專利名稱：一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，本實用新型屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種檢測耗材，具體涉及一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條及試劑盒。
背景技術(shù)：
螺旋霉素，英文名Spiramycin，為白色或微黃色粉末，微有味；微吸濕；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，難溶于水。并且具有強大的體內(nèi)抗菌作用和抗菌后效應(yīng)(PAE)，能夠增強吞噬細胞的吞噬作用，廣泛分布于體內(nèi)，在組織細胞內(nèi)濃度較紅霉素高，而副作用小于紅霉素，可用于治療由革蘭陽性菌和某些革蘭陰性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。國際食品法典委員會、歐盟以及日本均規(guī)定該藥物的最高殘留限量值為200yg/L;因此，在實踐中，需要一種精確度、靈敏度高的檢測螺旋霉素的方法。 目前，動物組織中螺旋霉素殘留的主要檢測方法有杯碟法、高效液相色譜/質(zhì)樸/質(zhì)譜法、高壓液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)機(HPLC/MS)等，這些檢測方法由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和樣本前處理及測定操作繁瑣且費用高，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。而酶聯(lián)免疫吸附分析法使用成本高、回收方法復(fù)雜、靈敏度不高，這些缺陷使其推廣使用受到限制。申請?zhí)枮?00910237822. O的發(fā)明專利，公開了一種檢測螺旋霉素的方法及其專用的酶聯(lián)免疫試劑盒，該方法檢測螺旋霉素殘留前、后都需要做必要的儀器清洗及保養(yǎng)工作，并且要求專業(yè)技術(shù)人員來操作。免疫膠體金技術(shù)(Immunogold labelling techique)是上世紀80年代繼突光素、放射性同位素和酶三大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。該技術(shù)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中?？焖僭\斷試紙條是20世紀90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新型層析材料基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維膜上，膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體區(qū)域時，待測物金標(biāo)試劑復(fù)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，膠體金標(biāo)記聚集在檢測帶上，可通過目測得到直觀的顯色結(jié)果。而游離的標(biāo)記物則越過檢測帶，從而達到與檢測物自動分離的目的。競爭抑制法可用于測定抗原或抗體，以測定抗原為例，其原理為標(biāo)本中的受檢抗原和固相的包被抗原競爭與標(biāo)記抗體結(jié)合，當(dāng)標(biāo)本中的受檢抗原的量大于等于試劑的閾值，則標(biāo)記抗體則不會與固相的包被抗原結(jié)合；若標(biāo)本中無受檢抗原，則標(biāo)記抗體直接與固相的包被抗原結(jié)合。目前，將免疫競爭抑制法與膠體金檢測技術(shù)相結(jié)合來對螺旋霉素殘留進行快速檢測，且具有高效、靈敏、特異、便捷，經(jīng)濟等特點的膠體金試紙條鮮有報道。實用新型內(nèi)容[0010]為解決上述領(lǐng)域的需求和空白，本實用新型旨在提供一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條及試劑盒，本實用新型試紙條采用競爭抑制法和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合快速檢測食品中的螺旋霉素殘留，用于水產(chǎn)品中的螺旋霉素的快速檢測；本實用新型試紙條操作簡單，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到水產(chǎn)品企業(yè)及家庭，以符號顯示結(jié)果，擺脫了對設(shè)備、儀器、人員及貯存和運輸環(huán)境的特殊要求，并且具有快速、簡便、靈敏、準確、特異、經(jīng)濟的特點。一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層上；所述反應(yīng)試劑載體吸附層從沾液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊；在所述樣品纖維墊、金標(biāo)纖維墊和手持端吸水材料墊上覆蓋有保護膜層，所述纖維素藥膜墊上從手持端到沾液端依次設(shè)有對照線C線、檢測線T線，所述對照線C線和檢測線T線相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直，其特征在于，所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗；所述對照線C線包被有兔抗小鼠IgG多抗，所述檢測線T線包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物。