一種使用bodipy類熒光染料測定微藻油脂含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種使用BODIPY類熒光染料快速測定微藻油脂含量的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)測定微藻油脂含量所需樣品大、成本高以及藻類自身熒光干擾的技術(shù)問題。本發(fā)明方法：將待測藻液通過稀釋或離心濃縮，調(diào)整OD值至0.15左右，與終濃度為0.05μg/ml-1μg/ml的BODIPY熒光染料和終濃度為0%-40%的DMSO混合后，在25℃-60℃溫度范圍內(nèi)，避光染色10min，選擇400-600nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長450-700nm之間的熒光強度，熒光強度與藻細胞中油脂含量呈正相關(guān)，可用于進行相對或絕對定量。本發(fā)明方法適用于綠藻門、紅藻門、金藻門、黃藻門、褐藻門、隱藻門、硅藻門、甲藻門等單細胞藻類進行油脂含量的快速高通量測定。
【專利說明】一種使用BODIPY類熒光染料測定微藻油脂含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]具體說是一種使用BODIPY類熒光染料測定微藻中油脂含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著石油資源日趨緊張，生物能源尤其是微藻生物能源得到了越來越多的關(guān)注和發(fā)展。作為目前液體燃料最適宜的替代物，生物柴油是眾多可替代能源中最有可能率先大規(guī)模應(yīng)用的產(chǎn)品。作為生物圈最大生物量之一的微藻，具有快速生長和光合固定二氧化碳雙重優(yōu)勢，是具有很高應(yīng)用前景的生物柴油生產(chǎn)生物。微藻生物技術(shù)的開發(fā)，將為我國提供新的能源途徑。
[0003]但在世界范圍內(nèi)，海洋微藻能源研究及應(yīng)用尚處于起步階段，存在的突出問題是成本過高，理論和現(xiàn)實差距大，許多關(guān)鍵技術(shù)有待突破，就前期的研究來看，如何選取適合的藻種是關(guān)鍵。但是目前生長快的微藻藻種通常含油量只有10%?20%，體積小于10微米的細胞也不易于收獲，而含油量大于60%的藻種生長速度較慢，因此需要開展工程藻種的良種優(yōu)化，選育細胞生長快、含油量高和易于收獲的藻種。所以快速測定微藻油脂含量成為迫在眉睫的工作，也是其他各項后續(xù)工作的前提。
[0004]重量法是最為常用的微藻油脂測定方法，但是所需樣品量大，樣品處理與提取過程耗時長，不能滿足微藻油脂研究和生產(chǎn)的檢測要求。于是出現(xiàn)了使用尼羅紅熒光染料來分析油脂含量的方法，但是尼羅紅的發(fā)射光在590-640nm附近，與很多藻的自身葉綠素熒光相互干擾。該染料本身的特異性問題，造成檢測的不準確性。急需一種更為廣泛適用的能夠避免藻類自身熒光干擾的熒光染料。
[0005]BODIPY是一類近紅外的短波長的熒光染料，常見的有B0DIPY493/503、B0DIPY500/510、B0DIPY505/515、B0DIPY530/550、B0DIPY558/568，它們大多可以避開大部分藻自身葉綠素熒光的干擾，目前已有人在流式細胞儀中使用該染料進行篩選，但是使用該方法受到儀器的限制，因為該儀器對藻體的大小要求較高，過大或過小的藻都無法進行檢測，不能廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適應(yīng)性更為廣泛的熒光染料快速測定微藻油脂含量的方法。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0008]一種使用BODIPY類熒光染料測定微藻油脂含量的方法，是使用BODIPY類熒光染料在熒光分光光度計中對待篩的藻種的油脂含量進行檢測，快速篩選出油脂含量較高的微藻。
[0009]使用BODIPY類熒光染料對藻類油脂進行染色，使用熒光分光光度計進行微藻油脂含量的測定。
[0010]將待測藻液通過稀釋或離心濃縮，調(diào)整OD值至0.15左右，與終濃度為0.05 μ g/ml-1 μ g/ml的BODIPY熒光染料和終濃度為0%_40%的DMSO混合后，避光染色5_15min，在熒光分光光度計上，選擇400-600nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長450_700nm之間的熒光強度，熒光強度與藻細胞中油脂含量呈正相關(guān)，并得到油脂含量與熒光強度的計算公式為:y=0.0037χ-0.5521。
[0011]所述的BODIPY類熒光染料的濃度0.05 μ g/ml-1 μ g/ml。
[0012]BODIPY類熒光染料的溶劑為體積分數(shù)為0.05%-40%DMS0水溶液。
[0013]所述的BODIPY類熒光染料對藻類油脂的染色溫度為25_60°C。
[0014]所述藻為綠藻門、紅藻門、金藻門、黃藻門、褐藻門、隱藻門、硅藻門、或甲藻門等單細胞藻類中的一種或二種以上。
[0015]同時根據(jù)藻的不同油脂含量和相應(yīng)的熒光強度的相關(guān)性，制定標準曲線，再測定該藻種時可以直接根據(jù)熒光強度在標準曲線中獲得油脂含量。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點:
