本發(fā)明試劑盒中金黃色葡萄球菌免疫層析試紙結(jié)構(gòu)示意 圖2是本發(fā)明試劑盒靈敏度試驗檢測結(jié)果；
圖3是本發(fā)明試劑盒特異性試驗檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限如此。實施例I (金黃色葡萄球菌免疫層析試紙)
金黃色葡萄球菌免疫層析試紙的制備
1、生物材料
金黃色葡萄球菌蛋白A抗體、兔IgG、羊抗雞IgG (均購自SIGMA)
2、免疫層析試劑耗材
硝酸纖維素膜(NC膜，135S)購自Minipore，玻璃纖維、吸水紙、PVC板購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。3、儀器設(shè)備
膠體金標(biāo)記設(shè)備，XYZ三維劃膜噴金儀HM3030，微電腦自動斬切機ZQ2000，自動裁條機CT300購自上海金標(biāo)生物科技有限公司。4、金黃色葡萄球菌免疫層析試紙條的制備
4.I硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線固化
檢測線兔IgG抗體2. Omg/ml ;質(zhì)控線羊抗雞IgG抗體2. O mg/ml ;用XYZ三維劃膜噴金儀HM3030噴到NC膜上，40°C恒溫干燥35min固化。噴膜參數(shù)泵壓100 pa ;噴量O. Ι μ /mm ;速度60mm/S。4. 2金標(biāo)墊制備
將金黃色葡萄球菌蛋白A抗體與PH7. 0-7. 5檸檬酸三鈉法制備的40nm膠體金顆粒按20ng lml交聯(lián)結(jié)合成探針；用XYZ三維劃膜噴金儀HM3030噴到玻璃纖維上，40°C恒溫干燥。噴金參數(shù)泵壓200pa ；噴量O. 2μ1 /mm ；速度40 mm/S。4. 3樣品墊制備
按5X6cm玻璃纖維用Iml樣品緩沖液處理的用量計算其所需量，將樣品緩沖液均勻涂布在玻璃纖維上，40°C恒溫干燥。4. 4 組裝
將吸水墊、金標(biāo)墊、樣品墊按順序貼在有NC膜的PVC板上，切成4_的條，裝卡、包裝；常溫干燥保存，得免疫層析試紙，結(jié)構(gòu)如圖I所示。實施例2
金黃色葡萄球菌增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖O. 5份、氯化鈉3份、氯化鋰2份、磷酸氫二鈉O. 8份、純化水1000份。實施例3
金黃色葡萄球菌增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨24份、牛肉浸出粉8份、酵母浸粉6. 5份、葡萄糖O. 4份、氯化鈉3. 5份、氯化鋰I. 5份、磷酸氫二鈉O. 65份、純化水1000份。實施例4
金黃色葡萄球菌增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨16份、牛肉浸出粉12份、酵·母浸粉9. 5份、葡萄糖O. 6份、氯化鈉2. 5份、氯化鋰2. 5份、磷酸氫二鈉O. 95份、純化水1000 份。實施例5
金黃色葡萄球菌裂解劑，按體積百分含量計算，由如下組分組成Triton X-100 40%、Tween-80 10%,余量為水。實施例6
金黃色葡萄球菌裂解劑，按體積百分含量計算，由如下組分組成Triton X-100 30%、Tween-80 7.5%,余量為水。實施例7
金黃色葡萄球菌裂解劑，按體積百分含量計算，由如下組分組成Triton X-100 50%、Tween-80 15%,余量為水。實施例8
一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，包括實施例5的金黃色葡萄球菌增菌劑、實施例I的金黃色葡萄球菌免疫層析試紙及實施例2的金黃色葡萄球菌裂解劑。實施例9
一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，包括實施例5 7任一例的金黃色葡萄球菌增菌劑、實施例I的金黃色葡萄球菌免疫層析試紙及實施例2 4任一例的金黃色葡萄球菌裂解劑。不同的金黃色葡萄球菌增菌劑的效果比較
采用實施例8的快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，分別以不同的金黃色葡萄球菌增菌劑(見表I中的對比例I 6的配方)替代實施例2的金黃色葡萄球菌增菌齊IJ，分別采用上述試劑盒檢測金黃色葡萄球菌，分析各金黃色葡萄球菌增菌劑的效果，檢測步驟如下
1)按I:20的質(zhì)量比將增菌劑溶于無菌的純化水中，得增菌液；
2)取250cfu/ml、500cfu/ml、1000cfu/ml和2000cfu/ml金黃色葡萄球菌的生理鹽水溶液1ml，分別加入4ml增菌液中，混勻，置于37°C震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，震蕩速度為250r/min,得樣品增菌液；