所述膠體金試紙條，其特征在于，在樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T線平行的可視的MAX標(biāo)志線。所述手持端吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。所述保護膜層為膠帶。所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。一種快速檢測螺旋霉素殘留的試劑盒，其特征在于包括上述任一膠體金試紙條和樣品稀釋用具。技術(shù)效果根據(jù)膠體金檢測的原理，將本實用新型的膠體金試紙條的粘液端浸入待測液中，或者在粘液端的樣品纖維層滴加待測液，待測液通過虹吸帶動待檢螺旋霉素殘留及金標(biāo)纖維墊中的膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗一起向硝酸纖維素膜方向擴散，并最終滲入手柄端吸水紙中，擴散過程中待檢螺旋霉素殘留可與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗相結(jié)合，進而封閉膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗上螺旋霉素結(jié)合點，阻止膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗與纖維素藥膜上偶聯(lián)螺旋霉素的載體蛋白的檢測線T線相結(jié)合，檢測線不能顯色，而兔抗小鼠IgG多抗則可與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗相結(jié)合，對照線C線顯紅色，則為陽性，反之，待測液中無螺旋霉素則不能阻止膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗與纖維素藥膜上偶聯(lián)螺旋霉素的載體蛋白的檢測線T線相結(jié)合，檢測線T線顯紅色，同樣，兔抗小鼠IgG多抗也與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗相結(jié)合，對照線C顯紅色，形成兩條紅色印記為陰性，如果纖維素藥膜上沒有顯示紅色標(biāo)記，則表明試紙條生效。本實用新型的膠體金試紙條不同于現(xiàn)有的試紙條之處在于所述纖維素藥膜墊上從手持端到沾液端依次設(shè)有對照線C線、檢測線T線，所述對照線C線和檢測線T線相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直，其特征在于，所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗；所述對照線C線包被有兔抗小鼠IgG多抗，所述檢測線T線包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物。本實用新型試紙條采用競爭抑制法原理以及膠體金技術(shù)快速檢測水產(chǎn)品中螺旋霉素的殘留。本實用新型試紙條通過選定金標(biāo)纖維墊、T線線、C線線和樣品纖維墊上的相應(yīng)的生物包被試劑來實現(xiàn)對螺旋霉素殘留的快速檢測，同時本實用新型試紙條兼顧檢測的靈敏度和特異性。本實用新型，優(yōu)選在樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T線平行的可視的MAX標(biāo)志線。用于提醒操作人員，操作時待測液不要超過標(biāo)志線，以免引起假陽性。本實用新型，優(yōu)選所述樣品纖維墊的材料是玻璃纖維棉，所述手持端吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜的材料是硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本實用新型檢測試紙條的檢測速度和準確性?！け緦嵱眯滦停瑑?yōu)選保護膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。本實用新型，優(yōu)選基板支撐層為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測液從而影響水平方向的遷移。本實用新型，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。本實用新型試紙條采用競爭抑制法原理以及膠體金技術(shù)快速檢測螺旋霉素殘留，用于水產(chǎn)品中的螺旋霉素的快速檢測；本實用新型試紙條操作簡單，拿來即用，方便快捷，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，并且保證檢測的靈敏性、準確性和高效率。

圖I本實用新型試紙條的俯視圖其中1-手持端，2-對照線C線，3-檢測線T線，4-MAX標(biāo)志線，5-沾液端，6-纖維素藥膜，7-樣品纖維墊，8-手持端吸水材料墊，9-金標(biāo)纖維墊，13-膠帶邊緣線。圖2本實用新型試紙條的縱向剖面圖其中6-纖維素藥膜，7-樣品纖維墊，8-手持端吸水材料墊，9-金標(biāo)纖維墊，10-手持端膠帶，11-箭頭膠帶，12-基板支撐層。
具體實施方式