[0017]1.解決了藻類自身葉綠素熒光的干擾；
[0018]2.檢測快速、高通量:所述熒光分光光度計測定樣品油脂含量可在比色皿和孔板內(nèi)進行，真正實現(xiàn)了快速、高通量的檢測；
[0019]3.需要樣品量與成本低:與傳統(tǒng)測油脂含量的重量法相比，重量法每次至少需要IOOmg凍干藻粉來測量以保證結(jié)果準確度，而本方法只需幾微升的藻液，極大的降低了檢測所用的樣品量；如果以此方法為基礎(chǔ)進行藻種篩選，就無需為了獲得藻粉而進行的培養(yǎng)、收獲、凍干等一系列的時間和經(jīng)濟成本，很大程度的降低了油脂含量測定來篩選微藻的成本；
[0020]4.克服了流式細胞儀操作不能普遍適用所有藻種的缺點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為金藻熒光強度與油脂含量的標準曲線。
[0022]【具體實施方式】:下面通過具體實施例對本發(fā)明方法和結(jié)果進行說明。
[0023]藻種:
[0024]海水藻:亞心形四月藻(Tetraselmis subcordiformis)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、巴夫藻(Pavlova viridis)、新月藻(Nitzschiaclosterium)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、淡 /JC 衣 藻(Chlamyclomonasreinhartii)、多糖小球藻(Chlorella sacchrarophila)；
[0025]培養(yǎng)基:不同的微藻使用不同的培養(yǎng)基
[0026]康維方培養(yǎng)基:培養(yǎng)亞心形四月藻使用的培養(yǎng)基。
[0027]最終濃度為:NaN03100mg/L，NaH2PO4.2Η2020.0mg/L, EDTA_Na245.0mg/L,H3B0333.6mgL, MnCl2 *4H200.36mg/L, FeCl3 *6H201.3mgL, ZnCl20.21mg/L, CoCl2 *6H200.20mg/L, (NH4)4Mo7O24 *4H200.09mg/L, CuSO4 *5H200.20mg/L, KN03lg/L, KH2PO40.05g/L,Tris0.81g/L, CH3COOH0.346g/L。
[0028]f/2培養(yǎng)基:培養(yǎng)湛江等鞭金藻、紫球藻和巴夫藻使用的培養(yǎng)基。
[0029]最終濃度為:NaN0375mg/L,NaH2PO4.2H205mg/L, VitaminB120.5 μ g/L,Biotin0.5 μ g/L, vitamin B10.lmg/L, FeCl3.6H203.16mg/L, Na2EDTA.2H204.36mg/L,CuSO4.5Η209.8 μ g/L, Na2MoO4.2Η206.3 μ g/L, ZnSO4.7Η2022 μ g/L, CoCl2.6Η2012 μ g/L,MnCl2.4Η200.18mg/L。
[0030]f/2+硅酸鈉培養(yǎng)基:培養(yǎng)新月藻使用的培養(yǎng)基。
[0031]最終濃度為:NaN0375mg/L，NaH2PO4.2H205mg/L, Na2Si0330
[0032]mg/L, VitaminB120.5 μ g/L, Biotin0.5 μ g/L, vitamin B10.lmg/L,FeCl3.6H203.16mg/L, Na2EDTA.2H204.36mg/L, CuSO4.5H209.8 μ g/L, Na2MoO4.2H206.3 μ g/L, ZnSO4.7H2022 μ g/L, CoCl2.6H2012 μ g/L, MnCl2.4H200.18mg/L。
[0033]SE培養(yǎng)基:培養(yǎng)多糖小球藻的培養(yǎng)基。
[0034]最終濃度為:NaN030.25g/L, K2HPO4.3Η200.075g/L, MgSO4.7Η200.075g/L,CaCl2.2H200.025g/L, KH2PO40.175g/L, NaCl0.025g/L, FeCl3.6H200.005g/L, Fe-EDTAImL,H3B032.86mg/L ；MnCl2.4H201.86mg/L ；ZnS04.7H200.22mg/L ；Na2Mo04 2H200.39mg/L ；CuSO4.5H200.08mg/L ；Co (NO3)2.6H200.05mg/L ;示蛋白胨=IgL0
[0035]TAP培養(yǎng)基:培養(yǎng)淡水衣藻的培養(yǎng)基。
[0036]最終濃度為:NH4C10.375g/L ；MgS04.7Η200.I g/L ；CaCl2.2H20
[0037]0.05g/L ；K2HPO40.108g/L ；KH2PO40.054g/L ；EDTA-Na20.2g/L ；ZnS04.7H200.22g/L ；H3B030.0 5 7g/L ；MnCl2.4H200.1012g/L ；CoCl2.6H200.0322g/L ；CuSO4.5H200.0314g/L ；(NH4)6Mo7O24.4H200.022g/L ；FeS04.7H200.998g/L ；Tris2.42g/L ;冰乙酸 lmL。
[0038]培養(yǎng)條件:七株藻的培養(yǎng)條件相同。