3)取2.5ml樣品增菌液，加入50 μ L的金黃色葡萄球菌裂解劑充分混勻后，靜置5min，得檢測液；4)將80 μ L的檢測液加到免疫層析試紙的樣品墊上，靜置，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的顏色變化判斷結(jié)果，所有檢測重復(fù)三次。各金黃色葡萄球菌增菌劑配方對應(yīng)的檢測結(jié)果見表I,由表I可知,本發(fā)明增菌劑配方最佳，可檢出濃度為250 cfu/ml,靈敏度最高,顯色背景清晰。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，包括增菌劑、免疫層析試紙及裂解劑； 所述增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨16 24份、牛肉浸出粉8 12份、酵母浸粉6. 5 9. 5份、葡萄糖O. 4 O. 6份、氯化鈉2. 5 3. 5份、氯化鋰I. 5 2. 5份、磷酸氫二鈉O. 65 O. 95份、純化水1000份； 所述裂解劑是由Triton X-100、Tween-80組成的水溶液； 所述免疫層析試紙包括面板及與其緊密扣合的底板，面板包括吸水墊、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊，所述金標(biāo)墊與吸水墊分別緊密連接于硝酸纖維素膜的兩端，樣品墊緊密連接于金標(biāo)墊；所述金標(biāo)墊上含有金黃色葡萄球菌蛋白A抗體標(biāo)記膠體金探針，所述硝酸纖維素膜上載有相互分離的檢測線和質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述裂解劑，按體積百分含量計算，由如下組分組成Triton X-100 30 50%, Tween-80 7. 5 15%，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述增菌劑由如下重量份組份組成胰蛋白胨20份、牛肉浸出粉10份、酵母浸粉8份、葡萄糖O. 5份、氯化鈉3份、氯化鋰2份、磷酸氫二鈉O. 8份、純化水1000份。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于免疫層析試紙的底板采用PVC板材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于免疫層析試紙的吸水墊采用純植物纖維的純白濾紙材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于免疫層析試紙的硝酸纖維素膜采用進口的135NC膜材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于免疫層析試紙的金標(biāo)墊和樣品墊采用親水的玻璃纖維材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于檢測線由兔IgG抗體噴涂而成，質(zhì)控線由羊抗雞IgG抗體噴涂而成。
9.一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于使用權(quán)利要求I 8任一項所述的試劑盒，包括以下步驟 1)將固體樣品加入到生理鹽水中，制成樣品質(zhì)量濃度為10%的樣品勻液，或?qū)⒁后w樣品加入到生理鹽水中，制成樣品體積濃度為10%的樣品勻液； 2)按I:20的質(zhì)量比將增菌劑溶于水中，得增菌液； 3)將樣品勻液與增菌液按I:4的體積比混勻，37°C震蕩培養(yǎng)6h，得樣品增菌液； 4)按501的體積比向樣品增菌液中加入裂解劑，混勻，靜置5min，得檢測液； 5)將檢測液加到免疫層析試紙的樣品墊上，靜置，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的顏色變化判斷結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括增菌劑、免疫層析試紙及裂解劑；所述增菌劑由組份組成胰蛋白胨、牛肉浸出粉、酵母浸粉、葡萄糖、氯化鈉、氯化鋰、磷酸氫二鈉、純化水；所述裂解劑是由TritonX-100、Tween-80組成的水溶液。本發(fā)明的快速檢測速凍食品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，靈敏度高達6×105cfu/ml、特異性好、成本低、安全環(huán)保、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便，省時省力，易于觀察判讀，無需專業(yè)人員和任何特殊輔助儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場檢測和基層人員使用。本試劑盒無毒無害，不會對環(huán)境造成污染。
文檔編號G01N33/558GK102914649SQ20121041098
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者林禮錕, 盧新 申請人:廣州綠洲生化科技股份有限公司