提供下述實施例是為了更好地進一步理解本實用新型，并不局限于所述最佳實施方式，不對本實用新型的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制，任何人在本實用新型的啟示下或是將本實用新型與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本實用新型相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。[0034]本實用新型旨在提供一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，本實用新型試紙條采用雙競爭抑制法原理以及膠體金技術(shù)快速檢測螺旋霉素殘留，用于水產(chǎn)品中的螺旋霉素的快速檢測；本實用新型試紙條操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到水產(chǎn)品企業(yè)及單個家庭，以符號顯示結(jié)果，擺脫了對設(shè)備、儀器、人員及貯存和運輸環(huán)境的特殊要求，并且具有快速、簡便、靈敏、準確、特異的特點。根據(jù)膠體金檢測的原理，將本實用新型的膠體金試紙條的粘液端浸入待測液中，或者在粘液端的樣品纖維層滴加待測液，待測液通過虹吸帶動待檢螺旋霉素及金標(biāo)纖維墊中的膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗一起向硝酸纖維素膜方向擴散，并最終滲入手柄端吸水紙中，擴散過程中待檢螺旋霉素可與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗相結(jié)合，進而封閉膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗上螺旋霉素結(jié)合點，阻止膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗與纖維素藥膜上偶聯(lián)螺旋霉素的載體蛋白的檢測線T線相結(jié)合，檢測線不能顯色，而兔抗小鼠IgG多抗則可與膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗相結(jié)合，對照線C線顯紅色，則為陽性，反之，待測液中無螺旋霉素則不能阻止膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗與纖維素藥膜上偶聯(lián)螺旋霉素的載體蛋白的檢測線T線相結(jié)合，檢測線T線顯紅色，同樣，兔抗小鼠IgG多抗也與膠體金標(biāo)記的螺旋 霉素單抗相結(jié)合，對照線C線顯紅色，形成兩條紅色印記為陰性，如果纖維素藥膜上沒有顯示紅色標(biāo)記，則表明試紙條生效。本實用新型試紙條，在高度方向上包括基板支撐層12、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層12上；所述反應(yīng)試劑載體吸附層從沾液端5到手持端I依次設(shè)有樣品纖維墊7，金標(biāo)纖維墊9，纖維素藥膜6，手持端吸水材料墊8 ;在所述樣品纖維墊7、金標(biāo)纖維墊9和手持端吸水材料墊8上覆蓋有保護膜層。本實用新型的膠體金試紙條不同于現(xiàn)有的試紙條之處在于所述纖維素藥膜6上從手持端I到沾液端5依次設(shè)有對照線C線2、檢測線T線3，所述對照線C線2和檢測線T線3相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直，其特征在于，所述金標(biāo)纖維墊9上包被有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗；所述對照線C線2包被有兔抗小鼠IgG多抗，所述檢測線T線3包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物。本實用新型，優(yōu)選在樣品纖維墊7上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T線3平行的可視的MAX標(biāo)志線4。用于提醒操作人員，操作時待測液不要超過標(biāo)志線4，以免引起假陽性。本實用新型，優(yōu)選所述樣品纖維墊7的材料是玻璃纖維棉，所述手持端吸水材料墊8的材料是粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜6的材料是硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維墊9的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本實用新型檢測試紙條在檢測速度和準確性。本實用新型，優(yōu)選保護膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。本實用新型，優(yōu)選基板支撐層12為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測液從而影響水平方向的遷移。本實用新型，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。實驗例I.本實用新型試紙條的制備方法試紙條的制備程序如下步驟I.纖維素藥膜的包被I、將兔抗小鼠IgG多抗作為對照線C線，螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物作為檢測線T線，兩個試劑分別按照所需的濃度(范圍I. 5-2mg/ml)，用20mM的PBS進行稀釋。2、將配制好的上述試劑，按照C、T線位置分別包被到硝酸纖維素膜上，然后干燥6 小時，溫度為30°C，濕度< 35%，從而制得纖維素藥膜。步驟2.金標(biāo)纖維層的標(biāo)記I、取40nm的膠體金溶液，按終濃度8-12 μ I/ml加入O. 2M K2CO3,加入一定濃度的螺旋霉素單抗，放置室溫反應(yīng)15-30分鐘，然后按照濃度20 μ Ι/ml加入20%BSA的溶液，用于飽和游離的膠體金。最后lOOOOrpm，離心30分鐘，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用等體積的O. 