[0039]溫度(25± I) °C,光暗時間比14h:1Oh,日光燈作光源。初培養(yǎng)于3L錐形瓶中，光強為(50±5) ymol/m2/s，培養(yǎng)至指數(shù)期接種使用。培養(yǎng)均在600ml柱狀管式反應(yīng)器中完成(直徑5cm，長度42cm的玻璃管)，培養(yǎng)體積為500ml，光強(200± 10) μ mol/m2/s, 2%C02，通氣速率0.8vvm，接種初始密度200X 104cel 1/ml。
[0040]實施例1:
[0041]選用了亞心形四月藻(Tetraselmissubcordiformis)考察DMSO濃度對突光染料染色效果的影響。
[0042]通過測定OD值來監(jiān)測亞心形四月藻細胞生長狀況，待藻細胞生長到穩(wěn)定期后的第3天，測定OD值后，將OD稀釋至0.15 ;分別向96孔板中加入5 μ L稀釋后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ L DMSO水溶液，共300 μ L體系，室溫，避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。每個樣品有8個重復(fù)。
[0043]在不同的DMSO的體積分數(shù)條件下對藻細胞進行染色，讀取熒光強度，考察了 DMSO濃度為0.05%-40%時的熒光強度。
[0044]實施例2:
[0045]選用了新月藻(Nitzschia closterium)考察突光染料濃度對染色效果的影響。
[0046]通過測定OD值來監(jiān)測新月藻細胞生長狀況，待藻細胞生長到穩(wěn)定期后的第3天，測定OD值后，將OD稀釋至0.15 ;分別向96孔板中加入5 μ L稀釋后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ LDMSO水溶液，共300 μ L體系，室溫，避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。每個樣品有8個重復(fù)。
[0047]在不同的BODIPY最終質(zhì)量濃度條件下對藻細胞進行染色，讀取熒光強度，分別考察了 BODIPY濃度為0.05 μ g/ml-1.00 μ g/ml、時的熒光強度。[0048]實施例3:
[0049]選用了紫球藻(Porphyridium cruentum)考察染色溫度對染色效果的影響。
[0050]通過測定OD值來監(jiān)測紫球藻細胞生長狀況，待藻細胞生長到穩(wěn)定期后的第3天，測定OD值后，將OD稀釋至0.15 ;分別向96孔板中加入5 μ L稀釋后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ LDMSO水溶液，共300 μ L體系，室溫，避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。每個樣品有8個重復(fù)。
[0051]在不同的溫度下對藻細胞進行染色，讀取熒光強度，分別考察了溫度為250C _60°C時的熒光強度。
[0052]實施例4:
[0053]選用了湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)考察不同中性脂含量與突光強度的相關(guān)性。
[0054]通過測定OD值來監(jiān)測金藻細胞生長狀況，在整個培養(yǎng)過程中，每天測定OD值、熒光強度、干重和油脂含量。
[0055]將OD稀釋至0.15，加入BODIPY熒光染料，室溫，避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。
[0056]通過重量法對每天取的藻樣進行油脂含量的測定。具體方法如下:稱取IOOmg藻粉，加入2mL正己烷進行總脂的提取，提取三遍，合并三次的提取液，氮氣吹掃，待樣品溶劑揮發(fā)至小于0.5ml左右，將其烘干后稱重即可測得油脂占干重百分比。
[0057]根據(jù)熒光強度與對應(yīng)的油脂含量測定值制定標準曲線，并找出相關(guān)的區(qū)域。得到油脂含量與熒光強度的計算公式:
[0058]y=0.0037x-0.5521，R2=0.9832，線性相關(guān)的區(qū)域為油脂含量在10%_30%之內(nèi)的樣
品O
[0059]再測定相同培養(yǎng)條件的該藻種的熒光值，上述相同條件下測得金藻熒光值為3439.528，即可直接通過上述公式計算獲得油脂含量的數(shù)值為11.9%，進而再對此份金藻的藻粉通過重量法進行油脂含量的測定，測定值為11.8%，故此公式可用于通過測定熒光值而得到油脂含量。
[0060]實施例5:
[0061]選用了淡水衣藻(Chlamyclomonas reinhartii)驗證不同油脂含量與突光強度的計算公式的適用性。
[0062]將藻液OD稀釋至0.15，加入BODIPY熒光染料，室溫，避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。
[0063]根據(jù)測得的熒光強度4590.559，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521 計算油脂含量為 16.4%。
[0064]通過重量法測得的此份淡水衣藻的油脂的含量為15.6%
[0065]實施例6:
[0066]本實施例與實施例5不同的是:所用的實驗藻種為多糖小球藻(Chlorellasacchrarophila)，所述的DMSO水溶液的濃度為0.5%，其他步驟和參數(shù)與具體實施例5相同。
