專利名稱：一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在國(guó)際上，食用菌多糖被稱作“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”。大量研究已表明，食用菌多糖具有免疫調(diào)劑活性，可提高免疫力。同時(shí)，食用菌多糖具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂等多重功效。目前，越來(lái)越多的注意力集中到食用菌多糖的免疫功效。多糖在醫(yī)藥及食品保健領(lǐng)域迅速發(fā)展，具有很好的開(kāi)發(fā)前景。
不同多糖的生物活性有所差別，活性高低受多糖的結(jié)構(gòu)、分子量等多種因素影響，因此，多糖類藥品及保健品的功效存在很大差異檢測(cè)食用菌多糖生物活性是判斷多糖藥品及保健品功效的方法之一。目前，有關(guān)多糖生物活性的檢測(cè)手段主要是整體水平和原代細(xì)水平檢測(cè)。傳統(tǒng)的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多糖活性方法存在動(dòng)物個(gè)體差異、工作量大、資金消耗多等不足，同時(shí)涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問(wèn)題；原代細(xì)胞檢測(cè)多糖生物活性亦存在細(xì)胞穩(wěn)定性等問(wèn)題。核酸類藥物也可作為免疫增強(qiáng)劑、抗病毒抗腫瘤劑，可用于抗腫瘤、抗腫瘤的輔助治療。目前，核酸類藥物的檢測(cè)方法主要是DNA含量的測(cè)定、RNA含量的測(cè)定及核甘酸、核苷含量的測(cè)定?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法僅對(duì)核酸含量高低作出評(píng)價(jià)，但不適用于藥物的有效性測(cè)定。因此，一種快速有效地檢測(cè)多糖、核酸生物活性方法的建立勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法的技術(shù)方案。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于包括以下工藝步驟
1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液；
2)取THP-I細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IO5 IO6個(gè)/ml；
3)取步驟2)得到的細(xì)胞液，加入步驟I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達(dá)到10 μ g 20mg/ml，然后進(jìn)行培養(yǎng)；
4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細(xì)胞上清液；
5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測(cè)IFN-α濃度，IFN-α濃度高低說(shuō)明被檢測(cè)多糖或核酸樣品的生物活性高低。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟I)中用蒸餾水或RPMI1640培養(yǎng)基配制多糖或核酸溶液。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟2)中用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整THP-I細(xì)胞密度。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟2)中調(diào)整細(xì)胞密度的THP-I細(xì)胞置于37°C下進(jìn)行培養(yǎng)24 36h。所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟3)中加入多糖或核酸溶液后的細(xì)胞液 置于37°C、C02濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h。本發(fā)明中RPMI1640培養(yǎng)基為現(xiàn)有培養(yǎng)基，THP-I細(xì)胞為現(xiàn)有細(xì)胞，均在市場(chǎng)上購(gòu)得。已有研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗病毒、抗腫瘤等活性，但其提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力并非直接作用于腫瘤細(xì)胞和病原微生物，而是通過(guò)刺激、激活免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子發(fā)揮作用。IFN-α是由活性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，就有抗病毒、抗腫瘤活性，參與免疫調(diào)節(jié)。因此，IFN-α濃度的高低可作為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力的一種評(píng)價(jià)指標(biāo)。本發(fā)明采用穩(wěn)定的單核細(xì)胞株THP-I細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子INF-α濃度評(píng)價(jià)多糖及核酸生物活性，降低了檢測(cè)難度、提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。本發(fā)明的有益效果是實(shí)現(xiàn)了高通量有效檢測(cè)多糖、核酸生物活性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)潔，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且本發(fā)明為定量測(cè)定多糖或核酸生物活性提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明主要針對(duì)多糖及核酸進(jìn)行生物活性檢測(cè)，同時(shí)適用于其他免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的活性檢測(cè)。


圖I為灰樹(shù)花多糖生物活性檢測(cè) 圖2為香菇多糖生物活性檢測(cè) 圖3為蟲(chóng)草多糖生物活性檢測(cè) 圖4核糖核酸II生物活性檢測(cè)圖。圖中*表示 ρ〈0· 05, *** 表示 ρ〈0· 01。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例I :灰樹(shù)花多糖活性檢測(cè)
取灰樹(shù)花多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基或蒸餾水配制5mg/ml的灰樹(shù)花多糖溶
液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細(xì)胞密度調(diào)整至IO5 IO6個(gè)/ml ；
將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h或36h ；
培養(yǎng)碟中加入適量5mg/ml灰樹(shù)花多糖，至灰樹(shù)花多糖終濃度分別為0mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)36或48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細(xì)胞上清；
用ELASA法檢測(cè)IFN-α濃度，即用人IFN-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)IFN-α濃度(人IFN-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒為現(xiàn)有產(chǎn)品)
標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本分別取ΙΟΟμΙ加入到酶標(biāo)板孔中，做好標(biāo)記；分別向孔中加50μ1酶聯(lián)親和物，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