5m硼酸溶液(含l%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、O. 1%PVA)復(fù)溶沉淀的膠體金標(biāo)記原液。2、將上述膠體金標(biāo)記原液按照10-20%濃度，用O. 5m硼酸溶液進行稀釋，從而配制成標(biāo)記后的膠體金工作液。然后再將該工作液鋪于30*30cm玻璃纖維墊上,干燥6小時,溫度為30°C，濕度彡35%，從而制得金標(biāo)墊。步驟3.試紙條的組裝I、將塑料板平放在操作臺上，貼上雙面膠帶。2、撕掉雙面膠帶襯紙，在距塑料板上端30mm處貼上已包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物和兔抗小鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維素膜。3、將粗纖維吸水紙壓硝酸纖維素膜上端2mm貼上，上端與塑料板上端取齊。4、將小無紡布壓硝酸纖維素膜下端O. 5mm處貼上。5、將金標(biāo)墊取齊壓于小無紡布上面。6、將玻璃纖維墊壓于金標(biāo)墊上約一半，下端距塑料板下端2mm處貼上。7、將大無紡布與金標(biāo)墊上端取齊，下端與塑料板下端取齊貼上。8、將箭頭膠帶壓硝酸纖維素膜I. 5-2mm貼上。9、將手持端膠帶壓粗纖維吸水紙貼上。檢測陽性樣本時候，本實用新型產(chǎn)品則是樣本中的螺旋霉素殘留先與膠體金標(biāo)記螺旋霉素多抗進行特異性結(jié)合，進而阻止膠體金標(biāo)記螺旋霉素單抗與藥膜包被的螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物進行特異性結(jié)合反應(yīng)。而對照試劑則是膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗在藥膜處與兔抗小鼠IgG多抗進行特異性結(jié)合反應(yīng)。本實用新型一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條采用競爭抑制法原理和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合快速檢測水產(chǎn)品種的螺旋霉素殘留。本實用新型試紙條操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到水產(chǎn)品企業(yè)及單個家庭，本實用新型以符號顯示結(jié)果，擺脫了對設(shè)備、儀器、人員及貯存和運輸環(huán)境的特殊要求，用于水產(chǎn)品中螺旋霉素的快速檢測，并且具有快速、簡便、靈敏、準確、特異的特點。
權(quán)利要求1.一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層上； 所述反應(yīng)試劑載體吸附層從沾液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊； 在所述樣品纖維墊、金標(biāo)纖維墊和手持端吸水材料墊上覆蓋有保護膜層，所述纖維素藥膜墊上從手持端到沾液端依次設(shè)有對照線C線、檢測線T線，所述對照線C線和檢測線T線相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直，所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗；所述對照線C線包被有兔抗小鼠IgG多抗，所述檢測線T包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，在樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T線平行的可視的MAX標(biāo)志線。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，所述樣品纖維墊的材料是玻璃纖維棉，所述手持端吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，所述保護膜層為膠帶。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條，其特征在于，還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。
7.一種快速檢測螺旋霉素殘留的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1-5任一所述膠體金試紙條和樣品稀釋用具。
8.一種快速檢測螺旋霉素殘留的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求6所述膠體金試紙條和樣品稀釋用具。
專利摘要本實用新型一種快速檢測螺旋霉素殘留的膠體金試紙條及試劑盒，屬醫(yī)用檢測耗材，其特征在于，所述金標(biāo)纖維墊上包被有膠體金標(biāo)記的螺旋霉素單抗；所述對照線C線包被有兔抗鼠IgG多抗，所述檢測線T線包被有螺旋霉素半抗原-牛血清蛋白BSA偶聯(lián)物，本實用新型試紙條采用競爭抑制法原理以及膠體金技術(shù)快速檢測水產(chǎn)品中螺旋霉素的殘留，本實用新型試紙條簡捷靈敏準確，用于水產(chǎn)品的檢測。
文檔編號G01N33/577GK202710563SQ20122028776
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者張春山, 張永勝 申請人:北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司