[0067]根據(jù)測得的熒光強度2064.978，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521計算油脂含量為7.1%。
[0068]通過重量法測得的此份淡水衣藻的油脂的含量為8.3%
[0069]實施例7:
[0070]本實施例與實施例6不同的是:所述的DMSO水溶液的濃度為20%，其他步驟和參數(shù)與具體實施例6相同。
[0071]根據(jù)測得的熒光強度2628.335，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521計算油脂含量為9.2%。
[0072]通過重量法測得的此份淡水衣藻的油脂的含量為10.6%
[0073]實施例8:
[0074]本實施例與實施例5不同的是:所用的實驗藻種為巴夫藻(Pavlova viridis),所述的BODIPY熒光染料的濃度為0.05 μ g/ml，其他步驟和參數(shù)與具體實施例5相同。
[0075]將藻液OD稀釋至0.15,加入,室溫,避光染色lOmin。選擇470nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515nm的熒光強度。
[0076]根據(jù)測得的熒光強度9193.625，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521 計算油脂含量 33.5%。
[0077]通過重量法測得的此份淡水衣藻的油脂的含量為35.1%
[0078]實施例9:
[0079]本實施例與實施例8不同的是=BODIPY濃度為0.5 μ g/ml，其他步驟和參數(shù)與具體實施例8相同。
[0080]根據(jù)測得的熒光強度8777.388，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521 計算油脂含量 31.9%。
[0081]通過重量法測得的此份淡水衣藻的油脂的含量為34.4%
[0082]實施例10:
[0083]本實施例與實施例5不同的是:所用的實驗藻種為紫球藻(Porphyridiumcruentum),所述的染色溫度為25°C,其他步驟和參數(shù)與具體實施例5相同。
[0084]根據(jù)測得的熒光強度1544.769，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521 計算油脂含量 5.2%。
[0085]通過重量法測得的此份紫球藻的油脂的含量為8.0%
[0086]實施例11:
[0087]本實施例與實施例10不同的是:所述的染色溫度為40°C，其他步驟和參數(shù)與具體實施例10相同。
[0088]根據(jù)測得的熒光強度1915.002，通過之前得到的油脂含量與熒光強度的計算公式y(tǒng)=0.0037x-0.5521 計算油脂含量 6.5%。
[0089]通過重量法測得的此份紫球藻的油脂的含量為8.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種使用BODIPY類熒光染料測定微藻油脂含量的方法，其特征在于:使用BODIPY類熒光染料在熒光分光光度計中對待篩的藻種的油脂含量進行檢測，快速篩選出油脂含量高的微藻。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:使用BODIPY類熒光染料對藻類油脂進行染色，使用熒光分光光度計進行微藻油脂含量的測定。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 將待測藻液通過稀釋或離心濃縮，調(diào)整OD值至0.15左右，與終濃度為0.05 yg/ml-1 μ g/ml的BODIPY熒光染料和終濃度為0%_40%的DMSO混合后，避光染色5_15min，在熒光分光光度計上，選擇400-600nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長450-700nm之間的熒光強度，熒光強度與藻細胞中油脂含量呈正相關(guān)，并得到油脂含量與熒光強度的計算公式為:y=0.0037χ-0.5521。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY類熒光染料的濃度0.05 μ g/ml-1μ g/ml。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY類熒光染料的溶劑為體積分數(shù)為0.05%-40%DMS0水溶液。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY類熒光染料對藻類油脂的染色溫度為25-60°C。
7.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述藻為綠藻門、紅藻門、金藻門、黃藻門、褐藻門、隱藻門、硅藻門、或甲藻門等單細胞藻類中的一種或二種以上。
【文檔編號】G01N21/64GK103808697SQ201210442558
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月8日
【發(fā)明者】薛松, 劉亞男, 曹旭鵬 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所