酶標(biāo)板覆膜于37°C孵育反應(yīng)60min，充分棄盡孔內(nèi)液體并扣干孔內(nèi)剩余殘液，用預(yù)先稀釋好的清洗液反復(fù)沖洗5次，并扣干孔內(nèi)剩余液體；
每孔依照次序分別加入底物I和II各50μ1，充分混勻。室溫下避光反應(yīng)15min ； 反應(yīng)后每孔加終止液5θμ ,充分混勻，終止反應(yīng)；
30min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm下讀取OD值。已有研究表明灰樹(shù)花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖I所示結(jié)果與已有研究成果基本一致，說(shuō)明灰樹(shù)花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可以驗(yàn)證此檢測(cè)方法的有效性。
實(shí)施例2 :香菇多糖活性檢測(cè)
取香菇多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基配制5mg/ml的香菇多糖溶液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-IO6個(gè)/ml ；
將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h ；
培養(yǎng)碟中加入適量5mg/ml香菇多糖，至香菇多糖終濃度分別為(^g/ml、50(^g/ml、lmg/ml、2mg/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24或36h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細(xì)胞上清；
ELISA法檢測(cè)IFN-α濃度方法同實(shí)施例I。已有大量研究表明香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖2所示結(jié)果與已有的動(dòng)物及原代細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果基本一致，因此可以驗(yàn)證此檢測(cè)方法的有效性。實(shí)施例3 :冬蟲(chóng)夏草多糖活性檢測(cè)。用RPMI1640培養(yǎng)基配制lmg/ml的冬蟲(chóng)夏草多糖溶液；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-IO6個(gè)/ml ；
將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)36h ；
培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml冬蟲(chóng)夏草多糖，至冬蟲(chóng)夏草多糖終濃度分別為OPg/ml、10M-g/ml> 100M-g/ml>200M-g/ml ；
37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細(xì)胞上清；
ELISA法檢測(cè)IFN-α濃度方法同實(shí)施例I。已有研究表明蟲(chóng)草多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖3所示結(jié)果與已有研究結(jié)果基本一致，因此可以驗(yàn)證此檢測(cè)方法的有效性。實(shí)施例4 核糖核酸II生物活性檢測(cè)
用RPMI1640培養(yǎng)基將核糖核酸II分別稀釋10倍、100倍，配制不同濃度的核糖核酸
II ；
用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-I細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-IO6個(gè)/ml ；
將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)24h ；
培養(yǎng)碟中分別加入等量不同濃度的核糖核酸II ；
37 0C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；
以IOOOg離心力離心20min收集細(xì)胞上清；
ELISA法檢測(cè)IFN-α濃度方法同實(shí)施例I。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖4表明此方法對(duì)核酸免疫活性檢測(cè)亦有效。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明也能夠檢測(cè)出除上述實(shí)驗(yàn)例之后的其它多糖和核酸的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于包括以下工藝步驟 1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液； 2)取THP-I細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IO5 IO6個(gè)/ml； 3)取步驟2)得到的細(xì)胞液，加入步驟I)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達(dá)到10 μ g 20mg/ml，然后進(jìn)行培養(yǎng)； 4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細(xì)胞上清液； 5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測(cè)IFN-α濃度，IFN-α濃度高低說(shuō)明被檢測(cè)多糖或核酸樣品的生物活性高低。
2.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟I)中用蒸餾水或RPMI1640培養(yǎng)基配制多糖或核酸溶液。
3.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟2)中用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整THP-I細(xì)胞密度。
4.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟2)中調(diào)整細(xì)胞密度的THP-I細(xì)胞置于37°C下進(jìn)行培養(yǎng)24 36h。
5.如權(quán)利要求I所述的一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟3)中加入多糖或核酸溶液后的細(xì)胞液置于37°C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h。
全文摘要
一種免疫調(diào)節(jié)多糖及核酸生物活性檢測(cè)方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。其包括以下工藝步驟1)取多糖或核酸樣品，配制成多糖或核酸溶液；2)取THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至105～106個(gè)/ml；3)取步驟2)得到的細(xì)胞液，加入步驟1)的多糖或核酸溶液并使多糖或核酸終濃度達(dá)到10μg～20mg/ml，然后進(jìn)行培養(yǎng)；4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細(xì)胞上清液；5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測(cè)IFN-α濃度。本發(fā)明的有益效果是實(shí)現(xiàn)了高通量有效檢測(cè)多糖、核酸生物活性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)潔，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且本發(fā)明為定量測(cè)定多糖或核酸生物活性提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102901831SQ20121041217
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者呂正兵, 張曉菲, 舒建洪, 盛清, 陳健, 錢(qián)晨云 申請(qǐng)人:杭州寶康億富生物科技有限公司